基于囊性纖維化疾病分子特征及其作用機(jī)制的生物信息學(xué)分析

王小燕,張秋月，胡雨潔，莫之婧

（1.桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣西 桂林 541199；2.桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西 桂林 541199）

囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是白色人種最常見的常染色體隱性遺傳疾病之一，主要特征為胰腺功能不全和肺功能漸進(jìn)性惡化，涉及肺、胰腺、汗腺、消化和生殖系統(tǒng)及其他組織，CF主要由編碼囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）的基因突變引起［1］。歐洲約存在48 000例CF患者，美國約有30 000例CF患者，英國無癥狀CFTR基因突變的攜帶者比例約為25∶1，美國約為29∶1［2］。

目前，已有研究［3-6］通過候選基因分析、全基因組關(guān)聯(lián)研究或直接基因測(cè)序來鑒定修飾基因，揭示CFTR基因突變與調(diào)節(jié)液體、電解質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和炎癥相關(guān)基因表達(dá)之間的聯(lián)系，同時(shí)CFTR在轉(zhuǎn)錄和功能框架中發(fā)揮作用。關(guān)于CF的分子特征及其作用機(jī)制的研究尚未見相關(guān)報(bào)道，限制了預(yù)測(cè)單個(gè)患者臨床病程和治療反應(yīng)的能力。目前CF患者的治療均基于控制疾病臨床癥狀和并發(fā)癥，而非治療疾病。因此，闡明CF分子特征及其作用機(jī)制并識(shí)別可靠的生物標(biāo)志物對(duì)CF的防治至關(guān)重要。

微陣列技術(shù)和生物信息學(xué)分析已被廣泛用于篩選疾病相關(guān)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）和功能通路。然而，單一的微陣列分析數(shù)據(jù)存在假陽性率，難以獲得可靠的結(jié)果。因此本研究通過對(duì)基因表達(dá)匯編（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中CF基因芯片聯(lián)合分析，以期篩選出高可信度DEGs并分析其發(fā)揮關(guān)鍵作用的hub基因和生物通路，為CF疾病預(yù)測(cè)和治療提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 CF基因芯片數(shù)據(jù)來源使用GEO數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“cystic fibrosis”為 檢 索 詞 檢 索。篩 選 條 件：①mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集；②以CF為樣本；③以正常樣本為對(duì)照。選擇基于GPL570平臺(tái)檢測(cè)的GSE71799、GSE24206、GSE98925和GSE69764高通量芯片數(shù)據(jù)集，采用GEOquery包（2.54.1版本）下載［7］。由GSE71799、GSE24206和GSE98925數(shù)據(jù)集中獲取186個(gè)CF樣本和37個(gè)正常對(duì)照樣本，由GSE69764數(shù)據(jù)集中獲取3個(gè)DNA甲基化抑制劑處理CF樣本和3個(gè)未經(jīng)處理的CF樣本。將樣本數(shù)據(jù)分為CF組和對(duì)照組，根據(jù)平臺(tái)注釋信息，將探針轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因符號(hào)。

1.2 DEGs提取和分析樣本中篩除對(duì)應(yīng)多個(gè)分子的探針，且僅保留信號(hào)值最大的探針，篩除后的數(shù)據(jù)使用R軟件sva包ComBat函數(shù)去除批間差，即不同的數(shù)據(jù)集，使用R軟件主成分分析（principal component analysis，PCA）和降維分析（uniform manifold approximation and projection，UMAP）查看樣本分組間聚類情況。篩除后的分子總數(shù)為21 655個(gè)。使用R軟件limma包［8］進(jìn)行2組DEGs分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05且|log2（FC）|＞1，以log2（FC）＞1為CF組 中 顯 著 高 表 達(dá) 基 因，log2（FC）＜－1為對(duì)照組中顯著高表達(dá)基因。采用R軟件進(jìn)行結(jié)果可視化，采用R軟件ComplexHeatmap包［9］選擇聚類方法為歐式距離，繪制2組各前20個(gè)DEGs基因表達(dá)情況熱圖。

1.3 功能富集分析使用R軟件ClusteProfiler包［10］對(duì) 以2組|logFC|＞1.5和P＜0.05為 閾 值 的DEGs進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）功能注釋分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，獲得DEGs的分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological process，BP）和細(xì)胞成分（cellular component，CC）等注釋分析和通路富集分析。使用R軟件ClusteProfiler包［10］以分子簽名數(shù)據(jù)庫（Molecular Signatures Database，MSigDB）下載C2.cp.v7.0.symbols.gmt作為基因集 富 集 分 析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）目標(biāo)集合，獲得DEGs顯著富集的基因集。計(jì)算錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）。每個(gè)分析將基因集排列重復(fù)1 000次計(jì)算富集得分（enrichment score，ES）。

1.4DEGs蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和hub基因的篩選使用STRING數(shù) 據(jù) 庫（http：//string-db.org）［11］構(gòu) 建DEGs PPI網(wǎng)絡(luò)。交互得分閾值0.4作為臨界標(biāo)準(zhǔn)。采用Cytoscape軟件［12］對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，使用MCODE插件［13］篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中hub基因。篩選標(biāo)準(zhǔn)：MCODE評(píng)分＞5，度分界=2，節(jié)點(diǎn)分界=0.2，最大深度=100，k評(píng)分=2。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R軟件（3.6.3版本）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組樣本中mRNA表達(dá)水平呈正態(tài)分布。采用limma包進(jìn)行2組DEGs分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用ClusteProfiler包對(duì)以|logFC|＞1.5和P＜0.05為 閾 值 的DEGs進(jìn) 行GO-KEGG通路分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用ClusteProfiler包對(duì)DEGs進(jìn)行GSEA，以P＜0.05和FDR＜0.25為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組樣本中DEGs鑒定PCA和UMAP結(jié) 果均顯示2組樣本明顯分開并聚為2類，2組間差異明顯，后續(xù)差異分析有意義的結(jié)果可能較多。2組基因表達(dá)譜中mRNA表達(dá)差異分析結(jié)果顯示：CF組樣本中高表達(dá)DEGs 105個(gè)，對(duì)照組樣本中高表達(dá)DEGs 324個(gè)。DNA甲基化抑制劑未處理CF樣本中CXCL2、CXCL3和BEX2為高表達(dá)DEGs，其中CXCL2和CXCL3也為對(duì)照組樣本中高表達(dá)DEGs。見圖1。

圖1 2組樣本中DEGs表達(dá)情況Fig.1 Expressions of DEGs in samples in two groups

2.2 DEGs富集分析GO-KEGG功能富集分析結(jié)果顯示：與BP關(guān)聯(lián)顯著富集通路共724條，其中前3條分別為中性粒細(xì)胞活化（GO：0042119）、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫（GO：0002446）和嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒（GO：0043312）；與CC關(guān)聯(lián)顯著富集通路共53條，其中前3條分別為胞質(zhì)囊腔（GO：0060205）、囊腔（GO：0031983）和分泌顆粒內(nèi)腔（GO：0034774）；與MF關(guān)聯(lián)顯著富集通路共36條，其中前3條分別為抗氧化活性（GO：0016209）、趨化因子的活動(dòng)（GO：0008009）和趨化因子受體結(jié)合（GO：0042379）。KEGG生物通路顯著富集通路共36條，其中前3條分別為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（hsa05323）、白細(xì)胞介素17（intenleukin-17，IL-17）信號(hào)通路（hsa04657）和礦物質(zhì)的吸收（hsa04978）。見圖2A。

GSEA分析結(jié)果顯示：DEGs在信號(hào)通路翻譯相關(guān)基因集顯著富集，其基因主要有PPA1、RPS4Y1和MRPS21等；在核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）處理相關(guān)基因集顯著富集，其基因主要有NHP2、RPS4Y1和RPS27L等；在線粒體翻譯相關(guān)基因集顯著富集，其基因主要有MRPS21、MRPL3和MRPS33等；在真核生物翻譯延伸相關(guān)基因集顯著富集，其基因主要有RPS4Y1、RPS27L和RPS5等；在真核生物翻譯啟動(dòng)相關(guān)基因集顯著富集，其基因主要有RPS4Y1、EIF3F和RPS27L等。見圖2B和表1。

圖2 DEGs的GO-KEGG和GSEA富 集分 析Fig.2 GO-KEGG and GSEA enrichment analysis of DEGs

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和hub基因篩選DEGs相互關(guān)聯(lián)形成復(fù)雜的PPI網(wǎng)絡(luò)，其中最重要的模塊包括35個(gè)hub基因，分別為基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制 劑1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）、血小板反應(yīng)蛋白1（thrombospondin 1，THBS1）、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族A成員1（serpin family A member 1，SERPINA1）、前血小板堿性蛋白（pro-platelet basic protein，PPBP）、C-X-C基 序 趨 化 因 子 配 體2（C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2）、C-X-C基序趨化因子 配 體3（C-X-C motif chemokine ligand 3，CXCL3）、組織蛋白酶H（cathepsin H，CTSH）、溶菌酶（lysozyme，LYZ）和細(xì)胞質(zhì)FMR1相互作用蛋白1（cytoplasmic FMR1 interacting protein 1，CYFIP1）等。見圖3。

圖3 DEGs的PPI網(wǎng) 絡(luò) 和hub基因Fig.3 PPI network and hub genes of DEGs

3 討 論

本研究從4個(gè)高通量芯片數(shù)據(jù)集中收集并分析CF樣本和對(duì)照樣本，篩選出429個(gè)DEGs，35個(gè)hub基因和多條生物通路。DEGs主要富集于與中性粒細(xì)胞相關(guān)的BP，而中性粒細(xì)胞通常被認(rèn)為是抵御感染的第一道防線，其為人類血液中最豐富的循環(huán)白細(xì)胞，占白細(xì)胞總數(shù)約60%，但在CF患者肺毛細(xì)血管中存在的中性粒細(xì)胞數(shù)量增加［14-15］。中性粒細(xì)胞是免疫系統(tǒng)武器庫中關(guān)鍵的炎性細(xì)胞，與細(xì)胞因子、趨化因子、白細(xì)胞介素受體、集落刺激因子和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子產(chǎn)生相關(guān)的約90個(gè)基因失調(diào)誘導(dǎo)CF患者炎癥的發(fā)生［16］。有研究［17］顯示：功能失調(diào)的CFTR由于吞噬溶酶體中次氯酸產(chǎn)生缺陷而損害中性粒細(xì)胞殺死病原體的能力。CF患者使用Ivacaftor治療會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞遷移和激活減少并促進(jìn)細(xì)菌清除［18］。在與廣泛的病原體、促炎癥細(xì)胞因子或其他炎癥信號(hào)相互作用后，中性粒細(xì)胞被激活并向信息部位移動(dòng)，通過吞噬作用動(dòng)員清除入侵的生物體，釋放中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）、細(xì)胞因子和趨化因子［19-21］。提示DEGs可能通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞細(xì)胞免疫影響CF發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示：DEGs于IL-17信號(hào)通路中顯著富集。研究［22-23］顯示：IL-17協(xié)調(diào)細(xì)胞和有機(jī)體的代謝，一方面，IL-17是宿主防御細(xì)胞因子，在對(duì)真菌和其他細(xì)胞外病原體的免疫中發(fā)揮重要作用；另一方面，IL-17能驅(qū)動(dòng)多種自身免疫性病理中的炎癥。在介導(dǎo)感染免疫過程中，IL-17僅瞬時(shí)表達(dá)，但在一些慢性炎癥和自身免疫性疾病中，IL-17持續(xù)長期表達(dá)，其影響代謝綜合征的能力可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重后果［23］。細(xì)胞水平上，IL-17介導(dǎo)的代謝調(diào)節(jié)促進(jìn)細(xì)胞增殖，通過上皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和干細(xì)胞，協(xié)調(diào)組織修復(fù)和傷口愈合［24-26］。某些細(xì)胞代謝物（如他康酸鹽）會(huì)影響IL-17信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［27］。因此，推測(cè)CF發(fā)病機(jī)制與IL-17信號(hào)通路密切相關(guān)，該信號(hào)通路上的基因可能是CF的關(guān)鍵基因。

GSEA分析結(jié)果顯示：DEGs主要在翻譯的啟動(dòng)、延伸和信號(hào)通路翻譯等基因集中富集。研究［28］顯示：NHP2的功能缺陷影響rRNA的生物發(fā)生，并導(dǎo)致肺纖維化。RPS4Y1與慢性阻塞性肺疾病相關(guān)［29］。PPA1作為一種新的PPARγ靶基因，通過維持脂肪細(xì)胞線粒體功能調(diào)節(jié)全身胰島素敏感性［30］。MRPS21與胰島自身免疫進(jìn)展為Ⅰ型糖尿病相關(guān)［31］。本研究結(jié)果顯示：與肺和胰腺功能相關(guān)基因均為CF關(guān)鍵通路的基因，而CF以胰腺功能不全和肺功能漸進(jìn)性惡化為特征，提示相關(guān)基因可能在CF中發(fā)揮著重要的作用，可能是CF潛在生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示：RPS27L、MRPL3、MRPS33、RPS5和EIF3F等 基 因 與CF有關(guān)，為探討CF的分子機(jī)制提供了新的思路。但DEGs與CF的發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究篩選出35個(gè)hub基因，可能為CF發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因。研究［32］顯示：與非CF單核細(xì)胞比較，CF患者單核細(xì)胞中MMP9表達(dá)水平升高。MMP9可以提高膠原蛋白脯氨酸-甘氨酸-脯 氨 酸（proline glycine proline，PGP）的 水 平，CF患兒肺部PGP水平升高可能加劇炎癥反應(yīng)［33］。而其他34個(gè)hub基因在CF中的作用尚未闡明，本研究結(jié)果為CF分子機(jī)制相關(guān)研究提供了方向。未使用DNA甲基化抑制劑處理的CF樣本中高表達(dá)CXCL2和CXCL3，其在正常對(duì)照樣本中亦高表達(dá)，且均包含于35個(gè)hub基因中。研究［34］顯示：遺傳和表觀遺傳學(xué)的改變?cè)诶w維化疾病中發(fā)揮作用，如DNA甲基化可以改善小鼠肺纖維化，提示DNA甲基化可能是CF治療的重要方向，CXCL2和CXCL3可能與CF發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，有望成為CF的生物標(biāo)志物。

綜上所述，本研究揭示了CF相關(guān)DEGs、hub基因和生物通路，為探討CF分子機(jī)制提供了新的研究方向和思路，為闡明hub基因的生物學(xué)功能和CF的標(biāo)志物治療提供了理論依據(jù)。