神經(jīng)肽PACAP27抑制線粒體依賴性細胞凋亡途徑對環(huán)磷酰胺所致大鼠睪丸損傷的改善作用

廖 源,王開舉,李浩僡,陳惠萍,李選逸,黃 勇

（海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院生殖科，海南 ?？?570311）

不育不孕作為嚴重的社會問題，其中約50%以上是由男性不育引起，男性不育癥的發(fā)病率逐年增加，該現(xiàn)象與環(huán)境污染和食品污染等多種問題有緊密關(guān)聯(lián)［1-2］。男性不育的病因十分復雜，其臨床上僅表現(xiàn)為精液中精子數(shù)目和質(zhì)量下降，且精液存在異常［3］。環(huán)磷酰胺作為細胞毒性烷化劑，被臨床上廣泛用作抗癌劑和免疫抑制劑，除急性不良反應外，環(huán)磷酰胺還可對男性患者造成長期或永久性睪丸損傷，致使精子發(fā)生異常而不育［4］。目前，環(huán)磷酰胺引起睪丸損傷的機制尚未完全闡明，因而仍無有效的防治措施。

垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP）是一種具有多種生物活性的神經(jīng)肽，最初由綿羊下丘腦提取物中分離獲得，能夠刺激垂體細胞中腺苷酸環(huán)化酶活性，增加環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的 形 成。PACAP38和PACAP27是PACAP的2種主要存在形式，其中PACAP27與多種生物學功能相關(guān)，可以參與細胞增殖、凋亡、氧化反應、胰島素釋放、神經(jīng)遞質(zhì)釋放 和 炎 癥 反 應 等［5-8］。研 究［9］表 明：PACAP27干預能夠緩解糖尿病誘導大鼠睪丸組織細胞凋亡、血管損傷和氧化應激，并發(fā)揮保護作用。因此，本研究采用環(huán)磷酰胺建立動物睪丸損傷模型，探究PACAP27對環(huán)磷酰胺所致大鼠睪丸損傷的保護作用，并闡明其可能機制，為臨床治療和改善男性不育提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器健康清潔級雄性SD大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量（230±10）g，購自海南藥物研究所有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（瓊）2020-0007，動物使用許可證號：SYXK（瓊）2017-0013。環(huán)境溫度（22±2）℃，濕度40%～60%，光照/黑暗各12 h循環(huán)，自由進食和飲水。環(huán)磷酰胺（上海華聯(lián)制藥有限公司），左卡尼?。ǔＶ萏m陵制藥有限公司），PACAP27（美 國Simga公 司），促 卵 泡 激 素 （folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃 體 生 成 素（luteinizing hormone，LH）和睪酮（testosterone，T）放射免疫試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導的原位缺口末端標記（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒和線粒體分離純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司），線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）檢測試劑盒和JC-1熒光探針染色試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白測定試劑盒和電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液（上海碧云天生物研究所），兔抗人細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）、B細 胞 淋 巴 瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9，caspase-9）（英國Abcam公司），兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物科技公司）。高速冷凍離心機購自美國Beckman Coulter公司，光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司，全波長酶標儀購自美國MD公司，電泳檢測系統(tǒng)購自美國BioRad公司。

1.2 動物分組和處理60只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、PACAP27組和左卡尼汀組，每組15只。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水；模型組大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺（20 mg·kg－1）；PACAP27組大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺（20 mg·kg－1），1 h后注射100 μL PACAP27（1 μmol·L－1）；左卡尼汀組大鼠注射環(huán)磷酰胺（20 mg·kg－1），1 h后注射左卡尼汀（100 mg·kg－1）。每日給藥1次，連續(xù)5 d。給藥后第3天，各組大鼠禁食過夜，10%水合氯醛麻醉，稱體質(zhì)量并采集血液，剖開腹腔，取睪丸稱質(zhì)量，計算睪丸指數(shù)。睪丸指數(shù)=大鼠雙側(cè)睪丸質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）。左側(cè)睪丸置于4%多聚甲醛溶液中固定，右側(cè)睪丸置于液氮迅速冷凍后保存于－10℃冰箱。

1.3 放射免疫法檢測各組大鼠血清中FSH、LH和T水平各組大鼠采集血液后室溫靜置2 h，置于離心機4 000 r·min－1離心15 min，分離血清，按試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中FSH、LH和T水平。

1.4 HE染色觀察各組大鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)取出保存于4%多聚甲醛溶液中固定的睪丸組織，切為0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm組織塊，常規(guī)石蠟包埋，切為厚度約5 μm石蠟組織切片，切片脫蠟脫水處理后，HE染色，經(jīng)乙醇脫水和二甲苯透明后，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察各組大鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)并拍照。

1.5酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測各組大鼠睪丸組織中SOD和CAT活性及MDA水平取凍存睪丸組織置于玻璃勻漿器中切碎、洗滌，加入預冷氯化鈉溶液，冰上研磨組織，收集勻漿液，4℃、12 000 r·min－1離心5 min，取上清液檢測SOD和CAT活性及MDA水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 TUNEL染色檢測各組大鼠睪丸組織細胞凋亡率取制備的睪丸組織石蠟切片，置于58℃烘箱烤片2 h，滴加0.1% TritonⅩ-100、0.1%檸檬酸鈉溶液，室溫下通透處理，PBS緩沖液沖洗切片3次，每 次3 min，加 入50 μL TUNEL檢 測 液，37℃孵育1 h，再加入過氧化物酶轉(zhuǎn)化劑，繼續(xù)孵育30 min，PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3 min，滴加DAPI染液，室溫避光孵育10 min，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并捕獲圖像，隨機選擇6個視野計數(shù)TUNEL染色陽性細胞和總細胞數(shù)，計算TUNEL染色陽性細胞百分率，即細胞凋亡率。TUNEL染色陽性細胞百分率=TUNEL染色陽性細胞數(shù)/視野下總細胞數(shù)×100%。

1.7 Western blotting法檢測各組大鼠睪丸組織中線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達水平使用RIPA裂解液裂解剪碎的睪丸組織，提取蛋白，BCA法測定總蛋白含量。制備10% SDS-PAGE分離膠，取各樣品等量蛋白上樣，120 V、90 min電泳分離蛋白，將分離后的蛋白切膠電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h，將膜與一抗4℃孵育過夜，次日，TBST洗膜3次，每次3 min，加入對應二抗，室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次3 min，加入ECL發(fā)光液可視化蛋白條帶，采用Image ProPlus 5.0圖像分析軟件分析各蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.8 線粒體分離試劑檢測各組大鼠睪丸組織mPTP開放程度取睪丸組織剪碎，按照線粒體分離試劑盒方法提取組織線粒體，BCA法定量，調(diào)整濃度為1.5 g·L－1。取100 μL各組線粒體樣品加入至96孔細胞培養(yǎng)板中，并加入37℃緩沖液，混勻，酶標儀測定540 nm波長處吸光度（A）值，室溫靜置1 min，加入10 μL誘導液，混勻，10 min后測定A值（A10min），計算A值降低程度，代表mPTP。ΔA（540 nm）=（A0min－A10min）/A0min。

1.9 JC-1熒光探針染色檢測各組大鼠睪丸組織線粒體膜電位水平取50 μL熒光染料JC-1，加入8 mL超純水稀釋，混勻后加入2 mL JC-1染色緩沖液，配制JC-1工作液。采用JC-1染色緩沖液對JC-1工作液按5倍稀釋，取0.9 mL稀釋JC-1工作液，加入0.1 mL純化線粒體，室溫下避光孵育10 min，熒光顯微鏡觀察綠色熒光和紅色熒光表達，熒光酶標儀檢測JC-1聚合體值（激發(fā)波和發(fā)射波波長分別為525 nm和590 nm）和JC-1單體值（激發(fā)波和發(fā)射波波長分別為490 nm和530 nm），計算線粒體膜電位水平。線粒體膜電位=JC-1聚合體值/JC-1單體值。

1.10 統(tǒng)計學分析采用SPASS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，采用Graphpad 8.3.0軟件繪制統(tǒng)計圖。各組大鼠體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量和睪丸指數(shù)，血清中FSH、LH和T水平，睪丸組織中SOD、CAT活性和MDA水平，細胞凋亡率，睪丸組織中Cyt C、Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平，mPTP開放程度和線粒體膜電位水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量和睪丸指數(shù)實驗前各組大鼠體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗后，與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量和睪丸指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，PACAP27組和左卡尼汀組大鼠睪丸質(zhì)量和睪丸指數(shù)明顯升高（P＜0.05），3組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量（A）、睪丸質(zhì)量（B）和睪丸指數(shù)（C）Fig.1 Body weights（A）,testis weights（B）and testis indexes（C）of rats in various groups

2.2 各組大鼠血清和睪丸組織中生化指標各組大鼠血清中FSH、LH和T水平檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠血清中FSH、LH和T水平 明 顯 降 低 （P＜0.05）；與 模 型 組 比 較，PACAP27組和左卡尼汀組大鼠血清中FSH、LH和T水平均明顯升高（P＜0.05）。見表1。

各組大鼠睪丸組織中SOD、CAT活性和MDA水平檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠睪丸組織中SOD和CAT活性明顯降低（P＜0.05），MDA水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，PACAP27組和左卡尼汀組大鼠睪丸組織中SOD和CAT活性明顯升高（P＜0.05），MDA水平明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清中FSH、LH和T水平及睪丸組織中SOD、CAT活性和MDA水平Tab.1 Levels of serum FSH,LH and T and activities of SOD,CAT and MDA levels in testis tissue of rats in various groups（n=6,±s）

表1 各組大鼠血清中FSH、LH和T水平及睪丸組織中SOD、CAT活性和MDA水平Tab.1 Levels of serum FSH,LH and T and activities of SOD,CAT and MDA levels in testis tissue of rats in various groups（n=6,±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group Control Model PACAP27 L-carnitine FSH[λB/（U·L－1）]31.89±2.99 20.57±2.01*27.93±2.68△28.55±2.75△LH[λB/（U·L－1）]65.40±6.34 52.42±5.21*60.86±5.98△60.91±6.03△T[cB/（nmol·L－1）]6.86±0.66 4.27±0.41*6.20±0.61△6.47±0.63△SOD[λB/(U·mg－1)]412.52±39.34 327.82±30.09*376.96±36.01△382.71±37.61△CAT[λB/(U·mg－1)]1.25±0.12 0.17±0.01*1.01±0.09△1.05±0.10△MDA[mB/(mol·g－1)]28.35±2.80 48.63±4.69*34.22±3.37△32.98±3.17△

2.3 各組大鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)HE染色結(jié)果顯示：對照組大鼠睪丸組織生精小管排列整齊，生精上皮可見不同發(fā)育階段的生精細胞，生精細胞排列規(guī)整，管腔內(nèi)可見大量精子；模型組大鼠睪丸組織生精小管排列紊亂，管腔間有較大間隙，生精上皮組織中生精細胞排列紊亂且數(shù)量減少，管腔內(nèi)精子數(shù)量極少；PACAP27組和左卡尼汀組睪丸組織形態(tài)表現(xiàn)明顯改善，生精小管排列較整齊，生精上皮組織中生精細胞數(shù)量增多，排列較規(guī)整，管腔內(nèi)可見較多精子。見圖2。

圖2 各組大鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE）Fig.2 Pathomorphology of testis tissue of rats in various groups(HE)

2.4 各組大鼠睪丸組織細胞凋亡率TUNEL染色結(jié)果顯示：綠色熒光代表凋亡細胞，即TUNEL染色陽性細胞，對照組大鼠睪丸組織中TUNEL染色陽性細胞較少，模型組大鼠睪丸組織中TUNEL陽性染色細胞明顯增加；與對照組比較，模型組大鼠睪丸組織細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，PACAP27組和左卡尼汀組大鼠睪丸組織中TUNEL染色陽性細胞明顯減少，細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見圖3和4。

圖3 TUNEL染色觀察各組大鼠睪丸組織中細胞凋亡情況（×400）Fig.3 Apoptosis in testis tissue of rats in various groups observed by TUNEL staining（×400）

2.5 各組大鼠睪丸組織中線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達水平Western blotting法檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠睪丸組織中Cyt C、Bax、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，PACAP27組和左卡尼汀組大鼠睪丸組織中Cyt C、Bax、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），而Bcl-2蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 Western blotting法檢測各組大鼠睪丸組織中線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.5 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of mitochondrial apoptosis pathway-related proteins in testis tissue of rats in various groups

2.6 各組大鼠睪丸組織中mPTP開放程度mPTP開放程度檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，模 型 組ΔA（540 nm）值 明 顯 升 高（P＜0.05），表明mPTP開放增強；與模型組比較，PACAP27組和左卡尼汀組ΔA（540 nm）值明顯降低（P＜0.05），表明mPTP開放受到抑制。見圖6。

圖6 各組大鼠睪丸組織線粒體mPTP開放程度Fig.6 Opening degrees of mPTP in testis tissue of rats in various groups

2.7 各組大鼠睪丸組織中線粒體膜電位水平與對照組比較，模型組大鼠睪丸組織中紅色熒光較弱、綠色熒光較強，線粒體膜電位明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，PACAP27組和左卡尼汀組大鼠睪丸組織中紅色熒光較強、綠色熒光較弱，線粒體膜電位明顯升高（P＜0.05）。見圖7和8。

圖7 JC-1熒光染色檢測各組大鼠睪丸組織中線粒體膜電位（×100）Fig.7 Mitochondrial membrane potentials in testis tissue of rats in various groups detected by JC-1 fluorescence staining(×100)

3 討 論

研究［2］顯示：導致男性不育的原因眾多，除遺傳因素外，還與接觸毒物、免疫抑制和抗癌治療有關(guān)。近年來，主要針對改善或解決男性因素不孕癥的傳統(tǒng)男性生殖手術(shù)方面展開研究，如精索靜脈曲張切除術(shù)和睪丸精子提取術(shù)，以試圖擴大其適應證。盡管目前對男性不育的理解有所改進，但特發(fā)性精子異常仍占男性不育癥的30%左右［10］。

圖4 各組大鼠睪丸組織細胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates in testis tissue of rats in various groups

男性不育與化療藥物、長期使用皮質(zhì)類固醇、鈣通道阻滯劑、α-受體阻滯劑、5-α還原酶抑制劑或T替代療法等藥物的使用有關(guān)［3，11-13］。該藥物通常是在未討論對當前或未來生育能力可能產(chǎn)生影響的情況下使用的，但其可能會改變精液參數(shù)、減少精子發(fā)生甚至導致性功能障礙和射精功能障礙［14］。因此，抑制睪丸生殖細胞損傷和恢復睪丸組織結(jié)構(gòu)的完整性，探究引起精子異常的分子和遺傳因素，能夠更好地了解男性因素不育的病因，從而改善患者預后并提高患者的生活質(zhì)量。

本研究采用環(huán)磷酰胺建立大鼠睪丸損傷模型，結(jié)果顯示：大鼠體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量和睪丸指數(shù)均降低，睪丸組織發(fā)生明顯病理損傷，如生精小管間隙變大、管腔內(nèi)生精細胞排列紊亂、數(shù)目減少及壞死脫落等，提示環(huán)磷酰胺誘導大鼠睪丸發(fā)生損傷，動物實驗模型建立成功。本研究結(jié)果顯示：大鼠血清中FSH、LH和T水平降低。FSH、LH和T在精子發(fā)生和精子成熟中均具有重要作用。T是精子發(fā)生過程中的主要雄激素，可促進血睪屏障維持、增加精子的黏附和成熟精子的釋放［15］。促性腺激素釋放激素在控制精子發(fā)生方面具有核心作用，可通過誘導垂體前葉分泌FSH和LH來發(fā)揮作用，其中LH能夠刺激成熟的Leydig細胞產(chǎn)生T，而FSH水平升高可促進精原細胞、精母細胞和精子細胞數(shù)目增加［16-17］。本研究結(jié)果顯示：PACAP27組大鼠血清中FSH、LH和T水平均明顯升高。

環(huán)磷酰胺為前藥，由肝細胞色素P-450激活形成4-羥基環(huán)磷酰胺，再通過化學過程分解轉(zhuǎn)化為磷酰胺氮芥和丙烯醛，或由醛脫氫酶介導生成無活性代謝物羧乙基磷酰胺氮芥。磷酰胺氮芥是主要的活性代謝物，可誘導DNA交聯(lián)，形成阻止DNA復制的加合物，也會影響線粒體，導致跨膜電位和細胞溶 質(zhì)Cyt C積 累 的 降 低［18-19］。研 究［20］表 明：環(huán) 磷酰胺導致組織損傷主要是由于機體內(nèi)氧化與抗氧化平衡被破壞，致使過氧化物質(zhì)損傷組織中大量細胞。本研究結(jié)果顯示：環(huán)磷酰胺作用后大鼠睪丸組織中SOD和CAT活性降低，MDA水平升高，提示環(huán)磷酰胺致?lián)p傷的機制之一可能是引發(fā)自由基損傷；而經(jīng)PACAP27干預后，模型大鼠睪丸組織中SOD和CAT活性均升高，MDA水平降低，提示PACAP27在大鼠睪丸損傷中發(fā)揮抗氧化作用。

線粒體是機體活性氧生成、能量代謝和細胞凋亡的重要整合細胞器，在正常生理狀態(tài)下較為穩(wěn)定，但當受到不良刺激時可導致一系列不良反應發(fā)生，從而致使細胞凋亡。已有研究［21］表明：抗氧化防御失衡通常伴隨線粒體功能受損，而線粒體依賴性凋亡途徑是細胞凋亡重要途徑之一。線粒體依賴性凋亡途徑被氧化應激激活，線粒體介導的細胞凋亡受Bcl-2家族蛋白中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間表達平衡的高度調(diào)節(jié)，一旦該平衡被打破，將引起線粒體膜電位喪失。線粒體膜電位去極化觸發(fā)Cyt C由線粒體膜間隙釋放至細胞質(zhì)中，與銜接蛋白凋亡蛋白酶激活因子-1結(jié)合形成凋亡體，隨后裂解并激活下游的caspase家族蛋白，從而誘導線粒體凋亡發(fā)生［22-24］。mPTP是位于線粒體內(nèi)膜上的非選擇性電導孔，其開放可引起線粒體腫脹和外膜破裂，釋放促凋亡蛋白，是線粒體凋亡途徑中的一個關(guān)鍵靶點［25］。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)PACAP27干預環(huán)磷酰胺作用大鼠能夠抑制睪丸組織細胞凋亡，下調(diào)Cyt C和促凋亡蛋白Bax、caspase-3和caspase-9表達，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達，線粒體膜電位升高并抑制mPTP開放，提示PACAP27可能通過調(diào)控線粒體依賴性凋亡途徑對環(huán)磷酰胺所致睪丸損傷大鼠起到保護作用。

綜上所述，PACAP27通過抑制線粒體依賴性細胞凋亡途徑緩解環(huán)磷酰胺所致大鼠睪丸損傷，其機制與抑制氧化應激反應、mPTP開放及線粒體膜電位降低，減少線粒體內(nèi)Cyt C釋放進而抑制凋亡級聯(lián)反應有關(guān)。本研究為PACAP27對線粒體功能作用研究提供了新的思路，也對環(huán)磷酰胺所致睪丸損傷分子機制提出了新的見解。

圖8 各組大鼠睪丸組織中線粒體膜電位水平Fig.8 Levels of mitochondrial membrane potentials in testis tissue of rats in various groups