發(fā)酵紅參總皂苷對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用及其機(jī)制

曲 萌,鄭 鴻,李 焱,陳博學(xué),姜雨竹,王勝告,于春艷,董志恒

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；3.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

糖尿病腎?。╠iabetic nephmpathy，DN）是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一，主要病理改變?yōu)槟I臟纖維化。研究［1］顯示：導(dǎo)致DN發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素是腎小球的改變。近年研究［2］顯示：腎小管結(jié)構(gòu)及功能的變化對(duì)DN的病程發(fā)展有重要影響。作為腎小管間質(zhì)纖維化的早期變化，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）具有一定的可控性，其病變特點(diǎn)是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞極性逐漸喪失、黏附力下降、細(xì)胞骨架重塑和細(xì)胞遷移力增強(qiáng)。在誘導(dǎo)EMT的多個(gè)信號(hào)通路中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad信號(hào)通路受到廣泛關(guān)注。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1） 屬 于Sirtuins家族，為一類依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的 第Ⅲ類組蛋白去乙?；?，在抗衰老、抗氧化和調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝中均發(fā)揮重要作用［3］。SIRT1通過(guò)去乙?；揎桽mad3和Smad4，進(jìn)而下調(diào)TGF-β1/Smad途徑，抑制EMT發(fā)生［4-6］。

發(fā)酵紅參總皂苷（fermented red ginseng total saponins，F(xiàn)RGTS）是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中草藥人參的熟制品紅參發(fā)酵后的提取成分，與人參及紅參比較，其抗氧化和抗炎等生物學(xué)活性均有增加。本課題組前期研究［7］顯示：發(fā)酵紅參活性組分可降低高糖條件下腎小球系膜細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖率，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分解，改善高糖對(duì)細(xì)胞的損傷。但FRGTS對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞是否同樣具有保護(hù)作用尚不明確。本研究以大鼠腎小管上皮NRK-52E細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察FRGTS對(duì)高糖下腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響，并基于SIRT1及其下游TGF-β1/Smad信號(hào)通路初步探討其可能的作用機(jī)制，進(jìn)一步為臨床防治DN提供潛在靶點(diǎn)和有效手段。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器大鼠腎小管上皮NRK-52E細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海分院。FRGTS由吉林大學(xué)藥學(xué)院提供（皂苷含量73.4%），SIRT1抑 制 劑EX527（美 國(guó)Selleck Chemicals公司），DMEM培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國(guó)Gibco公司），ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（美國(guó)Bimake公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），兔抗E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、α-平 滑 肌 肌 動(dòng) 蛋 白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體、鼠抗SIRT1、TGF-β1和Smad3抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗（美國(guó)Proteintech公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司），RT-qPCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），SpectraMax 190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司），電泳裝置及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組自液氮中取出大鼠NRK-52E細(xì)胞復(fù)蘇，將細(xì)胞接種于含15% FBS的DMEM（含5.5 mmol·L－1D-葡萄糖）培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h半量換液，每2～3 d完全更換培養(yǎng)液1次，并在換液過(guò)程中逐漸將FBS濃度降為10%，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后采用0.25%胰酶消化后傳代。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組（5.5 mmol·L－1D-葡萄糖）、高糖組（30.0 mmol·L－1D-葡 萄 糖）、EX527組（30.0 mmol·L－1D-葡 萄糖＋10 μmol·L－1EX527）、FRGTS組（30.0 mmol·L－1D-葡 萄 糖＋25 mg·L－1FRGTS）和EX527+FRGTS組（30.0 mmol·L－1D-葡萄糖＋10 μmol·L－1EX527＋25 mg·L－1FRGTS）。取5代NRK-52E細(xì)胞，以1×104mL－1密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁后同步化（含0.5% FBS、5.5 mmol·L－1D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液）24 h后按組別繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.3 免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)水平待細(xì)胞鋪滿載玻片70%～80%時(shí)，4%多聚甲醛固定、0.3% Triton X-100破膜、BSA封閉后加入一抗，4℃濕盒中孵育過(guò)夜，滴加熒光標(biāo)記二抗，室溫下孵育2 h。倒置熒光顯微鏡下觀察正常對(duì)照組和高糖組細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)分布情況和表達(dá)水平，采用Image J軟件，選擇Default算法測(cè)定熒光強(qiáng)度以，以熒光強(qiáng)度表示各組細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)水平，熒光強(qiáng)度單位為AU。

1.4 RT-qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA和SIRT1 mRNA表達(dá)水平采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，共40個(gè) 循 環(huán)。PCR引 物 序 列：E-cadherin，上游引物5′-GGTCGGTGCCCGTATTC-3′，下游引物5′-TGCCCTCGTTGGTCTTGC-3′；α-SMA，上游引物5′-GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC-3′，下 游 引 物5′-CATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTCTC-3′；SIRT1，上游引物5′-AGAGTTGCCACCAACACCTC-3′，下 游 引 物5′-ACTGGAACCAACAGCCTTGA-3′；GAPDH，上 游 引 物5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下 游 引 物5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。采用2－△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)水平。

1.5 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，ColⅠ）水平收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ水平。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ水平，單位為μg·L－1。

1.6 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中SIRT1、TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，加 入 蛋 白 裂 解 液，4℃、2 h，10 000 r·min－1離心5 min后留取上清，測(cè)定蛋白濃度，煮沸變性，各取50 μg蛋白樣品上樣，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，恒流轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉后按說(shuō)明書方法加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗，DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平＝目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA和SIRT1 mRNA表達(dá)水平，各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ水平，各組細(xì)胞中SIRT1、TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組NRK-52E細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)水平免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示：正常對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈三角形、多邊形，細(xì)胞輪廓清晰，鋪路石樣排列，細(xì)胞膜上E-cadherin表達(dá)［（174.293±14.048）AU］明顯，胞質(zhì)內(nèi)少量 α-SMA表達(dá) ［（108.118±7.793）AU］。與 正 常 對(duì) 照 組 比 較，高 糖 組NRK-52E細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)椴灰?guī)則形和梭形，E-cadherin表達(dá)水平［（80.341±6.867）AU］明顯降低（P＜0.01），α-SMA表達(dá)水平［（207.210±11.135）AU］明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 2組細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)（免疫熒光，×400）Fig.1 Expressions of E-cadherin and α-SMA protein of cells in two groups（Immunofluorenscence,×400）

2.2 各組NRK-52E細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較，高糖組NRK-52E細(xì)胞中E-cadherin mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），α-SMA mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與高糖組比較，F(xiàn)RGTS組NRK-52E細(xì)胞中E-cadherin mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），α-SMA mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與FRGTS組比較，EX527+FRGTS組NRK-52E細(xì)胞中E-cadherin mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），α-SMA mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組NRK-52E細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA mRNA表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of E-cadherin and α-SMA mRNA in NRK-52E cells in various groups (n=5，±s）

表1 各組NRK-52E細(xì)胞中E-cadherin和α-SMA mRNA表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of E-cadherin and α-SMA mRNA in NRK-52E cells in various groups (n=5，±s）

*P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs high glucose group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs FRGTS group.

Group Normal control High glucose EX527 FRGTS EX527+FRGTS E-cadherin 1.000±0.000 0.316±0.030*0.314±0.025*0.488±0.047*△△0.336±0.031*##α-SMA 1.000±0.000 2.317±0.247*2.464±0.236*1.917±0.191*△2.386±0.218*#

2.3 各組NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ水平正常對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ水平較低。與正常對(duì)照組比較，高糖組NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ水平明顯升高（P＜0.01）；與高糖組比較，F(xiàn)RGTS組NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ水平降低（P＜0.05）；與FRGTS組 比 較，EX527+FRGTS組NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ水平Tab.2 Levels of ColⅠin cell supernatant of NRK-52E cells in various groups [n=5，±s，ρB/（μg·L-1）］

表2 各組NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ水平Tab.2 Levels of ColⅠin cell supernatant of NRK-52E cells in various groups [n=5，±s，ρB/（μg·L-1）］

*P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05 vs high glucose group；#P＜0.05 vs FRGTS group.

Group Normal control High glucose EX527 FRGTS EX527+FRGTS ColⅠ1.031±0.045 3.042±0.181*3.003±0.209*2.667±0.220*△3.010±0.116*#

2.4 各組NRK-52E細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較，高糖組NRK-52E細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）；與高糖組比較，F(xiàn)RGTS組NRK-52E細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05或P＜0.01）；與FRGTS組比較，EX527+FRGTS組NRK-52E細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表3和圖2。

圖2 各組NRK-52E細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expression of SIRT1 protein in NRK-52E cells in various groups

表3 各組NRK-52E細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of SIRT1 mRNA and protein in NRK-52E cells in various groups (n=5，±s）

表3 各組NRK-52E細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of SIRT1 mRNA and protein in NRK-52E cells in various groups (n=5，±s）

*P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs high glucose group；#P＜0.01 vs FRGTS group.

Group Normal control High glucose EX527 FRGTS EX527+FRGTS SIRT1 mRNA 1.000±0.000 0.295±0.051*0.257±0.042*0.380±0.047*△0.277±0.032*#SIRT1 protein 1.092±0.075 0.361±0.039*0.304±0.026*0.542±0.050*△△0.319±0.026*#

2.5 各組NRK-52E細(xì)胞中TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平正常對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞中TGF-β1和Smad3蛋白均有少量表達(dá)。與正常對(duì)照組比較，高糖組NRK-52E細(xì)胞中TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與高糖組比較，F(xiàn)RGTS組NRK-52E細(xì)胞中TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01）；與FRGTS組比較，EX527+FRGTS組NRK-52E細(xì) 胞 中TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)表4和圖3。

圖3 各組NRK-52E細(xì)胞TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of TGF-β1 and Smad3 proteins in NRK-52E cells in various groups

表4 各組NRK-52E細(xì)胞中TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of TGF-β1 and Smad3 proteins in NRK-52E cells in various groups (n=5，±s）

表4 各組NRK-52E細(xì)胞中TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of TGF-β1 and Smad3 proteins in NRK-52E cells in various groups (n=5，±s）

*P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.01 vs high glucose group；#P＜0.01 vs FRGTS group.

Group Normal control High glucose EX527 FRGTS EX527+FRGTS TGF-β1 0.349±0.038 1.187±0.084*1.106±0.073*0.532±0.033*△1.150±0.045*#Smad3 0.143±0.011 0.886±0.029*0.838±0.042*0.339±0.051*△0.854±0.059*#

3 討 論

細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過(guò)量聚積導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化是DN的主要病理特征之一。EMT在腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，所形成的肌成纖維細(xì)胞不但可使ColⅠ、Ⅲ型膠原（collagen typeⅢ，ColⅢ）和纖連蛋白等ECM成分過(guò)量分泌，還可破壞腎臟固有結(jié)構(gòu)［8-9］。發(fā)生EMT的腎小管上皮細(xì)胞，其上皮細(xì)胞的特性被抑制，細(xì)胞形態(tài)改變，轉(zhuǎn)化為具有紡錘體形態(tài)的間充質(zhì)細(xì)胞。具體表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物如E-cadherin和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）下調(diào)，細(xì)胞間黏附連接喪失［10-11］；肌動(dòng)蛋白骨架重組，間充質(zhì)標(biāo)志物如α-SMA和波形蛋白的獲得；通過(guò)鋅離子依賴性基質(zhì)金屬蛋白酶破壞腎小管基底膜而浸入間質(zhì)，分泌大量ECM以導(dǎo)致腎纖維化。本研究結(jié)果顯示：高糖刺激大鼠腎小管上皮NRK-52E細(xì)胞48 h后，與正常對(duì)照組比較，高糖組NRK-52E細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則形和梭形，E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，α-SMA蛋白表達(dá)水平升高，同時(shí)ColⅠ水平明顯升高，提示高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞發(fā)生EMT。

在與纖維化相關(guān)的各種腎臟疾病中，TGF-β1作為關(guān)鍵因子呈高表達(dá)。在DN中，高血糖會(huì)刺激TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平及其受體表達(dá)水平均上調(diào)。高表達(dá)的TGF-β1與細(xì)胞表面上轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體（transforming growth factor-β receptor，TGF-βR）結(jié)合后，將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，招募并磷酸化激活Smad2和Smad3，Smad4可與活化的Smad2和Smad3形成異三聚復(fù)合體，并易位于細(xì)胞核，結(jié)合和調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致ECM合成增加和降解受阻，誘導(dǎo)腎小球和腎小管發(fā)生EMT［12-15］。本研究結(jié)果顯示：高糖作用下NRK-52E細(xì)胞中TGF-β1和Smad3表達(dá)水平增加，提示TGF-β1/Smad信號(hào)通路被激活。TGF-β1是腎纖維化的主要推動(dòng)力，可以作為DN治療的理想靶點(diǎn)，在DN小鼠模型中也成功地利用TGF-β1中和性單克隆抗體預(yù)防了腎小球肥大［16-17］。然而，研究［18］顯示：在臨床上使用TGF-β1特異性抗體治療，并未能延緩DN患者腎小球?yàn)V過(guò)率和尿蛋白含量降低。TGF-β1靶向治療的失敗，使研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)而關(guān)注于TGF-βR及下游的Smads。Smad3過(guò)度活化及Smad7表達(dá)下調(diào)可直接導(dǎo)致TGF-β1/Smad通路信號(hào)失衡，減少信號(hào)失衡是延緩腎纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。Smad3激活后可促進(jìn)與致纖維化基因的結(jié)合，上調(diào)ColⅠ和ColⅢ等蛋白表達(dá)。小鼠Smad3基因缺失可延緩DN模型鼠的病程進(jìn)展，表現(xiàn)為小鼠尿白蛋白排泄和血清肌酐水平未見(jiàn)明顯升高，而使用Smad3特異性抑制劑可有效減緩近端腎小管上皮細(xì)胞的EMT，進(jìn)而減輕腎纖維化［19-21］。可見(jiàn)，Smad3在DN的發(fā)展過(guò)程中同樣起重要作用，而Smad3的活性不但受磷酸化水平控制，同時(shí)也受乙?；揎椀挠绊懀弑磉_(dá)的TGF-β1同時(shí)會(huì)升高Smad3乙?；?。

SIRT1可對(duì)不同類型的底物去乙?；?，包括轉(zhuǎn)錄因子、DNA修復(fù)蛋白和信號(hào)傳導(dǎo)因子，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞衰老、能量代謝和胰島素分泌等過(guò) 程［3，22-23］。SIRT1活 性 與NAD濃 度 密 切 相 關(guān)，依據(jù)胞內(nèi)NAD濃度，SIRT1感知細(xì)胞能量狀態(tài)，去乙?；揎椞囟ǖ孜飬⑴c多種代謝調(diào)節(jié)。SIRT1在DN發(fā)生發(fā)展中的作用被廣泛關(guān)注［24-25］。在DN動(dòng)物模型中，通過(guò)激活SIRT1，可緩解系膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞中因TGF-β介導(dǎo)的Smad2和Smad3乙 酰 化 水 平 的 升 高［4-5］。Smad3乙?；磻?yīng)由腎臟間質(zhì)纖維化的早期開始持續(xù)至終末期。研 究［4，6］表 明：SIRT1通 過(guò) 對(duì)Smad3去 乙 ?；?，可明顯減少因TGF-β/Smad3信號(hào)通路激活而上調(diào)的α-SMA、Ⅳ型膠原（collagen typeⅣ，ColⅣ）和纖連蛋白表達(dá)水平，延緩腎纖維化，而敲除SIRT1后，上述作用消失。因此，可以通過(guò)激活SIRT1來(lái)阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路，進(jìn)而抑制器官纖維化。本研究采用高糖處理NRK-52E細(xì)胞48 h后，與正常對(duì)照組比較，高糖組NRK-52E細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低。綜上所述，SIRT1在抗纖維化中發(fā)揮作用并對(duì)TGF-β1/Smad通路有重要調(diào)節(jié)作用。本研究設(shè)立了SIRT1特異性小分子抑制劑EX527組和EX527加FRGTS干預(yù)組，以觀察FRGTS對(duì)SIRT1的調(diào)節(jié)作用。

紅參發(fā)酵后其生物利用度和生物學(xué)活性增加。與紅參比較，紅參發(fā)酵產(chǎn)物清除DPPH自由基能力和抑制脂質(zhì)氧化能力增強(qiáng)［26］。BAE等［27］對(duì)卵清蛋白誘導(dǎo)的過(guò)敏性鼻炎小鼠的研究顯示：發(fā)酵紅參可通過(guò)抑制白細(xì)胞介素4和免疫球蛋白E表達(dá)進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。CHEON等［28］研究顯示：發(fā)酵紅參可改善ob/ob小鼠胰島素敏感性，小鼠的血糖、甘油三酯、總膽固醇和游離脂肪酸等均降低。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DM動(dòng)物模型和2型糖尿病臨床研究［29-30］中均證實(shí)了發(fā)酵紅參的降糖作用。本課題組前期研究［7］顯示：紅參發(fā)酵產(chǎn)物可明顯抑制高糖誘導(dǎo)下的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖，同時(shí)上調(diào)基質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表達(dá)，下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）的表達(dá)，促進(jìn)ECM的降解。FRGTS是紅參發(fā)酵產(chǎn)物中總皂苷組分，本研究通過(guò)高糖誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，使用FRGTS干預(yù)后，上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-cadherin表達(dá)水平升高，而上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)水平降低，ColⅠ水平明顯降低，表明FRGTS對(duì)高糖所致的EMT有一定的抑制作用。同時(shí)，F(xiàn)RGTS對(duì) 高 糖 所致的TGF-β1和Smad3表 達(dá)具有下調(diào)作用，并上調(diào)SIRT1表達(dá)，應(yīng)用SIRT1特異性抑制劑EX527后，減弱了上述作用。由此推斷，SIRT1可能為FRGTS的效應(yīng)靶點(diǎn)之一。

綜上所述，F(xiàn)RGTS可減緩高糖刺激導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生，其作用機(jī)制可能與FRGTS有效上調(diào)SIRT1表達(dá)、進(jìn)而下調(diào)TGF-β1/Smad信號(hào)通路活性有關(guān)。本研究進(jìn)一步證實(shí)發(fā)酵紅參對(duì)DN中腎纖維化具有一定的抑制作用，但僅對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，其具體作用機(jī)制尚有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的深入研究。