桑黃酸性多糖對膽管結(jié)扎所致小鼠肝纖維化的改善作用及其機(jī)制

谷明柳,林逢源,吳雪峰,周嘉寧,盧學(xué)春,杜培革,安麗萍

（1.北華大學(xué)藥學(xué)院微生物與生化藥學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心血液科 國家老年疾病臨床研究中心，北京 100853）

肝纖維化是機(jī)體各種慢性疾病對肝臟損傷的病理表現(xiàn)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究［1］表明：長期過量飲酒、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎和膽汁淤積性肝病均有可能發(fā)展為肝纖維化。如果持續(xù)損傷，肝纖維化可能導(dǎo)致肝硬化，并最終發(fā)展為肝癌。淤膽性肝損傷是肝纖維化最重要的刺激因素之一，其特點(diǎn)為肝組織和血清中膽汁酸水平升高，產(chǎn)生肝臟毒性，肝組織出現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化［2］。研究［3］顯示：肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，可以通過逆轉(zhuǎn)肝纖維化阻止其繼續(xù)向肝硬化發(fā)展而達(dá)到治療效果。

桑黃（Phellinus igniarius）是多孔菌科火木層孔菌的子實(shí)體，別名桑寄生、桑臣、桑耳，被現(xiàn)代人稱為“森林黃金”。桑黃中含有多糖、黃酮、多酚、三萜和蛋白質(zhì)等多種成分，其中桑黃多糖是其主要活性成分［4-5］。目前已有研究［6-7］顯示：桑黃多糖通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激途徑對硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝纖維化具有保護(hù)作用。本課題組前期研究［7］表明：桑黃多糖具有體外抗氧化活性，能抑制肝癌細(xì)胞增殖，其中桑黃酸性多糖（Phellinus igniariusacidic polysaccharide，PIP）能提高小鼠免疫力，但其對肝纖維化的保護(hù)作用目前尚未闡明。本研究通過膽管結(jié)扎（bile duct ligation，BDL）建立肝纖維化小鼠模型，探討PIP對肝纖維化的作用，闡明其可能的作用機(jī)制，為肝纖維化的治療提供新的研究方向。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器SPF級雄性C57/BL6小鼠60只，4周齡，體質(zhì)量（20.0±2.0）g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）-2018-0007，購自長春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，分籠飼養(yǎng)，維持12 h∶12 h晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。桑黃子實(shí)體購自延吉百納和商貿(mào)有限公司，經(jīng)北華大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定為長白山野生桑黃子實(shí)體，PIP由北華大學(xué)藥學(xué)院微生物與生化藥學(xué)教研室自制，制備方法為桑黃子實(shí)體經(jīng)水提醇沉，以DEAE纖維素分離純化制得PIP［8］。秋水仙堿購自美國Sigma公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙 二 醛 （malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒和HE染液購自南京建成生物工程研究所，天狼猩紅試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Ⅲ型前膠原（procollagen typeⅢ，PCⅢ）試劑盒、Ⅳ型膠原（collagen typeⅣ，ColⅣ）試劑盒、兔抗β-actin、核因子E2相關(guān)因子（nuclear factor-E2 related factor，Nrf2）、血 紅 素 加 氧 酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）單克隆抗體購自美國Abclonal公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自英國Abcam公司，彩虹Marker購自美國GE Healthcare公司，ECL顯色液購于江蘇碧云天有限公司。UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)購自上海島津國際貿(mào)易有限公司，ChampchemiProfessional全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)購自北京賽制創(chuàng)業(yè)科技有限公司，電泳儀購自美國Bio-Rad公司，Acradia H&C石蠟包埋機(jī)、冷臺和RM 2245半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購自德國Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和造模60只C57/BL6雄性小鼠隨機(jī)分為對照組（雙蒸水灌胃+假手術(shù)）、模型組（雙蒸水灌胃+BDL）、陽性藥組（秋水仙堿0.2 mg·kg－1灌胃+BDL）和PIP組（PIP 70 mg·kg－1灌胃+BDL），每組15只。動(dòng)物飼養(yǎng)及使用嚴(yán)格按照北華大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。實(shí)驗(yàn)前采用5 %水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，將小鼠固定于操作臺上。腹部75 %醫(yī)用酒精消毒，剪開皮膚及肌肉等組織，暴露肝臟。取棉簽蘸生理鹽水探入腹腔，將肝葉、胃及部分腸管輕輕向右撥開，眼科鑷輕柔游離膽管，埋置2條手術(shù)縫線，結(jié)扎膽管上、下兩段，并于中間處剪斷膽管，隨即關(guān)腹。對照組小鼠僅繞膽總管穿過手術(shù)線但不結(jié)扎。灌胃給藥3周，末次給藥12 h后眼球取血，去除內(nèi)臟，生理鹽水洗凈吸干，稱取小鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量，計(jì)算小鼠肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)＝小鼠肝臟質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。每組取肝大葉置于甲醛溶液中固定，常溫下保存?zhèn)溆茫溆喔谓M織－80℃保存。

1.3 微板法檢測各組小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平小鼠眼 眶取血，靜置1 h后，3 000 r·min－1、4℃離心20 min，采用微板法檢測各組小鼠血清中ALT和AST水平，按照試劑盒說明書方法，每孔加入10 μL血清，再加入顯色劑，于505 nm波長處測定吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ALT和AST水平。

1.4 雙抗體夾心法檢測各組小鼠血清中PCⅢ和ColⅣ水平采用雙抗體夾心法檢測各組小鼠血清中肝纖維化標(biāo)志物PCⅢ和ColⅣ水平，于板底涂針對抗原的抗體，將血清和檢測抗體加入后，反應(yīng)一段時(shí)間后用洗滌液洗滌5次，分別加入2種不同的顯色液，以顯色反應(yīng)的結(jié)果作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。于450 nm波長處檢測A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算PCⅢ和ColⅣ水平。

1.5 HE染色和天狼猩紅染色觀察各組小鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)和肝纖維化程度取固定后的肝大葉石蠟包埋，切片。HE染色后，顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織形態(tài)表現(xiàn)。天狼猩紅染色后，顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織纖維化程度。

1.6 檢測各組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性及MDA和GSH水平取凍存的小鼠肝臟，按照肝臟 質(zhì) 量 和 生 理 鹽 水 以1∶9比 例，3 000 r·min－1、4℃離心10 min制成10%組織勻漿，用生理鹽水稀釋成不同濃度進(jìn)行最佳取樣濃度篩選。按照試劑盒說明書操作，采用水溶性四氮唑（WST-1）法檢測SOD活性，硫代巴比妥酸（TBA）法檢測MDA水平，微板法檢測GSH水平，比色法檢測GSH-Px活性。

1.7 Western blotting法檢測各組小鼠肝組織中Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平稱取50 mg肝組織，加入500 μL RIPA裂解液，冰上勻漿，裂解1 h，4℃、12 000 r·min－1離心20 min，取上清液，BCA試劑盒測定蛋白含量。采用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜1 h至甲醇處理后的PVDF膜，含5%脫脂奶粉TBS-T封閉液封閉1 h，然后加入一抗β-actin（1∶50 000）、Nrf2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）和NQO1（1∶1 000）室 溫 孵 育1h，TBS-T洗 滌3次，每次15 min，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBS-T洗滌3次，每次15 min，ECL顯色液顯色。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)、血清中ALT和AST水平、血清中PCⅢ和ColⅣ水平、肝組織中SOD和GSH-Px活性、肝組織中MDA和GSH水平及肝組織中Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)與對照組比較，模型組、陽性藥組和PIP組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組比較，模型組小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)均升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥組和PIP組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)均降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)Tab.1 Body weights,liver weights,and liver indexes of mice in various groups (n=15，±s）

表1 各組小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)Tab.1 Body weights,liver weights,and liver indexes of mice in various groups (n=15，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group Control Model Positive drug PIP Body weight（m/g）22.35±1.36 20.36±1.73 21.65±1.25 21.32±1.85 Liver weight（m/g）0.95±0.13 1.16±0.21*0.98±0.20△1.02±0.19△Liver index（η/%）4.25±0.49 5.72±0.55*4.53±0.43△4.57±0.38△

2.2 各組小鼠血清中ALT和AST水平與對照組比較，模型組小鼠血清中ALT和AST水平均明顯升高（P＜0.01），表明小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷，造模成功；與模型組比較，陽性藥組和PIP組小鼠血清中ALT和AST水平明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠血清中ALT和AST水平Tab.2 Levels of ALT and AST in serum of mice in variousgroups [n=15，±s，λB/(U·L－1］

表2 各組小鼠血清中ALT和AST水平Tab.2 Levels of ALT and AST in serum of mice in variousgroups [n=15，±s，λB/(U·L－1］

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group.

Group Control Model Positive drug PIP ALT 29.84±5.31 210.89±16.85*102.87±18.15△112.61±22.60△AST 16.75±2.94 69.07±5.47*30.32±7.02△44.86±8.75△

2.3 各組小鼠血清中PCⅢ和ColⅣ水平與對照組比較，模型組小鼠血清中PCⅢ和ColⅣ水平均升高（P＜0.05），表明肝臟出現(xiàn)纖維化，肝纖維化模型建立成功；與模型組比較，陽性藥組和PIP組小鼠血清中PCⅢ和ColⅣ水平均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠血清中PCⅢ和ColⅣ水平Tab.3 Levels of PCⅢand ColⅣin serum of mice in various groups [n=15，±s，ρB/(μg·L－1)］

表3 各組小鼠血清中PCⅢ和ColⅣ水平Tab.3 Levels of PCⅢand ColⅣin serum of mice in various groups [n=15，±s，ρB/(μg·L－1)］

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.

Group Control Model Positive drug PIP PCⅢ51.50±7.99 79.42±4.07*51.97±6.67△52.81±5.15△ColⅣ49.81±2.94 117.11±10.84*56.48±8.01△△47.32±5.81△△

2.4 各組小鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)HE染色結(jié)果顯示：對照組小鼠肝組織中肝小葉和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，核居中，門管區(qū)未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，排列紊亂，門管區(qū)出現(xiàn)纖維組織沉積，可見大灶狀液化性肝壞死和較多炎癥細(xì)胞浸潤；陽性藥組和PIP組小鼠肝組織壞死程度明顯減輕，未見明顯纖維組織沉積，但仍可見局灶性炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of liver tissue of mice in various groups（HE，×200）

2.5 各組小鼠肝組織纖維化程度天狼猩紅染色結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組小鼠肝組織門管區(qū)膠原纖維含量明顯增加，膠原纖維呈亮紅色，表明肝組織出現(xiàn)明顯纖維化；與模型組比較，陽性藥組和PIP組小鼠肝組織門管區(qū)膠原纖維含量明顯減少，肝纖維化程度改善。見圖2。

圖2 各組小鼠肝組織纖維化程度（天狼猩紅，×200）Fig.2 Fibrosis degrees of liver tissue of mice in various groups（Sirius red，×200）

2.6 各組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性及MDA和GSH水平與對照組比較，模型組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性明顯降低（P＜0.01），MDA和GSH水 平 明 顯 升 高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和PIP組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性均升高（P＜0.05），GSH和MDA水平均降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性及MDA和GSH水平Tab.4 Activities of SOD and GSH-Px and levels of MDA and GSH in liver tissue of mice in various groups (n=15，±s）

表4 各組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性及MDA和GSH水平Tab.4 Activities of SOD and GSH-Px and levels of MDA and GSH in liver tissue of mice in various groups (n=15，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；ΔP＜0.05 vs model group.

Group Control Model Positive drug PIP SOD[λB/(U·mg－1)]150.38±12.62 60.58±10.29**140.34±12.53△70.53±12.53△GSH-Px[λB/(U·mg－1)]775.26±127.89 447.23±100.69**698.32±145.72△720.95±123.65△MDA[mB/(μmol·g－1)]3.21±0.26 8.24±1.37*3.46±0.44△3.12±0.26△GSH[mB/(μmol·g－1)]0.49±0.07 1.20±0.13**0.74±0.08△0.76±0.15△

2.7 各組小鼠肝組織中Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對照組比較，模型組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥組小鼠肝組織中Nrf2和NQO1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），HO-1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），PIP組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1和NQO1蛋 白 表 達(dá) 水 平 均 升 高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組小鼠肝組織中Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B-D）Fig.3 Electrophoregron（A）and histogram（B-D）of expressions of Nrf2/HO-1 signaling pathway-related proteins in liver tissue of mice in various groups

3 討 論

目前常用的肝纖維化造模方法包括BDL法、毒物誘導(dǎo)法、酒精誘導(dǎo)法、刀豆蛋白誘導(dǎo)法和血吸蟲誘導(dǎo)法等。其中BDL法是目前最常用的梗阻性膽汁淤積造模方法，具有形成肝纖維化穩(wěn)定、造模周期短和無毒性物質(zhì)接觸等優(yōu)勢［9］。小鼠BDL后會(huì)出現(xiàn)膽汁倒流入血，膽汁酸積聚，小鼠血清中ALT和AST水平升高。ALT和AST是反映肝功能的重要指標(biāo)，在氨基酸合成和分解代謝過程中起到重要作用，是衡量肝損傷的敏感指標(biāo)［9］。本研究結(jié)果顯示：模型組小鼠血清中ALT和AST水平明顯升高，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，排列紊亂，門管區(qū)出現(xiàn)纖維組織沉積，可見大灶狀液化性肝壞死和較多炎癥細(xì)胞浸潤，提示模型組小鼠出現(xiàn)明顯的肝損傷；給予PIP后，小鼠血清中ALT和AST水平明顯降低，肝臟壞死程度明顯減輕，但仍可見局灶性炎癥細(xì)胞浸潤，提示PIP有一定的肝損傷保護(hù)作用。PCⅢ可以反映肝纖維化程度，ColⅣ是肝纖維的早期標(biāo)志物，ColⅣ水平升高可以靈敏反映肝纖維化的發(fā)展過程［10］。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組小鼠肝纖維化標(biāo)志物PCⅢ和ColⅣ水平升高，門管區(qū)膠原纖維含量明顯增加，說明小鼠肝纖維化模型建立成功；給予PIP后，PIP組小鼠肝組織中PCⅢ和ColⅣ水平降低，膠原纖維含量減少，提示PIP能減少小鼠肝纖維化進(jìn)展過程中的膠原堆積，有效緩解肝纖維化，改善肝臟功能，發(fā)揮肝損傷保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不明確。

在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，諸多因素可引發(fā)機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激加劇肝纖維化程度，因此抑制機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激程度可以改善肝纖維化［11-12］。SOD能清除肝組織中生成的自由基，作為催化劑發(fā)揮抗氧化作用，調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化應(yīng)激系統(tǒng)的平衡狀態(tài)，是天然的抗氧化劑，SOD活性降低會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過氧化物催化裂解，促進(jìn)MDA生成，產(chǎn)生細(xì)胞毒性［13］。MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，是反映機(jī)體潛在抗氧化能力的重要參數(shù)［14］。GSH和GSH-Px是 機(jī) 體 氧 化 應(yīng) 激 水 平 的 反應(yīng)指標(biāo)，GSH主要在肝組織中生成且具有強(qiáng)大的還原能力，在肝臟保護(hù)中發(fā)揮積極作用，但當(dāng)肝細(xì)胞遭受嚴(yán)重破壞時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)內(nèi)源生成減少，消耗增 加，從 而 使GSH水 平 降 低［15］。GSH-Px是 體 內(nèi)重要的抗氧化酶，能催化GSH和過氧化氫之間的還原反應(yīng)，維持肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整［16］。本研究結(jié)果顯示：PIP組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性升高，GSH和MDA水平降低，PIP維持肝內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡狀態(tài)，發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化活性。由此可知，PIP可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶活性和氧化應(yīng)激改善肝纖維化，本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討PIP對肝纖維化的保護(hù)作用提供了研究方向。

氧化應(yīng)激損傷在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起到關(guān)鍵作用，氧化應(yīng)激系統(tǒng)的過度激活會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化并產(chǎn)生大量的活性氧，干擾肝臟內(nèi)細(xì)胞的正常功能，因此恢復(fù)體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡能抑制肝纖維化的進(jìn)展［17-19］。研究［20］表明：Nrf2是體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激效應(yīng)因子，也是肝臟抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的中心環(huán)節(jié)，Nrf2激活能增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，抵抗體內(nèi)氧化應(yīng)激系統(tǒng)的失衡。在膽汁淤積性肝損傷狀態(tài)下，Nrf2被持續(xù)激活，與Keap1解偶聯(lián)并與下游抗氧化因子Ⅱ期解毒酶結(jié)合，包括HO-1和NQO1，保護(hù)機(jī)體免受活性氧攻擊來降低氧化應(yīng)激損傷［20-24］。本研究結(jié)果顯示：PIP處理后，肝纖維化小鼠肝組織中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)上調(diào)，表明Nrf2可能被激活，進(jìn)而影響肝組織中一系列解毒和抗氧化防御基因的表達(dá)，降低氧化應(yīng)激水平，從而控制肝纖維化的進(jìn)程。因此，PIP可通過上調(diào)Nrf2/HO-1信號通路中3個(gè)關(guān)鍵因子Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)水平，增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶活性，改善肝纖維化，抑制BDL所致的小鼠肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)展。

綜上所述，PIP能改善小鼠BDL導(dǎo)致的肝纖維化，其作用可能是通過降低肝組織氧化應(yīng)激水平，調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路中關(guān)鍵因子Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。本研究為肝纖維化的治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。