藥用昆蟲喙尾琵琶甲腸道抗菌活性放線菌的篩選及鑒定

王明明, 殷鵬凱, 李銘暉, 楊自忠, 楊大松, 楊銀河

(大理大學(xué)藥學(xué)院, 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南大理 671000)

昆蟲是自然界中個體數(shù)量最多、種類最豐富的生物。生活習(xí)性不同、生存環(huán)境多樣、腸道環(huán)境復(fù)雜等因素導(dǎo)致了昆蟲的腸道共生菌具有一定特殊性(Liuetal., 2021)。而且，昆蟲腸道微生物在抵御外來病原微生物入侵方面發(fā)揮十分重要的作用(Zhangetal., 2018; Jang and Kikuchi, 2020)。有研究者已從蜣螂Copristripartitus(Umetal., 2015)、埋葬甲蟲(Heiseetal., 2019)、白蟻(未建華等, 2019)、蜻蜓、蟋蟀(徐曉等, 2018)等昆蟲腸道微生物中分離得到結(jié)構(gòu)新穎且具有顯著抗菌活性的代謝產(chǎn)物。

有文獻(xiàn)報道，一些藥用植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似藥理活性的次生代謝產(chǎn)物(方霞等, 2016)。喙尾琵琶甲Blapsrynchopetera俗名臭殼子，屬鞘翅目(Coleoptera)擬步甲科(Tenebrionidae)琵琶甲屬Blaps，廣泛分布于云南各地，生態(tài)幅度較寬，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，在云南民間長期被作為一種抗菌消炎的藥物使用(趙敏等, 2007; Liuetal., 2019)。而且，喙尾琵琶甲作為雜食性昆蟲，其腸道微生物種類豐富且存在激烈的生存競爭，可能是獲得產(chǎn)生良好抗菌活性物質(zhì)的微生物新資源。目前，國內(nèi)外對其的研究主要集中在蟲體提取物及防御液的抗菌、抗腫瘤等藥理活性方面(施貴榮等, 2012; Xiaoetal., 2018; Xuetal., 2019)，缺乏對其腸道微生物的研究。

本研究首次對喙尾琵琶腸道共生放線菌進(jìn)行探索，分離到176株放線菌。以9株常見致病菌為指示菌株，采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行測試，尋找具有抗菌活性的放線菌，結(jié)果顯示46株放線菌具有抗菌活性；最后通過分子生物學(xué)方法鑒定，明確18株具有顯著抗菌活性的放線菌均為鏈霉菌屬Streptomyces。本研究有助于藥用昆蟲喙尾琵琶甲腸道放線菌資源的進(jìn)一步開發(fā)利用，也為后續(xù)從喙尾琵琶甲腸道這一特殊生境中獲得具有顯著抗菌活性且結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與致病菌

2020年8月于云南省大理白族自治州大理市滿江區(qū)農(nóng)作物田地內(nèi)捕捉昆蟲成蟲。成蟲由大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊自忠教授根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行鑒定(任國棟等, 2016)，鑒定為喙尾琵琶甲Blapsrynchopetera。

5株致病細(xì)菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methieillin-resistantStaphylococusaureus, MRSA)(ATCC43300)購自廣東省科學(xué)院微生物研究所，金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌Escherichiacoli(ATCC25922)、糞腸球菌Enterococcusfaecalis(ATCC47077)和銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa(ATCC9027)以及3株致病真菌黑曲霉Aspergillusniger(BNCC186380)、青霉菌Penicilliumexpansum(BNCC117714)、白色念珠菌Canidiaalbicans(ATCC10231) 由昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種儲藏庫提供，致病細(xì)菌鼠傷寒沙門氏菌Salmonellatyphimurium(BNCC103281)購自北納生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

放線菌分離培養(yǎng)基為高氏一號(GS)培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，添加35 mg/L的重鉻酸鉀，抑制真菌和其他細(xì)菌的生長；放線菌純化培養(yǎng)基為不含抑制劑的高氏一號培養(yǎng)基；活化病原菌及抗菌活性篩選培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖(PDB)培養(yǎng)基、胰蛋白胨酵母(LB)培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)和腦心浸出液(BHI)培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)。陽性藥品試劑包括鹽酸萬古霉素(vancomycin hydrochloride)、青霉素G鈉(penicillin G sodium)和制霉菌素(nystatin)均為上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品，氯霉素(chloramphenicol)為阿拉丁試劑(上海)有限公司產(chǎn)品。

主要試劑包括瓊脂粉(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，冰醋酸、乙酸乙酯和甲醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，重鉻酸鉀(西隴科學(xué)股份有限公司)，細(xì)菌基因組提取試劑盒及PCR相關(guān)試劑(天根生化科技有限公司)，通用引物為北京六合華大基因科技有限公司合成。

主要設(shè)備包括潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，振蕩培養(yǎng)箱(上海旻泉儀器有限公司)，生化培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)，立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)，電子天平(杭州萬特衡器有限公司)，My Cycler PCR(美國BIO RAD)，CYY-7C電泳儀電源(北京市六一儀器廠)，水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 腸道解剖及腸道共生放線菌的分離與純化

將20頭喙尾琵琶甲成蟲裝入玻璃瓶置于-20℃冰箱30 min后，向玻璃瓶中加無菌水，搖晃2 min，清洗昆蟲表面。將清洗后的試蟲放在潔凈工作臺內(nèi)。每個樣品分別用3.5%次氯酸鈉溶液浸泡1 min, 75%乙醇浸泡3 min，消除昆蟲體表微生物，然后用無菌水反復(fù)沖洗，晾干。用無菌手術(shù)剪解剖蟲體，再使用無菌手術(shù)鑷將整個腸道取出置于滅菌的離心管內(nèi)。為了保證在解剖過程中腸道不受昆蟲表面細(xì)菌的干擾，將最后一次清洗昆蟲的無菌水均勻地涂抹在沒有添加K2Cr2O7的高氏一號瓊脂培養(yǎng)基上，在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)基上沒有任何微生物生長。

將20個腸道混為一個樣稱重后研磨，并用無菌水依次稀釋至10-6g/mL濃度，取10-2～ 10-6g/mL不同濃度的稀釋液各100 μL均勻涂布于含有35 mg/L K2Cr2O7的高氏一號培養(yǎng)基 (篩選放線菌)平皿上，每個濃度做3個平行實(shí)驗(yàn)，同時設(shè)培養(yǎng)基空白對照和無菌水對照。將平皿倒置于生化培養(yǎng)箱中，于28℃培養(yǎng)4 d后，每隔24 h開始觀察一次微生物生長情況，選擇最合適稀釋度的平板，通過菌落形態(tài)、大小、顏色、質(zhì)地、光澤、等特征，挑取不同的單菌落進(jìn)行分離。在不含抑制劑的高氏一號培養(yǎng)基平皿上進(jìn)行喙尾琵琶甲腸道共生放線菌的純化，直至獲得單一菌株。最后，將純化后的菌株接種至高氏一號培養(yǎng)基上再培養(yǎng)，用50%甘油將生長出來的放線菌制成菌液，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 腸道共生放線菌抗菌活性篩選

每株放線菌采取連續(xù)劃線法，擴(kuò)培10個平皿進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵，14 d后將長滿放線菌的培養(yǎng)基切成1 cm左右大小的方塊，使用乙酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸=80∶15∶5的配比液重復(fù)浸泡提取3次，減壓濃縮提取液獲得粗提物。采用牛津杯法(佘之蘊(yùn)等, 2016)檢測各菌株次生代謝產(chǎn)物粗提物的抗細(xì)菌活性：粗提物和陽性藥鹽酸萬古霉素、氯霉素、青霉素G鈉用甲醇依次調(diào)整為20 mg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL和150 μg/mL的濃度。將MRSA、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌接種在LB液體培養(yǎng)基，糞腸球菌接種在BHI液體培養(yǎng)基，在震蕩培養(yǎng)箱中以37℃ 180 r/min的條件培養(yǎng)4 h，調(diào)整菌體濃度為(3～5)×106CFU/mL的菌懸液。吸取100 μL菌懸液均勻涂布于對應(yīng)的LB和BHI瓊脂培養(yǎng)基平板上，用無菌鑷子將牛津杯(直徑8 mm)輕輕放置于平皿上，向其中加入100 μL的各菌株粗提物、對應(yīng)陽性藥及陰性對照甲醇。將平皿輕輕放于4℃冰箱中擴(kuò)散4 h左右后置于37℃下培養(yǎng)12 h觀察抑菌圈，測量并記錄抑菌圈直徑大小，每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

采用牛津杯法檢測各菌株次生代謝產(chǎn)物粗提物的抗真菌活性：粗提物、制霉菌素用甲醇依次調(diào)整為20和1 mg/mL的濃度。黑曲霉和青霉菌提前接種在PDA培養(yǎng)基上在28℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，實(shí)驗(yàn)前加入PDB培養(yǎng)基制備菌懸液；將白色念珠菌接種在PDB液體培養(yǎng)基中，在震蕩培養(yǎng)箱中以28℃ 200 r/min的條件培養(yǎng)4 h，調(diào)整菌體濃度為(3～5)×106CFU/mL的菌懸液。吸取100 μL菌懸液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基平皿上，用無菌鑷子將牛津杯 (直徑8 mm) 輕輕放置于平皿上，向其中加入100 μL的各菌株粗提物、制霉菌素及陰性對照甲醇。將平皿輕輕放于4℃冰箱中擴(kuò)散4 h左右后置于28℃下培養(yǎng)，24 h后觀察接種白色念珠菌的平皿上的抑菌圈，48 h后觀察接種青霉菌和黑曲霉平皿的抑菌圈，測量并記錄抑菌圈直徑大小，每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.5 腸道放線菌16S rRNA基因測序

根據(jù)抑菌圈大小篩選抗菌活性較強(qiáng)的放線菌。按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書步驟提取這些放線菌的DNA。使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′)和 1492R(5′-TACGGCTACCT TGTTACGACTT-3′)(Ballavetal., 2015)擴(kuò)增16S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系(30 μL): Super Mix 15 μL, 上下游引物(10 pmol/L)各1 μL, 模板DNA 1 μL, ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)程序: 96℃ 5 min; 96℃ 20 s, 62℃ 20 s, 72℃ 30 s, 共35個循環(huán)；72℃ 10 min。3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行基因測序。

1.6 腸道放線菌基于16S rRNA基因序列的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

測序后，將拼接好的16S rRNA基因序列結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast比對，下載與菌株同源性高的序列作為參照序列，并運(yùn)用MEGA 7 (Kumaretal., 2016)軟件采用鄰接(neighbor-joining)法(Saitou and Nei, 1987)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定各菌株種屬分類情況。最后將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 腸道放線菌菌株的分離和純化

從喙尾琵琶甲腸道中分離到共生放線菌176株，編號為BPA1-BPA175和BPA187，保存于大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室109室-80℃超低溫冰箱內(nèi)。

2.2 放線菌抗菌活性篩選

為了確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，每個平板都根據(jù)指示菌株設(shè)置了陽性藥組，陽性藥的抑菌圈直徑大小見表1。

表1 陽性藥對致病菌的抑菌圈直徑(mm)Table 1 Inhibition zone diameters (mm) of positive drugs against pathogenic bacteria

176株腸道共生放線菌中有25株放線菌對致病細(xì)菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用，其中14株對致病細(xì)菌顯示出較強(qiáng)的抑菌活性(抑菌圈直徑>15 mm)，菌株BPA2, BPA8, BPA49和BPA71具有廣譜抗細(xì)菌活性，對6株致病細(xì)菌均有抑制作用，其次為BPA44和BPA62，對銅綠假單胞菌之外的5株致病細(xì)菌均有抑制作用，而BPA14, BPA59, BPA134, BPA152, BPA160和BPA187僅對MRSA具有較強(qiáng)的抑菌作用，具體抑菌圈直徑如表2所示。 圖1(A-F)示使用牛津杯法部分喙尾琵琶甲腸道放線菌(BPA160, BPA71, BPA49和BPA62)粗提物抑制6株致病細(xì)菌。

在抗真菌的實(shí)驗(yàn)中，總共有37株放線菌表現(xiàn)出抑菌活性，具有顯著抗真菌活性(抑菌圈直徑>15 mm)的菌株共有11株。其中，BPA8對黑曲霉、青霉菌和白色念珠菌3種真菌均有顯著抑菌活性，BPA82對黑曲霉及白色念珠菌具有顯著抗菌活性，BPA46, BPA47, BPA59和BPA84 4株放線菌僅對白色念珠菌具有顯著抑制作用，而BPA49, BPA62, BPA71, BPA95和BPA100 5株放線菌僅對黑曲霉有較強(qiáng)的抑制作用，具體抑菌圈直徑如表3所示。圖1(G-I)示使用牛津杯法部分放線菌(BPA59, BPA62和BPA8)粗提物抑制3株致病真菌。

2.3 具有較強(qiáng)抗菌活性菌株的生長形態(tài)、分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹

綜合表2和表3可知，具有較強(qiáng)抗菌活性(抑菌圈直徑≥15 mm)的腸道放線菌共有18株，編號依次為BPA2, BPA8, BPA14, BPA44, BPA46, BPA47,BPA49, BPA59, BPA62, BPA71, BPA82, BPA84, BPA95, BPA100, BPA134, BPA152, BPA160和BPA187，生長形態(tài)見圖2。系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3) 表明， 具有顯著抗菌活性的放線菌均屬于鏈霉菌屬Streptomyces，其中具有廣譜抗菌活性的菌株BPA8與鏈霉菌(MH817402)及淡紫灰鏈霉菌S.lavendulae(MN540709)的16S rDNA序列一致性分別達(dá)99.73%和99.66%，BPA49與球孢鏈霉菌S.globisporus(MH384424)的序列一致性達(dá)99.72%，BPA71與沙阿霉素鏈霉菌S.zaomyceticus(EF063456)的序列一致性達(dá)99.93%。將18株放線菌序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為OL780327-OL780344。

表2 喙尾琵琶甲成蟲腸道中具有顯著抗菌活性的放線菌對致病細(xì)菌的抑菌圈直徑(mm)Table 2 Inhibition zone diameters (mm) of actinomycetes with significant antibacterial activitiesin the gut of Blaps rynchopetera adults

表3 喙尾琵琶甲成蟲腸道中具有顯著抗菌活性的放線菌對致病真菌的抑菌圈直徑(mm)Table 3 Inhibition zone diameters (mm) of actinomycetes with significantantifungal activities in the gut of Blaps rynchopetera adults

3 討論

和許多昆蟲一樣，喙尾琵琶甲腸道中存在許多具有抗菌活性的微生物幫助宿主抵御外來病原菌的入侵。在本研究中，其腸道放線菌的抗菌活性篩選對后續(xù)尋找明確的抗菌活性物質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義。許多研究者將不同昆蟲腸道微生物作為尋找新型抗菌物質(zhì)的重要來源之一。方霞等(2016)在藥用昆蟲美洲大蠊Periplanetaamericana的腸道中分離得到159株放線菌，分屬于12個屬9個科。隨后在美洲大蠊腸道放線菌活性篩選與鑒定的研究中，發(fā)現(xiàn)45株放線菌對白色念珠菌、紅色毛癬菌、黑曲霉、煙曲霉等人體常見致病真菌具有拮抗作用，其中鏈霉菌占比71.11%(曾還雄等, 2018)。此外，在甲蟲類昆蟲共生微生物的化學(xué)研究中也發(fā)現(xiàn)了一些結(jié)構(gòu)新穎的抗菌化合物，例如，從埋葬甲蟲腸道放線菌UTG9中分離到對革蘭陽性菌具有抗菌活性的氯代環(huán)肽(Shinetal., 2017)。

放線菌是微生物來源的臨床藥物的主要來源(任建委和杜寶中, 2020)。目前關(guān)于喙尾琵琶甲腸道微生物的研究還未見報道，本研究對20頭喙尾琵琶甲腸道的混合樣品中的放線菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得176株形態(tài)或代謝物顏色有差異的放線菌，說明該特色生境中可培養(yǎng)的放線菌資源比較豐富。但由于培養(yǎng)條件比較單一，難以模擬昆蟲腸道的環(huán)境，仍有大量未知放線菌未被分離培養(yǎng)，后續(xù)，我們可以采用不同的分離培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以期獲得更多的放線菌資源。

根據(jù)全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，MRSA在臨床中仍是檢出率最高的耐藥致病菌(全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng), 2021)。在本研究中，通過牛津杯瓊脂擴(kuò)散法篩選了176株腸道放線菌的代謝產(chǎn)物對9株常見致病菌的抗菌作用。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表2和3)，有23株放線菌顯示對MRSA致病菌有抑菌作用，26.1%的放線菌對致病菌具有不同程度的抑菌作用，18株放線菌的抑菌活性較為顯著(圖2)。通過16S rRNA測序和BLAST比對發(fā)現(xiàn)18株抗菌活性較強(qiáng)的菌株均隸屬于鏈霉菌屬(圖3)。鏈霉菌屬是最高等的放線菌，我們推測這些活性鏈霉菌可能會產(chǎn)生具有抗菌活性的天然物質(zhì)，從而有助于喙尾琵琶甲預(yù)防外來病原菌的定殖。本研究以9株常見致病菌為指示菌株，篩選到具有較強(qiáng)抗菌活性的鏈霉菌，為進(jìn)一步分離藥用昆蟲喙尾琵琶甲腸道放線菌的生物活性物質(zhì)打下基礎(chǔ)，也為抗菌藥物研發(fā)提供了新的放線菌資源。