桃蛀螟CYP6AE76基因參與對Cry1Ab蛋白的解毒作用

靜大鵬, 黃曉丹,2, 張?zhí)鞚? 王振營,*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室， 北京 100193;2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究所, 天敵昆蟲應(yīng)用技術(shù)工程研究中心， 長春 130118)

細(xì)胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase, CYP450)是廣泛存在于真核生物體內(nèi)的一類含有血紅色素單鏈蛋白基因組成的一個超家族(Werck-Reichhart and Feyereisen, 1999)，是多功能氧化酶系統(tǒng)中的重要組成部分，能夠同時活化氧分子和與底物結(jié)合(Field and Devonshire, 1998)，在昆蟲體內(nèi)參與了許多重要的生理過程(Coon, 2005)。CYP450氧化酶可參與殺蟲劑和植物次生物質(zhì)的代謝(Guengerichetal., 2001)，并可以降解殺蟲劑，提高昆蟲的抗藥性(Bagchietal., 2016)。根據(jù)序列同源性和相似程度，CYP450基因可以分為許多不同家族，但CYP6, CYP9, CYP12, CYP18和CYP28這5個基因家族為昆蟲所特有(Bergéetal., 1998)。而在昆蟲中已克隆鑒定出的序列中，CYP4和CYP6基因家族成員占到了總數(shù)的60%以上，且這兩個家族基因的過量表達(dá)被認(rèn)為是與其抗藥性相關(guān)(郭亭亭等, 2009)。隨著研究的深入，更多的研究發(fā)現(xiàn)CYP6基因在介導(dǎo)植物與昆蟲的相互作用中發(fā)揮了重要作用(Helvig, 2004; Jonesetal., 2011)。具體表現(xiàn)在CYP6家族基因可以降解和代謝多種植物內(nèi)源性化合物以及殺蟲劑(車燕飛等, 2014)，這對于多食性的害蟲而言就顯得更加重要(Lietal., 2007; Mittapellyetal., 2019)。

桃蛀螟Conogethespunctiferalis作為一種多食性的害蟲，其寄主十分廣泛，是我國多種果樹、經(jīng)濟(jì)作物以及玉米等農(nóng)作物上的重要害蟲(王振營等, 2006; 鹿金秋等, 2010)。迄今為止，化學(xué)殺蟲劑仍然是防治桃蛀螟最普遍的方法，但同時也對非靶標(biāo)害蟲、有益生物、人類健康和環(huán)境產(chǎn)生了負(fù)面影響。而轉(zhuǎn)蘇云金桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)殺蟲基因玉米的商業(yè)化應(yīng)用，為防治桃蛀螟防治提供了新策略。目前，雖已有很多研究報道了CYP6家族基因具有降解或者代謝殺蟲劑功能，但至今未有CYP6家族基因具有降解和代謝Bt蛋白功能的相關(guān)報道。而前期通過對多食性害蟲桃蛀螟和寡食性害蟲松蛀螟C.pinicolalis幼蟲轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出在桃蛀螟中差異表達(dá)的CYP6AE76，此基因可能在桃蛀螟取食多種寄主植物的解毒過程中發(fā)揮了重要作用?；诖?，本研究將通過RT-qPCR、RNAi和人工毒力測定等方法研究該基因在桃蛀螟幼蟲中對Cry1Ab蛋白的解毒功能，為多食性害蟲的防控提供一定的科學(xué)依據(jù)，同時也為研究CYP6家族基因與Bt家族中的Cry1Ab蛋白的關(guān)系提供一定數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

實(shí)驗所用的桃蛀螟采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊基地玉米雌穗中的幼蟲，在室內(nèi)溫度27±1℃、相對濕度70%～80%、光周期16L∶8D的條件下采用人工飼料進(jìn)行多代連續(xù)飼喂(Jingetal., 2021)。

1.2 CYP6AE76基因序列鑒定與分析

基于前期測得桃蛀螟幼蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRR12989228-SRR12989230)中篩選得到的CYP6AE76序列，并將序列使用NCBI在線BLASTP檢索NR庫后確認(rèn)序列的匹配程度及找到其開放閱讀框。其次，采用ExPASy在線網(wǎng)站(https:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測CYP6AE76基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)。

1.3 CYP6AE76基因在桃蛀螟幼蟲中的表達(dá)譜分析

分別收集桃蛀螟1齡幼蟲(50頭)、2齡幼蟲(30頭)、3齡幼蟲(10頭)、4和5齡幼蟲(各5頭)，為1個生物學(xué)重復(fù)，收集4齡幼蟲頭(5頭)、中腸(10頭)、血淋巴(20頭)和脂肪體(10頭)，為1個生物學(xué)重復(fù)，采用Trizol法(Invitrogen)進(jìn)行RNA提取，隨后將得到的RNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性并用核酸分析儀(NanoDrop 2000)檢測RNA質(zhì)量及濃度。采用全式金生物有限公司的TranScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(AT311)試劑盒并參照其說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-qPCR參照PrefectStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司，北京)說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系: PrefectStartTMGreen qPCR SuperMix 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, 50×ROX Reference Dye 0.4 μL, cDNA 模板1 μL, Nase-free Water 6.8 μL。擴(kuò)增程序: 94℃ 30 s; 94℃ 5 s, 60℃ 30 s, 共40個循環(huán)。引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，同時以RP49(楊苓等, 2017)為內(nèi)參基因(表1)。實(shí)驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)中進(jìn)行4次技術(shù)重復(fù)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 幼蟲取食Cry1Ab蛋白對CYP6AE76基因表達(dá)的影響

將4齡桃蛀螟幼蟲轉(zhuǎn)接到含有Cry1Ab蛋白(LC50=1.08 ng/cm2)人工飼料的24孔板中進(jìn)行飼喂，每孔放1頭幼蟲。同時，以未加Cry1Ab蛋白人工飼料飼養(yǎng)的幼蟲為對照，3 d后取存活的5頭幼蟲的中腸和20頭幼蟲的血淋巴為1個生物學(xué)重復(fù)，并提取總RNA，采用全式金生物有限公司的TranScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(AT311)試劑盒并參照其說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用RT-qPCR檢測CYP6AE76基因的表達(dá)水平(方法同1.3節(jié))。實(shí)驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 RNAi和干擾效果檢測

基于CYP6AE76的功能區(qū)序列設(shè)計特異性引物dsCYP6AE76-F和dsCYP6AE76-R，同時根據(jù)GFP(GenBank登錄號: AB062168.1)序列設(shè)計特異性引物dsGFP-F和dsGFP-R作為對照(表1)。dsRNA的合成方法參考T7 Ribo MaxTMExpress RNAi System 試劑盒說明書(Promega)進(jìn)行，最后dsRNA濃度調(diào)整為1 000 ng/μL備用。將人工飼料切成約0.3 cm3的小塊，分別放入24孔板中；隨后在飼料表面滴入2 μL的dsRNA, 空白對照以滴入無RNA酶的水替換dsRNA。取饑餓6 h桃蛀螟4齡幼蟲分別放入飼料表面讓其取食，并分別在幼蟲取食后不同時間段(0, 24, 48, 72, 96和120 h)取5頭幼蟲的中腸進(jìn)行RNA提取并合成cDNA，采用RT-qPCR對基因干擾效率進(jìn)行檢測(方法同1.3節(jié))。此外，為檢驗干擾CYP6AE76是否影響幼蟲的生長發(fā)育，分別測定了取食和未取食含有dsRNA飼料的幼蟲120 h后的存活個數(shù)并計算存活率及對存活幼蟲體重進(jìn)稱重并分析。

1.6 人工毒力測定

將初孵幼蟲轉(zhuǎn)接到分別含有dsCYP6AE76和dsGFP(陰性對照)的飼料中(方法同1.5節(jié))，并以未進(jìn)行dsRNA處理的初孵幼蟲作空白對照，飼喂2 d后再轉(zhuǎn)接到含有Cry1Ab蛋白(濃度為LC50=1.08 ng/cm2)的人工飼料中進(jìn)行飼喂(方法同1.4節(jié))，7 d后調(diào)查幼蟲成活情況并計算存活率，同時對存活幼蟲進(jìn)行稱重并分析。實(shí)驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗或單因素方差分析(one-way ANOVA)與LSD法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和比較。

2 結(jié)果

2.1 CYP6AE76的cDNA和氨基酸序列

CYP6AE76基因開放閱讀框長1 572 bp，經(jīng)過序列比對分析后發(fā)現(xiàn)桃蛀螟CYP6AE76與稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis的CYP6AE76(GenBank登錄號: CBB07053)的核苷酸序列一致性為62.72%，同源性最高，且該基因的開放性閱讀框編碼524個氨基酸，預(yù)測分子量大小為60.34 kD(圖1)。此外，與稻縱卷葉螟、煙草粉螟EphestiaelutellaCYP6AE76(GenBank登錄號: QZP43552)、東方粘蟲MythimnaseparataCYP6AE76(GenBank登錄號: QOI60672)和草地貪夜蛾SpodopterafrugiperdaCYP6AE76(GenBank登錄號: QGA73297)的氨基酸序列對比分析后，發(fā)現(xiàn)幾個物種均有CYP6A基因的典型特征序列：FxxGxxxCxG, ExxR和PxRF，且保守性較高。

2.2 CYP6AE76的表達(dá)譜

結(jié)果表明CYP6AE76在桃蛀螟不同齡期幼蟲中均有表達(dá)，但在1齡幼蟲中表達(dá)量最高(P<0.05)，并隨著幼蟲齡期的增長，其表達(dá)量逐漸降低(圖2: A)。在4齡幼蟲不同組織中，CYP6AE76在中腸中相對表達(dá)量最高(P<0.05)，其次是在血淋巴、脂肪體和頭部(圖2: B)。

2.3 幼蟲取食Cry1Ab后對CYP6AE76表達(dá)的影響

桃蛀螟4齡幼蟲取食含有Cry1Ab蛋白的飼料后，在蛋白LC50=1.08 ng/cm2濃度下會有約半數(shù)的幼蟲死亡，但在存活個體中CYP6AE76相比對照，其表達(dá)量在血淋巴和中腸中顯著上調(diào)(P<0.05)(圖3)，特別是在中腸的表達(dá)量變化最大。

2.4 CYP6AE76的RNAi干擾效果

與取食含有無RNase水的飼料(空白對照)和含dsGFP(陰性對照)的比較，桃蛀螟4齡幼蟲取食含有dsCYP6AE76的飼料后，其CYP6AE76基因表達(dá)量在24 h時顯著下調(diào)(P<0.05)(圖4: A)，說明合成的dsCYP6AE76可以有效抑制桃蛀螟幼蟲CYP6AE76的表達(dá)量。 但隨著時間推移， 其基因表達(dá)量又逐漸上升，并在處理后120 h與兩對照組的無顯著差異(圖4: A)。而幼蟲取食dsGFP處理后的飼料后，體內(nèi)CYP6AE76基因表達(dá)量與飼喂水的空白對照相比未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。此外，幼蟲取食含有dsCYP6AE76和dsGFP的人工飼料后，幼蟲存活率(圖4: B)和平均體重 (圖4: C)與兩對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

2.5 RNAi干擾CYP6AE76對桃蛀螟幼蟲Cry1Ab 蛋白解毒能力的影響

當(dāng)桃蛀螟初孵幼蟲取食含有dsCYP6AE76和dsGFP(對照)的飼料后，再取食含有Cry1Ab 蛋白的人工飼料，其存活率與對照相比雖有下降，但差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)(圖5: A)，但平均體重與對照相比極顯著下降(P<0.01)(圖5: B)。而結(jié)合2.4節(jié)中結(jié)果，僅干擾CYP6AE76基因飼喂不含有Cry1Ab蛋白的人工飼料，并不會影響桃蛀螟幼蟲的存活率和體重。綜上所述，說明當(dāng)CYP6AE76基因受到干擾時，桃蛀螟幼蟲取食含有Cry1Ab的人工飼料后，其體重增長會受到明顯的抑制。

3 討論

本研究基于桃蛀螟幼蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過同源性搜索對比獲得并初步解析了桃蛀螟CYP6AE76的功能。CYP450家族基因在昆蟲體內(nèi)表達(dá)和分布具有多樣性(張雅男, 2019)。袁星星等(2021)通過對桃蛀螟體內(nèi)CYP4G113的研究后發(fā)現(xiàn)，該基因在桃蛀螟各發(fā)育階段均有表達(dá)，其中1齡幼蟲期表達(dá)量最高，5齡幼蟲中表達(dá)量最低，這一結(jié)果與本研究中桃蛀螟CYP6AE76基因在幼蟲各個齡期表達(dá)結(jié)果(圖2)一致。其原因可能是桃蛀螟初孵幼蟲需要CYP6AE76或者CYP4G113基因高度表達(dá)以迅速適應(yīng)寄主植物中的次生代謝物質(zhì)，以建立起代謝或者解毒功能的應(yīng)激式的反應(yīng)。但隨著后期齡期的增長，幼蟲逐漸對這些次生代謝物質(zhì)不再敏感，故其表達(dá)量會逐漸降低。其次，研究發(fā)現(xiàn)CYP6家族基因在中腸組織中高度表達(dá)，這主要與其解毒功能密切相關(guān)(Krempletal., 2016; Shietal., 2018)。本研究中，CYP6AE76在桃蛀螟中腸中高度表達(dá)(圖2)，而中腸作為幼蟲食物消化代謝的主要場所，也是其發(fā)揮解毒功能的主要場所，Cry類Bt蛋白主要也是通過與中腸上的受體結(jié)合產(chǎn)生殺蟲功能。此外，稻縱卷葉螟的CYP6AE76基因在脂肪體和馬氏管中高度表達(dá)，這被推測該基因在調(diào)節(jié)發(fā)育和衰老中也發(fā)揮了作用(Lietal., 2014; Liuetal., 2014)，具體功能還需深入探究。

CYP6家族基因在昆蟲體內(nèi)可參與殺蟲劑抗性，其表現(xiàn)為抗性品系中CYP6基因或蛋白質(zhì)表達(dá)水平增加，從而使CYP6的解毒作用增強(qiáng)(Feyereisenetal., 2015; Modi and Dawson, 2015; Wangetal., 2018)，但目前未有CYP6家族基因可以參與代謝體內(nèi)Bt蛋白的相關(guān)報道。本研究中，桃蛀螟幼蟲取食含有Cry1Ab蛋白的人工飼料后，其血淋巴和中腸中的CYP6AE76會顯著上調(diào)(圖3)，說明幼蟲取食Cry1Ab蛋白后可以導(dǎo)致體內(nèi)CYP6AE76基因表達(dá)量上調(diào)。RNAi技術(shù)用于沉默該基因的表達(dá)，實(shí)驗表明沉默CYP6AE76基因不會對桃蛀螟幼蟲的存活率(圖4: B)和體重(圖4: C)產(chǎn)生顯著影響，且使用dsCYP6AE76基因進(jìn)行干擾，能夠有效抑制幼蟲體內(nèi)CYP6AE76基因的表達(dá)量(圖4: A)，而引入外源的GFP基因?qū)τ紫x的存活率和體重?zé)o影響(圖4: B, C)。此外，當(dāng)沉默CYP6AE76基因的表達(dá)量后，發(fā)現(xiàn)桃蛀螟初孵幼蟲取食Cry1Ab蛋白后的存活率并未有顯著降低(圖5: A)，但是體重卻顯著受到抑制(圖5: B)。這可能是由于CYP6AE76基因的下調(diào)導(dǎo)致了其體內(nèi)解毒功能的下降，影響了幼蟲對Cry1Ab蛋白的解毒功能，進(jìn)而影響幼蟲取食并導(dǎo)致體重顯著下降。

昆蟲中腸上能夠結(jié)合Cry1Ab蛋白的特異性受體主要有氨肽酶N(aminopeptidases N, APN)、鈣黏蛋白(cadherin, CAD)、堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase, ALP)和腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)(Jurat-Fuentesetal., 2021)，而Cry1Ab蛋白與這些特異性受體結(jié)合后會形成晶體破壞幼蟲中腸細(xì)胞并引發(fā)敗血癥而死亡(Brodericketal., 2006; Masonetal., 2011)。因此，特異性受體與Cry1Ab蛋白的結(jié)合能力是決定桃蛀螟幼蟲的存活率的一個重要原因，而CYP6AE76僅是幼蟲體內(nèi)的解毒基因之一，故僅干擾CYP6AE76不能顯著影響幼蟲取食Cry1Ab蛋白后的存活率。但Cry1Ab蛋白進(jìn)入昆蟲中腸后，作為重要的解毒蛋白，也會發(fā)揮其解毒功能，故在LC50濃度Cry1Ab蛋白作用下，有一半的幼蟲得以存活。但當(dāng)干擾CYP6AE76基因的表達(dá)時，相較于對照，桃蛀螟幼蟲的體重明顯降低(圖5: B)，說明該基因的解毒功能也受到了抑制，從而間接影響了幼蟲的取食，導(dǎo)致其體重降低。

本研究報道了桃蛀螟CYP6AE76基因?qū)ry1Ab蛋白有解毒作用，表明該基因可作為其幼蟲在代謝Cry1Ab蛋白中的一個關(guān)鍵作用的基因，可抑制幼蟲的取食和生長，以減少幼蟲為害。這對于監(jiān)測桃蛀螟幼蟲對Cry1Ab的抗性以及未來使用或研發(fā)新的化學(xué)制劑來防控其敏感或抗性種群將至關(guān)重要。