反式肉桂酸對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原性及結(jié)構(gòu)的影響

席冠鵬，布冠好，常永鋒，王美月

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

大豆，作為重要的糧食與油料作物，是人們主要的食物來源之一。大豆蛋白是從低溫脫脂豆粕中提取的優(yōu)質(zhì)植物性蛋白，不僅含有豐富的營養(yǎng)，而且功能特性眾多，在食品加工行業(yè)的應(yīng)用極其普遍。隨著應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，大豆過敏反應(yīng)也增多，就嬰幼兒而言，全世界對(duì)大豆過敏的嬰幼兒占總數(shù)的1%～6%[1]。大多數(shù)情況下，大豆蛋白在人體內(nèi)會(huì)引起由特異性免疫球蛋白 E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，從而引發(fā)胃腸道紊亂，哮喘、剝落性皮炎等癥狀，甚至可以導(dǎo)致昏迷和死亡。β-伴大豆球蛋白既是貯藏蛋白，也是最早被發(fā)現(xiàn)和公認(rèn)的致敏蛋白，約占大豆蛋白總量的30%[2]。有研究表明，β-伴大豆球蛋白的3個(gè)亞基（α'、α和β）均具有致敏性[3]。因此，尋找一種有效的方法來降低其過敏性極其重要。

如今，多酚是一類天然生物活性物質(zhì)，存在廣泛，如植物源性食品飲料、化妝品和營養(yǎng)保健品配方等。多酚是具有多個(gè)酚羥基的次生代謝物，基本碳架結(jié)構(gòu)為2-苯基苯并吡喃，因此具有多種生物學(xué)特性，比如抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌等[4]。近年來，大分子與小分子間的相互作用逐漸引起了研究者的興趣，尤其是作為食品重要成分的蛋白質(zhì)和多酚。研究表明，多酚的加入可以改變大豆蛋白的結(jié)構(gòu)、功能特性和營養(yǎng)價(jià)值[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，茶多酚與大豆蛋白之間的氫鍵鍵合和疏水相互作用改變了大豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，改善了蛋白溶液的溶解度、乳化穩(wěn)定性等功能性[5]?；ㄇ嗨嘏c大豆分離蛋白的結(jié)合誘導(dǎo)了蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而改善其穩(wěn)定性和消化特性[6]。另外表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）可以降低大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）的致敏性并提高其抗氧化性[7]。

肉桂酸又稱桂皮酸，是從肉桂皮分離出的有機(jī)酸，具有殺菌、抗氧化、抗炎等生理活性[8-9]，可用于水果防腐保鮮，是無公害的環(huán)保防腐劑[10]，也可用于蜜餞改善口感風(fēng)味。Li等[11]發(fā)現(xiàn)肉桂酸使β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，并明顯改變蛋白的表面疏水性。張馳等[12]研究不同pH值下反式肉桂酸（trans-cinnamic acid，TCA）對(duì)花生蛋白（peanut protein，PP）致敏性的影響。結(jié)果表明，TCA-PP復(fù)合物在pH11時(shí)致敏性明顯下降。然而，關(guān)于肉桂酸對(duì)大豆蛋白過敏原的影響研究較少。因此，本文將探究TCA與β-伴大豆球蛋白的相互作用，并研究蛋白免疫活性及結(jié)構(gòu)特性的變化，為建立有效的大豆蛋白過敏原脫敏方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HRP-羊抗兔 IgG（A6154）：美國 Sigma公司；兔抗β-伴大豆球蛋白血清：鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心自制；10條β-伴大豆球蛋白表位多克隆抗體（polyclonal antibody，PA）：北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司；反式肉桂酸、牛血清白蛋白、單組分 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液：北京索萊寶科技有限公司；凝膠電泳試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-10000C高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；LRH-150F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；LGJ-25C冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；DYY-6D型電泳儀：北京市六一儀器廠；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)：美國Varian公司；WQF-510傅里葉紅外光譜儀、Multiskan FC型酶標(biāo)儀：美國賽默飛世爾儀器有限公司；ZW-A微量振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-伴大豆球蛋白的制備

參照Li等[13]的方法制備β-伴大豆球蛋白。

1.3.2 β-伴大豆球蛋白-TCA復(fù)合體系的構(gòu)建

稱取0.5 g β-伴大豆球蛋白溶解于50 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）備用。稱取一定質(zhì)量TCA溶解于一定體積蒸餾水中，稀釋至6個(gè)不同濃度。等體積混合β-伴大豆球蛋白和各濃度TCA溶液，使TCA終濃度分別為 4、8、12、16、20、24 mmol/L?；靹蚝笥?2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至9.0，恒溫25℃攪拌1 d，使TCA與蛋白發(fā)生相互作用。然后使用3 500 kDa透析袋于4℃生化培養(yǎng)箱中透析2 d，每4 h更換去離子水，去除未結(jié)合的TCA。最后冷凍干燥，獲得復(fù)合物。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定抗原性

采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法測(cè)定樣品抗原性。蛋白樣品用包被液（50 mmol/L、pH9.6）稀釋至 0.5 μg/mL，酶標(biāo)板中每孔包被100 μL，樣品與兔抗血清（稀釋比1∶3 200）1∶1等體積混合，4℃反應(yīng)12 h。設(shè)置空白對(duì)照組（僅含有血清）。反應(yīng)結(jié)束后，200 μL/孔加入洗滌液，用微量振蕩器洗滌3 min后傾去孔內(nèi)溶液并拍干，重復(fù)4次。洗滌后酶標(biāo)板加入250 μL/孔封閉液，37℃孵育2 h后洗滌。隨后，酶標(biāo)板中加入100 μL/孔的兔抗血清，37℃孵育1 h后洗滌。洗滌后酶標(biāo)板加入100 μL/孔的 HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG（1∶20 000稀釋），37℃孵育1 h后洗滌拍干。每孔加入100 μL的單組分TMB顯色液，37℃孵育10 min后加入50 μL/孔的終止液（2 mol/L H2SO4）。最后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm和620 nm處的吸光度（A），吸光度A=A450-A620。樣品的IgG結(jié)合能力用抑制率表示（%），計(jì)算公式如下。

式中：A為樣品吸光度；A0為空白對(duì)照組吸光度。抑制率越低表明樣品的IgG結(jié)合能力越低，抗原性越低。

1.3.4 復(fù)合物與表位抗體的結(jié)合能力

采用間接ELISA法檢測(cè)TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白與表位抗體結(jié)合能力的影響。首先采用方陣滴定法確定β-伴大豆球蛋白與10個(gè)表位抗體的最適反應(yīng)條件。用50 mmol/L碳酸鹽緩沖溶液將β-伴大豆球蛋白稀釋至合適濃度，100 μL/孔加入酶標(biāo)板，4℃ 反應(yīng)12 h。一定稀釋度的表位抗體與樣品蛋白溶液等體積混合后4℃反應(yīng)12 h。后續(xù)試驗(yàn)步驟參照1.3.3的方法，抑制率與表位抗體的結(jié)合能力成正比。

1.3.5 SDS-PAGE測(cè)定分子量分布

參照Luo等[14]的方法對(duì)樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.6 紫外吸收光譜分析

樣品溶液用磷酸鹽緩沖溶液（pH7.4）稀釋至0.2 mg/mL，使用紫外分光光度計(jì)掃描蛋白溶液。波長范圍200 nm～400 nm，狹縫寬度2 nm，波長間隔為1 nm。

1.3.7 紅外光譜分析

使用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行分析，利用Peak fit 4.12軟件擬合并計(jì)算樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。

1.3.8 熒光光譜分析

將樣品濃度配制成0.2 mg/mL，在激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長300 nm～500 nm條件下測(cè)定其內(nèi)源熒光。

用磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L、pH7.4）稀釋樣品至5 mg/mL，再稀釋成6個(gè)梯度。樣品溶液（4 mL）與ANS溶液（80 mmol/L、20 μL）混勻。測(cè)定熒光強(qiáng)度（390 nm激發(fā)波長及470nm發(fā)射波長）來進(jìn)行表面疏水性測(cè)定。用熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)量濃度擬合所作曲線的初始斜率表示表面疏水性指數(shù)。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 2.0和Origin 2021軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原性的影響

不同濃度TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白復(fù)合物的抗原抑制率影響見圖1。

圖1 TCA不同濃度對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原性的影響Fig.1 Effects of different amounts of TCA on the antigenicity of β-conglycinin

由圖1可知，不同濃度TCA與β-伴大豆球蛋白結(jié)合后均降低了蛋白抗原性。β-伴大豆球蛋白在TCA濃度為4 mmol/L時(shí)顯示出最低的抗原性（46.62%），與未處理蛋白（76.15%）相比，降低了38.78%，且隨著TCA濃度的增加，蛋白抗原性并沒有進(jìn)一步降低反而有所升高，這可能是蛋白與TCA結(jié)合后，自身結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，導(dǎo)致原來在空間內(nèi)部的抗原表位暴露，抗原性上升。

2.2 TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白與表位抗體結(jié)合能力的影響

不同TCA濃度下β-伴大豆球蛋白與表位抗體的結(jié)合能力見圖2。

圖2 不同TCA濃度下β-伴大豆球蛋白與表位抗體的結(jié)合能力Fig.2 The binding ability of β-conglycinin with epitope antibodies at different concentrations of TCA

為進(jìn)一步研究TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原表位的影響，使用10種主要線性表位多克隆抗體（polyclonal antibody，PA）來評(píng)估蛋白與表位抗體結(jié)合能力變化。由圖2可知，與未處理β-伴大豆球蛋白相比，與TCA相互作用后β-伴大豆球蛋白與表位多克隆抗體PA-1、PA-6的結(jié)合能力增強(qiáng)，而與PA-2、PA-3、PA-4、PA-5、PA-9和PA-10的結(jié)合能力受到不同程度的抑制，當(dāng)TCA濃度為4 mmol/L時(shí)，蛋白與PA-2和PA-9的結(jié)合能力抑制最為明顯。相反，隨著TCA濃度的增加，β-伴大豆球蛋白與PA-1的結(jié)合能力顯著增強(qiáng)。這可能是因?yàn)門CA的添加使β-伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其構(gòu)象表位被破壞，但同時(shí)會(huì)暴露出新的線性抗原表位。

2.3 復(fù)合物的分子量分布

圖3為不同濃度TCA與β-伴大豆球蛋白復(fù)合物的SDS-PAGE電泳圖。

圖3 TCA不同濃度復(fù)合物的SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of complexes with different additions of TCA

SDS-PAGE可以看出蛋白的分子量分布，從圖3可以看出，α'亞基（約 71 kDa）和α亞基（約67 kDa）隨著TCA濃度的增加，復(fù)合物的亞基條帶顏色減弱，β亞基（約50 kDa）沒有明顯變化，而在55 kDa處條帶顏色加深。李楊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，花青素添加濃度較小時(shí)，SPI存在兩條明顯的亞基條帶（63 kDa～75 kDa和20 kDa～35 kDa），隨著花青素濃度的增加，條帶逐漸消失，而出現(xiàn)超高分子質(zhì)量亞基與色散帶，在TCA濃度為1 mg/mL時(shí)該現(xiàn)象最明顯，超高分子量亞基的出現(xiàn)可能是蛋白質(zhì)不同亞基之間發(fā)生聚合形成大分子亞基；而在Rawel等[16]的試驗(yàn)結(jié)果中未觀察到堿性多肽亞基（20 kDa）的減少，這可能是因?yàn)槲磳?duì)多酚添加質(zhì)量濃度進(jìn)行探究。

2.4 TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白紫外吸收光譜的影響

不同TCA濃度下β-伴大豆球蛋白的紫外吸收光譜見圖4。

圖4 不同TCA濃度下β-伴大豆球蛋白的紫外吸收光譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of β-conglycinin at different concentrations of TCA

紫外吸收光譜能夠反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[17]。紫外吸收光譜中β-伴大豆球蛋白的最大吸收波長（λx）在 270 nm左右，主要取決于色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）殘基的紫外吸收特性。由圖4可知，與未處理蛋白相比，TCA的添加并沒有使β-伴大豆球蛋白紫外吸收光譜的λx發(fā)生明顯變化。此外，隨著TCA的添加，β-伴大豆球蛋白的吸光度均有增加，這可能是由于復(fù)合物蛋白的空間結(jié)構(gòu)打開，芳香族氨基酸暴露出來，Trp、Tyr和Phe的含量增多[18]。

2.5 TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白紅外吸收光譜的影響

不同TCA濃度下β-伴大豆球蛋白的傅里葉紅外光譜見圖5。

圖5 不同TCA濃度下β-伴大豆球蛋白的傅里葉紅外光譜Fig.5 Fourier transform infrared spectroscopy of β-conglycinin at different concentrations of TCA

通過傅里葉紅外光譜法研究TCA與β-伴大豆球蛋白復(fù)合物，并分析對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。蛋白特征吸收區(qū)為酰胺I帶（1 700 cm-1～1 600 cm-1）和酰胺II帶（1 550 cm-1～1 530 cm-1），主要由 C=O 伸縮振動(dòng)引起的，可能和N-H彎曲、C-N拉伸有關(guān)[19-20]。如圖5所示，添加TCA后，β-伴大豆球蛋白的酰胺I、II帶位置均未發(fā)生偏移，但其吸光度有所變化，可能是蛋白結(jié)構(gòu)改變?cè)斐傻腫21]。復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量分析結(jié)果見圖6。

圖6 不同TCA濃度下β-伴大豆球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量圖Fig.6 Secondary structure content of β-conglycinin at different concentrations of TCA

在β-伴大豆球蛋白中β-折疊是主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)，添加TCA后，二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊含量減少，β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲含量增加。在蛋白與多酚的相互作用中，相關(guān)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律的結(jié)論不一。在花生蛋白與咖啡酸、槲皮素相互作用中，咖啡酸、槲皮素導(dǎo)致花生蛋白中的無規(guī)則卷曲含量減少，使花生蛋白質(zhì)的構(gòu)象更加致密[12]。這可能是由于多酚與蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化及兩者的結(jié)合方式不同，從而導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同的變化。

2.6 TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白熒光光譜的影響

2.6.1 TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白內(nèi)源熒光的影響

不同TCA濃度下β-伴大豆球蛋白的熒光光譜見圖7。

圖7 不同TCA濃度下β-伴大豆球蛋白的熒光光譜Fig.7 Fluorescence spectra of β-conglycinin at different concentrations of TCA

熒光光譜法是研究受體與配體相互作用的常見方法，蛋白質(zhì)所具有的固有發(fā)射熒光主要來自于Trp與Tyr殘基[22]。且它們的熒光發(fā)射光譜會(huì)因處于不同的溶劑條件而發(fā)生改變[23]。如圖7所示，TCA與β-伴大豆球蛋白結(jié)合使得β-伴大豆球蛋白的熒光強(qiáng)度下降，這表明TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白具有熒光猝滅作用，并且TCA添加濃度越高，β-伴大豆球蛋白的熒光猝滅現(xiàn)象越明顯。說明猝滅效果與TCA的濃度有較強(qiáng)的相關(guān)性[24]。此外，在復(fù)合物中觀察到熒光光譜輕微的紅移，因此認(rèn)為TCA能夠使蛋白質(zhì)主肽鏈得到舒展，空間結(jié)構(gòu)破壞，使得掩埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部的Trp與Tyr殘基暴露出來。

2.6.2 TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白表面疏水性的影響

圖8為不同濃度TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白表面疏水性的影響。

圖8 不同濃度TCA對(duì)β-伴大豆球蛋白表面疏水性的影響Fig.8 Surface hydrophobicity of the interaction between different concentrations of TCA and β-conglycinin

由圖8可知，TCA濃度越大，表面疏水性越低，在TCA添加濃度為24 mmol/L時(shí)急劇下降。這表明β-伴大豆球蛋白中TCA的引入使其表面呈現(xiàn)出親水性，這也進(jìn)一步說明TCA與β-伴大豆球蛋白結(jié)合使β-伴大豆球蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。蛋白表面疏水性下降可能是在堿性條件下，TCA被氧化形成醌，醌與蛋白多肽鏈上的Trp與Tyr殘基發(fā)生親核反應(yīng)，從而減少了蛋白多肽鏈上的疏水基團(tuán)，因而呈現(xiàn)出更加親水的特征[25]。另外，由于TCA的添加改變了β-伴大豆球蛋白的構(gòu)象，一定程度上使得掩埋于蛋白內(nèi)部的親水區(qū)域暴露，這可能也是復(fù)合蛋白表面疏水性降低的一個(gè)原因[26]。同樣的結(jié)果在豌豆分離蛋白和綠原酸的相互作用中被發(fā)現(xiàn)，綠原酸與豌豆分離蛋白的交聯(lián)使得蛋白的表面疏水性下降[27]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究堿性條件下不同TCA濃度對(duì)β-伴大豆球蛋白免疫特性及結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，在堿性條件下TCA降低了蛋白的抗原性，明顯改變了蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)及表面疏水性。本研究為大豆蛋白過敏原的脫敏提供方法，為有效降低食品中大豆制品的致敏性提供理論依據(jù)。