葛根素對骨癌痛大鼠的治療效果作用機(jī)制研究

曹媛媛，楊荷雨，朱海麗（通訊作者）

（湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院 湖北 咸寧 437100）

骨癌痛是晚期癌癥患者的常見癥狀之一，對患者的日常功能狀態(tài)和生活質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。

骨癌痛主要表現(xiàn)為痛覺過敏和觸誘發(fā)痛，常規(guī)藥物治療難以達(dá)到理想的治療效果，尋找新的治療骨癌痛的藥物具有重大的意義。葛根素（Puerarin）是從葛屬的幾種豆科植物葛根的根和野葛根中分離出來的生物活性成分，其在慢性縮窄性損傷、糖尿病性神經(jīng)病變及紫杉醇誘發(fā)的化療神經(jīng)痛等多種病理性疼痛中具有較好的鎮(zhèn)痛作用。然而，當(dāng)前葛根素的鎮(zhèn)痛機(jī)制尚不明確。為明確葛根素在癌痛中作用及機(jī)制，本研究構(gòu)建了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛（cancer-induced bone pain，CIBP）小鼠模型，并給予小鼠葛根素鞘內(nèi)給藥，檢測其行為學(xué)及脊髓炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)變化，從而為葛根素作為鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)提供思路。

1.材料和方法

1.1 實驗動物和細(xì)胞

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(180 ～200 g)購自湖北省實驗動物中心，實驗動物合格證號：42000600043734，在12/12 h 光/暗循環(huán)、恒濕的空調(diào)房間中，并提供適量的食物和水。大鼠乳腺癌細(xì)胞MRMT-1購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，來源RCB。本研究所有動物實驗均經(jīng)湖北科技學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：2020-01-900）。

1.2 實驗藥物與試劑

葛根素購于上海源葉生物科技有限公司，貨號：S02M9B54875，純度超過98%。動物組織裂解液，SDSPAGE 凝膠快速配制試劑盒，BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗NLRP3（A12694），兔抗Caspase-1（A0964），兔抗GFAP（A19058），兔抗IL-1β（A1112），購自武漢愛博泰克（ABclonal）公司，鼠抗NF-κB（BF8005），β-actin（AF7018）購自Affinity 公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗購自ABclonal 公司。迷你手持均質(zhì)儀（北京蘭杰柯科技有限公司），微型垂直電泳儀（北京韋克斯科技有限公司），多功能微孔酶標(biāo)儀(美國BioTek 公司)，iBright 顯影儀（美國invitrogen 公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國GE 公司）,速冷凍離心機(jī)（德國eppendorf 公司）。

1.3 模型建立及分組處理

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（Sham）、模型組（CIBP）和給藥組（CIBP+Puerarin），每組各6只。MRMT-1 在含有10%胎牛血清在RPMI1640 中培養(yǎng)，50 U/mL 青霉素和50 μg/mL 鏈霉菌素在37 ℃含有5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集乳腺癌細(xì)胞MRMT-1 細(xì)胞并將其重懸于Hank 的平衡鹽溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）中，置冰上備用。脛骨內(nèi)注射MRMT-1大鼠乳腺癌細(xì)胞建立乳腺癌CIBP 模型。假手術(shù)組接種同等體積生理鹽水；給藥組在CIBP 模型建立第14 天后大鼠鞘內(nèi)給藥5 mg/kg 葛根素，注射具體方法如下：大鼠左后肢剃毛并乙醇消毒，采用適量的戊巴比妥鈉麻醉，在左脛骨中鉆孔，模型組和給藥組使用無菌微量注射器向小鼠左脛骨的髓腔緩慢注入大鼠乳腺癌細(xì)胞懸液（3.5×10個），縫合并消毒。

1.4 自發(fā)縮足次數(shù)（Flinches）記錄與機(jī)械痛閾值（PWT）檢測

讓SD 大鼠放于30 cm×30 cm×30 cm 的透明盒內(nèi)，開始實驗前，將大鼠在玻璃盒內(nèi)適應(yīng)30 min，觀察并記錄每5 min 內(nèi)大鼠自發(fā)性縮足（或舔爪）次數(shù)，出現(xiàn)舔足或者縮足等行為視為陽性反應(yīng)，記錄3 次，計算其縮足次數(shù)平均值。使用von Frey 纖維測定PWT。每次測試前，將大鼠置于透明盒中至少30 min 以適應(yīng)環(huán)境。von Frey 細(xì)絲垂直于左后爪中心刺穿，維持至少5 s。爪子突然退縮或舔足認(rèn)為是陽性，反之則為陰性。記錄6 次數(shù)據(jù)后結(jié)束檢測。根據(jù)公式50% PWT（g）=（10）/10 000 計算各組大鼠縮足閾值。

1.5 轉(zhuǎn)棒運動實驗

正式實驗開始前每天將大鼠放于大鼠轉(zhuǎn)棒疲勞儀上以勻速5 r/min 的速度適應(yīng)10 min，休息30 min，重復(fù)3 次。正式實驗時以10 r/min 運動10 s，勻加速10 s，以10 r/min 運動30 s，勻加速10 s，以20 r/min 運動9 min。然后記錄大鼠運動的距離（Distance）和在轉(zhuǎn)棒上停留的時間（Latency）。

1.6 免疫印跡法

通過戊巴比妥鈉麻醉，脊髓腰段用RIPA 緩沖液加蛋白酶和磷酸酶抑制劑在冰上裂解；組織在4 ℃，以12 000 rpm/min，離心20 min。取上清液加buffer 煮樣，用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。用聚丙烯酰胺凝膠分離等質(zhì)量的蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上1 h。在室溫下用TBST 配的5%脫脂牛奶封閉膜1 h，然后在4 ℃下與相應(yīng)的一抗孵育過夜，與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）二抗（1:10 000）在室溫孵育1 小時，灰度值通過Image J軟件進(jìn)行量化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 葛根素會緩解大鼠骨癌痛行為

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠自發(fā)性縮足次數(shù)顯著增加，縮足痛閾值明顯降低，轉(zhuǎn)棒運動距離減少及停留時間下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。表示CIBP大鼠痛覺過敏及運動能力受損。鞘內(nèi)給予葛根素后發(fā)現(xiàn)，大鼠自發(fā)縮足次數(shù)減少，機(jī)械痛閾值升高，運動距離增長和停留時間增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），見圖1。表明葛根素給藥可顯著改善骨癌痛模型大鼠的痛覺運動行為。

圖1 葛根素對骨癌痛大鼠行為學(xué)的影響（n=6）

2.2 葛根素抑制脊髓組織NF-κB/NLRP3/Caspasse-1信號通路

免疫印跡發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓核因子κB（NF-κB）、NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）表達(dá)水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；給藥后NF-κB、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05 vs 模型組），見圖2、表1。

圖2 葛根素對骨癌痛大鼠脊髓炎癥信號通路表達(dá)的影響

表1 葛根素對骨癌痛大鼠脊髓炎癥蛋白相對表達(dá)水平（± s）

2.3 葛根素抑制脊髓GFAP/IL-1β 表達(dá)

免疫印跡發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比較，模型組脊髓組織GFAP、IL-1β 含量表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；葛根素給藥后GFAP、IL-1β 含量表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），見圖3、表2。

圖3 葛根素對骨癌痛大鼠脊髓炎癥蛋白表達(dá)的影響

表2 葛根素對骨癌痛大鼠脊髓炎癥蛋白相對表達(dá)水平（± s）

3.討論

CIBP 的病理特征包括神經(jīng)炎癥，表現(xiàn)為白細(xì)胞浸潤增加，膠質(zhì)細(xì)胞激活，促炎介質(zhì)增加。NLRP3 炎癥小體通過介導(dǎo)Caspase-1 激活和促炎細(xì)胞因子IL-1β 分泌參與疼痛病理。在患有纖維肌痛（一種慢性疼痛）的患者血液中也發(fā)現(xiàn)了NLRP3 和IL-1β 的表達(dá)增加。NLRP3的激活和上調(diào)介導(dǎo)了大鼠的疼痛狀態(tài)。特異性NLRP3拮抗劑治療可減輕癌癥誘導(dǎo)骨痛嚙齒動物模型和奧沙利鉑誘導(dǎo)周圍神經(jīng)病變模型中的機(jī)械性痛覺異常，并將脊髓中NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 的表達(dá)水平恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。

在腦缺血再灌注損傷模型中，葛根素通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及多種促炎癥因子。在高血糖相關(guān)心血管疾病模型中，葛根素給藥抑制高葡萄糖誘導(dǎo)的NLRP3 炎性體形成并減少隨后的Caspase-1活化，從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞中，葛根素給藥抑制了NF-κB 的核易位，從而降低促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。在心肌缺血/再灌注損傷模型中，葛根素顯著降低了TNF-α、IL-6 和IL-1β的mRNA 和蛋白水平，并降低了NF-κB、NLRP3、切割的Caspase-1、切割的IL-1β 和切割的IL-18 的蛋白質(zhì)水平。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞注射脛骨14 d 后的大鼠自發(fā)縮足次數(shù)增加，機(jī)械痛閾值下降，運動能力受損，NF-κB、NLRP3、Caspase-1、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP 和IL-1β 蛋白表達(dá)水平均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。葛根素鞘內(nèi)給藥后減少大鼠自發(fā)縮足次數(shù)，增加機(jī)械痛閾值，轉(zhuǎn)棒停留時間及運動距離增長，NF-κB、NLRP3、Caspase-1、GFAP 和IL-1β 蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。提示葛根素給藥明顯降低了CIBP 大鼠脊髓中NF-κB、NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白的表達(dá)，并緩解痛覺行為。因此，葛根素可作為CIBP 大鼠的有效輔助療法，延緩疼痛癥狀。

綜上所述，葛根素可降低NF-κB 介導(dǎo)的炎癥信號并發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)，可作為骨癌痛的鎮(zhèn)痛藥物。