透邪解毒湯對脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的干預(yù)效果及機(jī)制研究※

占嬈娜 黃桂瓊 陳 洪 袁維蔚 姚志強(qiáng) 楊荃懷 凌家生

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)2020級碩士研究生，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)惠州醫(yī)院肺病科，廣東 惠州 516001；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)惠州醫(yī)院脾胃病科，廣東 惠州 516001)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種破壞性的呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是快速肺損傷、嚴(yán)重低氧血癥、不受控制的炎性反應(yīng)和細(xì)胞因子積累，可進(jìn)一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[1]。病毒感染如流感病毒、冠狀病毒、腺病毒等是引起ALI和ARDS發(fā)病和導(dǎo)致患者死亡的主要原因[2]。越來越多的證據(jù)表明，不受控制的炎性反應(yīng)在ALI的發(fā)病和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[3]。因此，抑制過度的炎性反應(yīng)可能有助于ALI治療。中醫(yī)藥對ALI具有良好的療效，多種中藥制劑能減輕包括新型冠狀病毒肺炎在內(nèi)引起的肺部炎性反應(yīng)和改善疾病預(yù)后[4-5]。透邪解毒湯是我們臨床治療肺部疾病的常用方，本研究擬通過脂多糖(LPS)刺激建立膿毒癥ALI小鼠模型，并給予透邪解毒湯干預(yù)，研究探討透邪解毒湯治療ALI的作用機(jī)制，以進(jìn)一步明確中醫(yī)藥在ALI中的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)C57BL6小鼠40只，雄性，6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，于恒溫(25±1) ℃、12 h晝夜交替照明環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)，自由飲水飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗，均購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2020-0001。

1.2 中藥配制 透邪解毒方藥物組成：檳榔12 g，厚樸6 g，草果3 g，知母6 g，白芍6 g，黃芩6 g，甘草3 g，大黃6 g，連翹8 g，薄荷3 g，梔子3 g，芒硝3 g，竹葉5 g。常規(guī)煎煮，最終將藥物分別濃縮至相當(dāng)于生藥含量1、2 g/mL，置于4°C冰箱備用。所有中藥飲片購買自廣州中醫(yī)藥大學(xué)惠州醫(yī)院中藥房。

1.3 主要試劑與儀器

1.3.1 主要試劑 LPS(美國Sigma Aldrich公司)；小鼠磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、NF-κB、磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(p-JNK)、JNK、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶p38(p-p38)、p38、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)、ERK、Toll樣受體4(TLR4)及3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)及IL-1β酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司)；RIPA裂解和提取緩沖液、BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；寶生物染料法熒光定量試劑盒(日本TAKARA公司)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(上海天能科技有限公司)。

1.3.2 主要儀器 全自動酶標(biāo)儀、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析儀(美國Thermo公司)；組織包埋機(jī)(德國Leica公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；蛋白質(zhì)印跡(Western blot)電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，美國Millipore公司)

1.4 實驗方法

1.4.1 造模依據(jù) LPS是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，是誘導(dǎo)膿毒癥ALI/ARDS的關(guān)鍵因素之一，LPS可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞滲透，誘導(dǎo)炎癥因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，隨后啟動和傳播ALI/ARDS中的炎性反應(yīng)[6]。

1.4.2 分組、給藥及造模 將40只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、透邪解毒湯低濃度組及透邪解毒湯高濃度組，每組10只。對照組和模型組每日均予0.9%氯化鈉注射液0.2 mL灌胃，透邪解毒湯低濃度組每日予1 g/mL透邪解毒湯藥液0.2 mL灌胃，透邪解毒湯高濃度組每日予2 g/mL透邪解毒湯藥液0.2 mL灌胃，各組均連續(xù)灌胃5 d后，除對照組外，其余3組小鼠分別給予腹腔注射LPS(10 mg/ mL)0.2 mL誘導(dǎo)建立ALI模型，并在LPS注射24 h后進(jìn)行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液，然后將小鼠處死，摘取全部肺組織，備用。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 肺組織病理學(xué)評估 各組取3份肺組織樣品，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm切片，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察各組小鼠肺泡病理改變，并根據(jù)肺泡壁厚度、炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡出血和充血情況，采用半定量評分法評估肺損傷情況[7]。肺損傷程度評分：0分=無損傷；1分=輕度損傷；2分=中度損傷；3分=重度損傷；4分=極重度損傷。

1.5.2 肺水腫程度 各組取3份肺組織樣品，用濾紙將組織表面水分擦除干燥，稱質(zhì)量后(濕質(zhì)量)，將肺組織置于60 °C的孵箱中48 h，然后再次稱質(zhì)量(干質(zhì)量)。計算肺的濕/干質(zhì)量比，以反映肺水腫程度。

1.5.3 炎癥因子檢測

1.5.3.1 肺組織 各組取3份肺組織樣品，比較肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表達(dá)情況，采實時熒光定量PCR(Real time-PCR)法檢測。使用Trizol試劑提取肺組織中的總RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)DNA(cDNA)。cDNA稀釋3倍后按照寶生物染料法熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行Real time-PCR檢測操作。引物通過深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行設(shè)計，序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參，并使用2-ΔΔCt法計算樣品的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5.3.2 肺泡灌洗液 各組取3份肺泡灌洗液樣品，檢測肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)情況，均采用ELISA法檢測，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.4 信號通路相關(guān)蛋白 各組取3份肺組織樣品，檢測肺組織中TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白TLR4、p-NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路相關(guān)蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38水平表達(dá)情況，均采用Western blot法檢測。將各組樣品用RIPA裂解和提取緩沖液溶解，并使用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量。然后在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳上分離30 g蛋白，隨后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉膜2 h后，將膜分別與不同的一抗(TLR4、p-NF-κB、NF-κB、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK、ERK及GAPDH，1∶1000)孵育，并置于4 ℃下過夜，接著與二抗在室溫下孵育2 h，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測每個條帶，以GAPDH為參照，計算樣品的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)情況 對照組小鼠的肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺壁薄，毛細(xì)血管膜壁完好無損，偶見散發(fā)炎癥細(xì)胞。模型組小鼠出現(xiàn)廣泛的肺泡壁增厚、炎癥細(xì)胞浸潤及間質(zhì)性水腫，表明LPS導(dǎo)致了肺組織出現(xiàn)破壞性變化。透邪解毒湯高、低濃度組小鼠肺損傷較模型組明顯減輕，肺組織結(jié)構(gòu)更清晰，肺壁相對更厚，散發(fā)的炎癥細(xì)胞更少，表明透邪解毒湯能減輕LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型的病理改變。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)情況

2.2 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達(dá)量比較 與對照組比較，模型組小鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達(dá)量均升高(P<0.05)。與模型組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達(dá)量均降低(P<0.05)，透邪解毒湯低濃度組小鼠僅IL-1β 的mRNA相對表達(dá)量降低(P<0.05)。與透邪解毒湯低濃度組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達(dá)量均降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達(dá)量比較

2.3 各組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 與對照組比較，模型組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，透邪解毒湯高、低濃度組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低(P<0.05)。與透邪解毒湯低濃度組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

2.4 各組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質(zhì)量比比較 與對照組比較，模型組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質(zhì)量比均增加(P<0.05)。與模型組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質(zhì)量比均減少(P<0.05)，透邪解毒湯低濃度組小鼠僅肺濕/干質(zhì)量比減少(P<0.05)。與透邪解毒湯低濃度組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質(zhì)量比均減少(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質(zhì)量比比較

2.5 各組小鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4、p-NF-κB相對表達(dá)量比較 與對照組比較，模型組小鼠肺組織TLR4、p-NF-κB相對表達(dá)量均升高(P<0.05)。與模型組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織TLR4、p-NF-κB相對表達(dá)量均降低(P<0.05)，透邪解毒湯低濃度組小鼠僅TLR4相對表達(dá)量降低(P<0.05)。與透邪解毒湯低濃度組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織TLR4、p-NF-κB相對表達(dá)量均降低(P<0.05)。見圖2、表5。

圖2 各組小鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白相對表達(dá)

表5 各組小鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4、p-NF-κB相對表達(dá)量比較

2.6 各組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達(dá)量比較 與對照組比較，模型組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達(dá)量均升高(P<0.05)。與模型組比較，透邪解毒湯高、低濃度組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達(dá)量均降低(P<0.05)。與透邪解毒湯低濃度組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達(dá)量均降低(P<0.05)。見圖3、表6。

圖3 各組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白相對表達(dá)

表6 各組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達(dá)量比較

3 討論

ALI是一種嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是不受控制的氧化應(yīng)激、肺水腫、炎性反應(yīng)及中性粒細(xì)胞滲透，并可能導(dǎo)致ARDS的發(fā)生，臨床治療以肺保護(hù)性機(jī)械通氣為主，仍缺乏有效的治療藥物，患者死亡率高達(dá)30%～60%[8]。膿毒癥是由細(xì)菌等病原微生物侵入機(jī)體引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，涉及機(jī)體多個系統(tǒng)甚至多個臟器的復(fù)雜病癥，肺在其病程發(fā)展中是常見的受累器官，可造成病理學(xué)層面的小鼠肺組織損傷、促炎因子表達(dá)升高，是建立小鼠ALI模型的常用方法[9]。

中醫(yī)學(xué)雖然無ALI病名的記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、氣促、進(jìn)行性呼吸因難、喘憋、紫紺等肺氣壅遏癥狀，故可歸屬于“暴喘”“風(fēng)溫肺熱病”等范疇，主要病機(jī)為外感溫?zé)岫拘胺阜巍Ｖ嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為，肺為嬌臟，清虛嬌嫩，易受邪襲，邪氣入侵，氣滯壅結(jié)，上逆則喘，邪熱迫瘀，瘀熱互結(jié)，毒邪瘀積，壅滯在肺，則肺氣壅遏。ALI病性的核心在于濕、熱、毒蘊(yùn)結(jié)，且彌漫膜原、三焦，根據(jù)《瘟疫論》“邪伏膜原”理論，治療當(dāng)以透邪解毒、清上利下、通利三焦為原則。透邪解毒湯為達(dá)原飲與涼膈散的合方，采用達(dá)原飲開達(dá)膜原，辟穢化濁，清熱解毒，涼膈散清上利下，通達(dá)三焦。方中檳榔辛散濕邪，化痰破結(jié)；厚樸芳香化濁，理氣祛濕；草果辛香化濁，宣透伏邪；白芍、知母清熱滋陰，可防諸辛燥藥耗散陰津；黃芩清熱燥濕，清利胸膈之熱；連翹、竹葉輕清透散，清利上焦之熱；梔子通利小便，引火下行，清利三焦之熱；大黃、芒硝清熱瀉火，瀉下攻積；薄荷發(fā)散風(fēng)熱，清利咽喉；甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥。全方合用，可使穢濁得化，熱毒得清，陰津得復(fù)，則邪氣潰散，速離膜原，三焦清利。大量臨床研究也表明，達(dá)原飲與涼膈散對多種肺損傷性疾病均具有良好的作用。丁瑞叢等[10]研究表明，達(dá)原飲能縮短新型冠狀病毒肺炎患者的發(fā)熱時間，減輕肺部炎性反應(yīng)。Ruan X等[11]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索達(dá)原飲治療新型冠狀病毒肺炎的潛在作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)達(dá)原飲的潛在作用靶點包括TNF、IL-6等炎癥因子，并通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)達(dá)原飲治療后患者血清中的IL-6水平顯著降低。康振朝等[12]研究表明，涼膈散能夠降低放療患者血清中IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)表達(dá)水平，降低放療患者放射性肺炎的患病率。Yang H等[13]研究發(fā)現(xiàn)，涼膈散能通過上調(diào)microRNA-21(miR-21)水平，抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)，減少IL-6等炎癥因子的分泌，抑制LPS誘發(fā)的ALI。

炎性反應(yīng)是一種涉及多個病理過程的先天免疫反應(yīng)，可防止外部病原體感染和細(xì)胞損傷，然而長時間的過度炎性反應(yīng)刺激會引起組織損傷，在ALI及其他炎性反應(yīng)性疾病的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用，TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子的過度表達(dá)是加重炎性反應(yīng)程度的關(guān)鍵因素[14]。因此，降低促炎因子水平有助于減輕炎性反應(yīng)，并且是治療ALI等炎癥有關(guān)疾病的基礎(chǔ)[15-16]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠鏡下可見廣泛的肺泡壁增厚、炎癥細(xì)胞浸潤及間質(zhì)性水腫，肺損傷評分及肺濕/干質(zhì)量比均高于對照組(P<0.05)，肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達(dá)量及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均高于對照組(P<0.05)，提示造模后小鼠肺內(nèi)促炎因子表達(dá)水平明顯升高，過度的炎性反應(yīng)導(dǎo)致肺損傷明顯；透邪解毒湯高、低濃度組小鼠在給予相應(yīng)治療后肺損傷較模型組明顯減輕，肺組織結(jié)構(gòu)更清晰，肺壁相對更厚，散發(fā)的炎癥細(xì)胞更少，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質(zhì)量比均低于模型組(P<0.05)，肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達(dá)量及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均低于模型組(P<0.05)，且上述各個指標(biāo)均低于透邪解毒湯低濃度組(P<0.05)，透邪解毒湯低濃度組小鼠僅在肺損傷評分、肺組織中IL-1β mRNA相對表達(dá)量及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平方面低于模型組(P<0.05)，提示透邪解毒湯能有效減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織病理損傷及肺水腫，降低促炎因子水平。

TLR作為Ⅰ型跨膜蛋白受體，在先天免疫的啟動中起著至關(guān)重要的作用，正常情況下機(jī)體通過少量的LPS來啟動TLR4信號傳導(dǎo)途徑，并因此激活免疫系統(tǒng)抵抗病原體的入侵[17-18]。研究表明，TLR4與它的共受體髓樣分化因子2(MD2)可在細(xì)胞表面形成異源二聚體，用于鑒定和啟動LPS信號，TLR4-MD2復(fù)合物還可激活NF-κB和MAPK信號通路，促進(jìn)炎癥基因及炎癥因子的表達(dá)，從而引發(fā)炎性反應(yīng)[19-20]。然而過度的炎性反應(yīng)會引起人體內(nèi)部環(huán)境的失衡，因此抑制TLR4信號通路具有重要意義。NF-κB存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)外部抗原結(jié)合到各自的受體，隨后激活NF-κB并促使其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，誘導(dǎo)多種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[21]。MAPK中的JNK、p38、ERK可以觸發(fā)信號級聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生更多的炎癥因子，在炎癥的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，同時研究發(fā)現(xiàn)抑制MAPK信號通路可以抑制NF-κB的激活[22]。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能最基本、最普遍也是最重要的機(jī)制，因此我們選擇相關(guān)蛋白的磷酸化指標(biāo)進(jìn)行觀察。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4、p-NF-κB相對表達(dá)量及MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達(dá)量均高于對照組(P<0.05)；透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4、p-NF-κB相對表達(dá)量及MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達(dá)量均低于模型組(P<0.05)，且均低于透邪解毒湯低濃度組(P<0.05)，透邪解毒湯低濃度組小鼠僅肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4相對表達(dá)量及MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達(dá)量低于模型組(P<0.05)。提示透邪解毒湯降低炎性反應(yīng)可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路及MAPK信號通路有關(guān)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芩的活性成分黃芩苷能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，對LPS致內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)發(fā)揮抑制作用[23]；芍藥的主要成分芍藥苷能顯著抑制巨噬細(xì)胞TLR4信號通路，減少炎癥因子的分泌[24]。這些成分可能是透邪解毒湯發(fā)揮抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，透邪解毒湯對LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠具有確切的治療作用，能夠明顯減輕肺組織損傷，改善肺水腫，抑制炎性反應(yīng)，并具有一定的劑量依賴性，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路及MAPK信號通路有關(guān)。