LncRNA MEG3減輕缺血再灌注損傷所致腸黏膜屏障功能損害的機(jī)制*

黃賢偉，陳 波 ，藺際龑△

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.急診科；2.檢驗(yàn)科，福建 廈門 361000)

心臟驟停是致死率高的臨床常見危重癥[1]。缺血再灌注損傷(I/R)是心肺復(fù)蘇后患者突出的表現(xiàn)，目前研究已證實(shí)，心肺復(fù)蘇后患者存活率低下與多器官I/R密切相關(guān)[2]。其中腸黏膜I/R是影響整個(gè)病情發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[3]。有效防治腸黏膜I/R是亟待解決的臨床問題。心臟驟停引起腸道的缺血缺氧，導(dǎo)致腸道黏膜屏障遭到破壞，腸黏膜通透性增強(qiáng)及功能喪失，免疫功能抑制、腸道菌群紊亂等病理改變，自主循環(huán)恢復(fù)后出現(xiàn)腸黏膜再灌注損傷，腸道中的微生物和內(nèi)毒素可通過受損的腸黏膜屏障迅速進(jìn)入體循環(huán)，引起網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)生系列反應(yīng)，導(dǎo)致大量相關(guān)介質(zhì)及細(xì)胞因子的激活與釋放，神經(jīng)、體液、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及血管活性物質(zhì)等發(fā)生劇烈變化[4]，進(jìn)而導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征的發(fā)生，故腸黏膜I/R可成為機(jī)體“二次打擊的起源”，導(dǎo)致復(fù)蘇后患者病情惡化，甚至死亡[5]。當(dāng)前研究表明，腸黏膜I/R與氧自由基損傷、鈣離子超載、炎性細(xì)胞因子大量浸潤(rùn)、細(xì)胞大片凋亡、細(xì)胞因子釋放等密切相關(guān),但具體發(fā)病機(jī)制目前仍不是很清楚。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)已被發(fā)現(xiàn)在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用[6]。有研究表明，LncRNA uc.173通過調(diào)節(jié)微小RNA-29b/claudin-1(CLDN1)信號(hào)調(diào)節(jié)腸道屏障功能[7]。有研究通過基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肝臟I/R后LncRNA_AK139328表達(dá)上調(diào)，沉默LncRNA_AK139328表達(dá)可降低肝臟巨噬細(xì)胞水平和半胱氨酸蛋白酶-3活化水平，同時(shí)還降低了核因子κB活性，從而降低了炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，對(duì)肝I/R產(chǎn)生保護(hù)作用[8]。LncRNA MEG3是一種廣為人知的LncRNA，在多種病理過程中發(fā)揮著不同的作用，包括癌癥進(jìn)展和炎性反應(yīng)[9-10]。在腦I/R的小鼠模型中已證實(shí)，LncRNA MEG3與神經(jīng)功能障礙相關(guān)[11]。但LncRNA MEG3對(duì)腸黏膜I/R和腸黏膜屏障的影響尚鮮見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討了LncRNA MEG3保護(hù)腸黏膜I/R后腸屏障功能的機(jī)制，旨在為腸黏膜I/R的治療提供潛在策略。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器 人結(jié)直腸腺癌Caco-2細(xì)胞由美國紐約美國典型組織培養(yǎng)集合庫提供。10%胎牛血清購自美國Gibco公司，ADV4、ADV4MEG3、ADV1、ADV1MEG3、短發(fā)夾RNA(shRNA)載體均由中國南京Genscript公司合成。Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自Keygen Biot Solasodine公司。TRIzol購自美國Invitgen公司，第一鏈cDNA的合成按制造商(Invitgen，美國)說明書進(jìn)行。定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)采用SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ試劑盒(Takara，日本)，使用的引物序列：MEG3正向：5′-GTGAAGGTCGGAGTGAACG-3′，反向:5′- CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′；U6正向:5′-GACAGATTCGGTCTGTGGCAC-3′，反向:5′-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3′；GAPDH正向:5′-GACAGATTCGGTCTGTGGCAC-3′，反向:5′-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3′。Millicell ERS-2電阻系統(tǒng)購自美國默克-米利波爾公司。緊密連接蛋白(Occludin)和CLDN1、次級(jí)抗體購自中國Proteintech公司。日本尼康顯微鏡分析免疫熒光。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、鏈霉素0.1 mg/mL、青霉素100 U/mL的培養(yǎng)基中(37 ℃、5%二氧化碳)。建立體外缺氧缺糖(OGD)模型,Caco-2細(xì)胞在5%二氧化碳、1%氧和94%氮中孵育12 h，然后將細(xì)胞在常氧條件下培養(yǎng)6 h以實(shí)現(xiàn)復(fù)氧建立OGD模型。根據(jù)腺病毒載體裝載及其接受處理的不同，分為對(duì)照組、OGD組、OGD+ADV4組、OGD+MEG3組、OGD+ADV1組和OGD+shMEG3組。

1.2.2細(xì)胞存活率 采用CKK-8法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞存活率。將約5×105個(gè)Caco-2細(xì)胞置于96孔板中培養(yǎng)12 h，然后加入含CKK-8培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)微板閱讀器在450 nm處分析吸光度(OD)。

1.2.3細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。收集大約1×106個(gè)細(xì)胞并用結(jié)合緩沖液洗滌。然后用FITC標(biāo)記的Annexin V和PI在25 ℃時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4LncRNA MEG3表達(dá) 提取總RNA。第一鏈cDNA的合成按制造商說明書進(jìn)行。定量逆轉(zhuǎn)錄PCR采用SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ試劑盒。

1.2.5腸屏障功能 測(cè)定腸組織跨皮細(xì)胞電阻(TEER)值分析腸屏障功能。TEER值檢測(cè)是評(píng)估腸黏膜屏障功能的重要指標(biāo)[12-13]。將2×105個(gè)/mL Caco-2細(xì)胞覆蓋在膠原包裹的聚碳酸酯可穿透支持補(bǔ)充劑上。培養(yǎng)基每2天更換1次。使用Millicell ERS-2在3周時(shí)用TEER測(cè)量腸屏障。用4%多聚甲醛固定Caco-2細(xì)胞30 min，用Triton×100(0.2%)處理10 min，再用牛血清蛋白處理30 min。將載玻片與Occludin和CLDN1的抗體在4 ℃下孵育過夜，然后與次級(jí)抗體在37 ℃孵育1 h。在25 ℃下用Hoechst染色10 min。用尼康顯微鏡分析免疫熒光。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞LncRNA MEG3表達(dá)水平比較 OGD組、OGD+ADV4組、OGD+MEG3組、OGD+ADV1組、OGD+shMEG3組LncRNA MEG3表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；OGD+MEG3組LncRNA MEG3表達(dá)水平高于OGD組、OGD+ADV4組、OGD+ADV1組及OGD+shMEG3組，OGD+shMEG3組LncRNA MEG3表達(dá)低于OGD組、OGD+ADV4組、OGD+ADV1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

與對(duì)照組比較，aP<0.01；與OGD+MEG3組比較，bP<0.01；與OGD+shMEG3組比較，cP<0.01。

2.2各組Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞存活率比較 OGD組、OGD+ADV4組、OGD+ADV1組、OGD+shMEG3組Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，而OGD+MEG3組細(xì)胞存活率高于OGD+ADV4組與OGD組，OGD+shMEG3組細(xì)胞存活率低于OGD+ADV1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

A.CKK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率圖(200×)；B.各組細(xì)胞存活率比較情況，與對(duì)照組比較，aP<0.01；與OGD+MEG3組比較，bP<0.01；與OGD+shMEG3組比較，cP<0.01。

2.3各組細(xì)胞凋亡情況比較 OGD組、OGD+ADV4組、OGD+MEG3組、OGD+ADV1組、OGD+shMEG3組細(xì)胞凋亡高于對(duì)照組，OGD+MEG3組細(xì)胞凋亡低于OGD組、OGD+ADV4組、OGD+ADV1組及OGD+shMEG3組，OGD+shMEG3組細(xì)胞凋亡高于OGD組、OGD+ADV4組及OGD+ADV1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡圖；B.各組細(xì)胞凋亡比較情況，與對(duì)照組比較，aP<0.01；與OGD+MEG3組比較，bP<0.01；與OGD+shMEG3組比較，cP<0.01。

2.4各組Caco-2細(xì)胞TEER值比較 OGD組、OGD+ADV4組、OGD+MEG3組、OGD+ADV1組、OGD+shMEG3組Caco-2細(xì)胞的TEER值低于對(duì)照組，OGD+MEG3組TEER值高于OGD+ADV4組，OGD+shMEG3組TEER值低于OGD+ADV1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4A；作為對(duì)照的單層Caco-2細(xì)胞TEER值變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4B。

A.各組Caco-2細(xì)胞TEER值比較情況，與對(duì)照組比較，aP<0.01；與OGD+MEG3組比較，bP<0.01；與OGD+shMEG3組比較，cP<0.01；B.對(duì)照的單層Caco-2細(xì)胞TEER值。

2.5各組Caco-2細(xì)胞中緊密連接蛋白CLDN1和Occludin表達(dá)水平比較 免疫熒光顯示，OGD組、OGD+ADV4組、OGD+ADV1組、OGD+shMEG3組Caco-2細(xì)胞中CLDN1和Occludin的表達(dá)水平低于對(duì)照組；OGD+MEG3組過表達(dá)LncRNA MEG3可以減輕這種作用，但OGD+shMEG3組抑制LncRNA MEG3表達(dá)則增強(qiáng)這種作用。見圖5。

A.免疫熒光分析法檢測(cè)CLDN1表達(dá)水平(200×)；B.免疫熒光分析法檢測(cè)Occludin表達(dá)水平(200×)。

3 討 論

腸黏膜I/R是心肺復(fù)蘇患者救治的“瓶頸”之一，腸黏膜I/R可通過多種病理機(jī)制導(dǎo)致腸屏障功能障礙[14]，缺血損傷后腸道黏膜屏障遭到破壞，腸黏膜通透性增強(qiáng)及功能喪失，免疫功能抑制、腸道菌群紊亂等病理改變，自主循環(huán)恢復(fù)后出現(xiàn)腸黏膜再灌注損傷，腸道中的微生物和內(nèi)毒素可通過受損的腸黏膜屏障迅速進(jìn)入體循環(huán)造成患者病情惡化，當(dāng)前缺乏有效治療手段。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，核受體相關(guān)因子1通過抑制p21[15]促進(jìn)I/R后腸道功能的恢復(fù)。LncRNA H19在腸黏膜I/R誘導(dǎo)的腸屏障功能障礙中具有保護(hù)作用[16]。LncRNA NEAT1可通過調(diào)節(jié)腸道屏障和外泌體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化抑制炎癥性腸病中的炎性反應(yīng)[17]。LncRNA SPRY4-IT1通過調(diào)控連接蛋白[18]的表達(dá)調(diào)控腸黏膜屏障能力。

OGD模型是國內(nèi)外研究I/R廣泛采用的離體模型[19]，LU等[20]在實(shí)驗(yàn)中將Caco-2細(xì)胞經(jīng)OGD處理模擬腸黏膜I/R。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將Caco-2細(xì)胞在5%二氧化碳、1%氧和94%氮中孵育12 h，然后將細(xì)胞在常氧條件下培養(yǎng)6 h實(shí)現(xiàn)復(fù)氧建立OGD模型，空白對(duì)照組與OGD處理后LncRNA MEG3表達(dá)調(diào)控各組比較，細(xì)胞存活及凋亡差異最顯著。有研究表明，腸黏膜I/R中細(xì)胞凋亡是其黏膜細(xì)胞主要死亡機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3能減少OGD誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞凋亡增加其存活率，因此考慮LncRNA MEG3可能通過減少細(xì)胞凋亡、維持腸黏膜的完整性，從而減輕損傷。

TEER值是反映腸黏膜屏障功能的可靠指標(biāo)[21]。本研究結(jié)果顯示，OGD處理后Caco-2細(xì)胞TEER值顯著降低，LncRNA MEG3過表達(dá)明顯減輕OGD處理的Caco-2細(xì)胞TEER水平，進(jìn)一步證明LncRNA MEG3能保護(hù)腸黏膜屏障功能。有研究已發(fā)現(xiàn)，Occludin和CLDN1是維持腸道屏障功能方面具有關(guān)鍵作用的蛋白[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD處理的Caco-2細(xì)胞中Occludin、CLDN1表達(dá)水平均明顯降低；而增加LncRNA MEG3表達(dá)后上述蛋白隨之升高，表明LncRNA MEG3在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能通過減少OGD處理的腸黏膜細(xì)胞凋亡增加維護(hù)腸黏膜的完整性，并通過增加Occludin、CLDN1表達(dá)維持腸道屏障功能，從而減輕I/R后腸黏膜屏障功能障礙。

綜上所述，LncRNA MEG3可能通過減少細(xì)胞凋亡并增加Occludin、CLDN1蛋白表達(dá)減輕I/R所致腸黏膜屏障損傷，保護(hù)腸黏膜的屏障功能，本研究這一發(fā)現(xiàn)能為腸黏膜I/R的治療提供潛在的新策略，但LncRNA MEG3能否在活體動(dòng)物及人體內(nèi)發(fā)揮同樣作用尚需進(jìn)一步研究。