燈盞花素通過(guò)調(diào)控LKB1/AMPK和Notch1/Jagged1通路改善高脂血癥大鼠血脂水平及肝腎功能的作用機(jī)制研究＊

張明昊，郭 申，杜婧雯，俎兆軒，趙 紳，張 童

（河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046）

高脂血癥（Hyperlipidemia）是一種以血液中脂質(zhì)水平升高及部分載脂蛋白水平降低為主要臨床表現(xiàn)的代謝性疾病[1-3]，這種血脂水平異常不僅會(huì)增加心腦血管疾病發(fā)生的潛在危險(xiǎn)，還會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪性病變、腎小球硬化及固有細(xì)胞凋亡，故肝臟、腎臟是血脂異常致?lián)p傷的主要靶器官[4-5]。西醫(yī)治療高脂血癥常以他汀類藥物為主，該類藥物雖能夠抑制HMG-CoA還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGCR）活性和升高肝臟組織內(nèi)低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein,LDL）受體水平，進(jìn)而使機(jī)體內(nèi)總膽固醇（Total Cholesterol,T-CHO）和低密度脂蛋白膽固醇（Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C）水平降低，但長(zhǎng)期用藥會(huì)損害肝、腎及肌肉功能，且停藥后血脂也會(huì)升高[1]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“痰濁、瘀血”為高脂血癥主要病機(jī)，其發(fā)病與肝、腎關(guān)系密切，祛瘀通絡(luò)為其主要治療思路[6]。燈盞花素（Scutellarin,SCU,40,5,6-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸苷，分子式：C21H18O12）是一種能夠活血化瘀、通脈活絡(luò)、祛風(fēng)除濕的黃酮類化合物，由燈盞花全枝中提取，臨床上用于多種心腦血管疾病的治療[7-8]。本課題組曾對(duì)燈盞花素的藥理作用進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)該藥一方面可改善微循環(huán)、清除氧自由基而保護(hù)肝臟；另一方面可以降低血液粘稠度、對(duì)抗細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化而保護(hù)腎臟，但其對(duì)血脂異常升高引起的肝腎損傷是否具有保護(hù)作用還未見(jiàn)報(bào)道。因燈盞花素活血化瘀的作用符合高脂血癥“祛瘀通絡(luò)”的治療思路，且臨床上已有燈盞花素治療高脂血癥患者的少量報(bào)道，故本課題組選用燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠進(jìn)行干預(yù)，以辛伐他汀為陽(yáng)性對(duì)照藥物，觀察燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平及肝腎功能的影響。

燈盞花素雖能去纖降脂、保護(hù)肝腎，但其對(duì)血脂水平干預(yù)及肝腎保護(hù)機(jī)制尚不清楚。本課題組考慮到肝激酶B1（Liver kinase B1,LKB1）/單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）通路與多種能量代謝異常疾病密切相關(guān)[9]，而Notch信號(hào)受體1（Notch1）/Notch信號(hào)配體1（Jagged1）通路與多種慢性腎臟疾病密切相關(guān)[10]，故本研究將從LKB1/AMPK、Notch/Jagged1兩條通路的角度探究燈盞花素對(duì)高血脂癥大鼠血脂水平干預(yù)及肝腎保護(hù)機(jī)制，對(duì)中醫(yī)藥治療高脂血癥具有一定的啟示意義。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔骄繜舯K花素通過(guò)激活LKB1/AMPK通路、抑制Notch/Jagged1通路對(duì)高血脂癥大鼠血脂水平干預(yù)及肝腎保護(hù)機(jī)制，為中醫(yī)藥防治高脂血癥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并為高血脂癥的臨床治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180-220 g，鄭州市中原區(qū)夢(mèng)飛養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2020-0005，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：110981201100002671。大鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（豫）2020-0004，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20-22℃，相對(duì)濕度為55%-60%，正常光照，大鼠自由飲水采食。

1.2 主要試劑與儀器

燈盞花素片（20 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20013018，批號(hào)：20210101）購(gòu)自廣東彼迪藥業(yè)有限公司；辛伐他?。ㄅ?hào)：1810409，國(guó)藥準(zhǔn)字H20066196，規(guī)格：10 mg/片）購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司；高脂飼料由鄭州市中原區(qū)夢(mèng)飛養(yǎng)殖場(chǎng)提供；氨基甲酸乙酯（批號(hào)：20200326）購(gòu)自上海山浦化工有限公司；甘油三酯（Triglyceride,TG）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：ML003393-1）、高密度脂蛋白膽固醇（High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：ML059157-1）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate Aminotransferase,AST）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：ML059334-1）、總膽固醇（Total Cholesterol,T-CHO）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：MLSH0502）、低密度脂蛋白膽固醇（Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：ML037144-1）、肌酐（Creatinine,Cr）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：ML058879-1）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：MLSH0416）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Aminotransferase,ALT）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：ML037336-1）均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔鏈霉卵白素-生物素檢測(cè)（SP）試劑盒（批號(hào)：SP-9001）、二氨基聯(lián)苯胺法（Diaminobenzidine,DAB）顯色試劑盒（批號(hào)：ZLI-9019）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；肝激酶B1（LKB1）抗體（批號(hào)：bs-3948R）、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCR）抗 體（bs-5068R）、Notch信 號(hào) 受 體1（Notch1）抗體（批號(hào)：ab167441）、Notch信號(hào)配體1（Jagged1）抗體（批號(hào)：ab300561）、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1（Hes1）抗體（批號(hào)：ab108937）均購(gòu)自Abcam公司；TriQuick總RNA提取試劑（批號(hào)：R1100）、cDNA合成試劑盒（批號(hào)：G3330）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增試劑（批號(hào)：G3320）均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

Secura124-1CN型電子天平購(gòu)自德國(guó)公司Sartorius公司；DNM-9606型酶標(biāo)儀購(gòu)自北京普朗新技術(shù)有限公司；Leica RM2245型石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；C1650R-230V型高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；KH-BJ型生物組織包埋機(jī)、KH-P3型漂片儀、KH-P4烤片機(jī)購(gòu)自湖北孝感闊?？萍加邢薰?；CX23光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；CFX型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組、造模及給藥

取60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組（Normal）、模型組（Model）、辛伐他汀組（Simvastatin）和燈盞花素低、中、高劑量組（Breviscapine-L,-M,-H），每組10只。正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，飼喂普通飼料，其余各組大鼠均按10mL·kg-1腹腔注射75%蛋黃乳液（Egg Yolk Lotion），注射后大鼠禁食16 h，不禁水，16 h后飼喂高脂飼料（High Fat Feed），連續(xù)飼喂28天。辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組在造模同時(shí)即干預(yù)給藥，其中辛伐他汀組大鼠按20 mg·kg-1灌胃辛伐他?。⊿imvastatin）溶液；燈盞花素低、中、高劑量組大鼠分別按6 mg·kg-1、12 mg·kg-1、24 mg·kg-1灌胃燈盞花素（Breviscapine）溶液，1次/天，連續(xù)28天。

1.3.2 標(biāo)本采集

末次給藥24h后，各組大鼠稱重后腹腔注射氨基甲酸乙酯麻醉，注射劑量為1 g·kg-1，麻醉后采用腹主動(dòng)脈取血，3000 r·min-1離心10 min，分離取血清。然后將大鼠頸椎脫臼處死，解剖取肝臟（Liver）和腎臟（Renal），去除臟器周圍結(jié)蹄組織，吸盡臟器表面血液，將取出的肝臟、腎臟置于電子天平上稱重、記錄；再將肝臟、腎臟各分兩部分，其中一部分放置于4%中性甲醛中固定；另一部分放入液氮速凍后再置于-80℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測(cè)血清TG、T-CHO、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、Cr、BUN水平

按照說(shuō)明書(shū)，用ELISA法試劑盒對(duì)各組大鼠血清中TG、T-CHO、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、Cr、BUN水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 測(cè)定肝臟系數(shù)（LW/BW）、腎臟系數(shù)（RW/BW）

計(jì)算肝臟質(zhì)量（Liver weight,LW）、腎臟質(zhì)量（Renal weight,RW）與體質(zhì)量（Body weight,BW）的比值，即肝臟系數(shù)（LW/BW）、腎臟系數(shù)（RW/BW），以此來(lái)評(píng)價(jià)肝臟、腎臟病變程度。

1.3.5 肝腎組織病理學(xué)觀察

取1.3.2項(xiàng)下固定的肝臟和腎臟組織，經(jīng)75%、85%、95%、100%乙醇（Ethanol）梯度脫水、二甲苯（Xylene）透明、固體石蠟（Paraffin Wax）包埋、4μm切片等實(shí)驗(yàn)過(guò)程制作病理組織切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟、蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin,HE）染色，鹽酸乙醇分化，75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水、二甲苯透明后采用中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡（Light Microscope）下觀察肝、腎組織病理學(xué)變化并于400倍鏡下采集圖像。

1.3.6 免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry,IHC）法檢 測(cè) 肝 組 織p-AMPK、LKB1、HMGCR和 腎 組 織Notch1、Jagged1、Hes1蛋白水平

取1.3.5項(xiàng)下制作的肝臟、腎臟組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，用檸檬酸鹽緩沖液（Citrate Buffer）熱修復(fù)8min，待溫度降至室溫后切片依次用過(guò)氧化氫（H2O2）孵育10min，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗，山羊血清（Goat Serum）孵育30 min，然后分別滴加p-AMPK（1:1000）、LKB1（1:1000）、HMGCR（1:1000）、Notch1（1:1000）、Jagged1（1:1000）、Hes1（1:1000）抗體，4℃孵育過(guò)夜，次日切片復(fù)溫至37℃后滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（HRP）孵育20 min，PBS緩沖液浸洗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液顯色反應(yīng)10min，自來(lái)水浸洗終止。然后蘇木素（Hematoxylin）復(fù)染3 min，鹽酸乙醇分化，自來(lái)水再次浸洗，切片經(jīng)75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察。每只大鼠肝臟、腎臟組織切片在400倍鏡下隨機(jī)選取1個(gè)視野，以棕黃色為陽(yáng)性染色，采用Image-Pro Plus 6.0測(cè)定每個(gè)視野中平均光密度值（Average optical density value,AOD）值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）法檢測(cè)肝組織AMPK、LKB1、HMGCR和腎組織Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA水平

根據(jù)GenBank已發(fā)表的大鼠AMPK（登錄號(hào)：NM023991）、LKB1（登 錄 號(hào)：NM001108069.1）、HMGCR（登錄號(hào)：NM013134.2）、Notch1（登錄號(hào)：NM001105721）、Jagged1（登錄號(hào)：NM019147.1）、Hes1（登 錄 號(hào)：NM024360.3）、GAPDH（登 錄 號(hào)：NM017008.4）基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)表1，以上引物采用DNA序列分析軟件（DNAStar）的PrimerSelect程序設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程有限公司合成。然后取肝臟、腎臟組織各100mg，加入1mL總RNA提取試劑（TriQuick）充分研磨勻漿后采用酚抽提法提取總RNA，經(jīng)濃度及純度檢測(cè)后在20μL反應(yīng)體系內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以2μL cDNA為模板，加入靶基因上下游引物、Taq DNA聚合酶、dNTP于15μL反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線及溶解曲線判斷PCR反應(yīng)特異性。所得結(jié)果以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參，用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對(duì)水平。

表1 Real-time PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊者組間兩兩比較采用最小顯著差異法（Least-Significant Difference,LSD）檢驗(yàn)，方差不齊者組間兩兩比較采用新復(fù)極差法（Dunnett-t）檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響

與正常組比較，模型組、辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組T-CHO、TG、LDL-C水平明顯升高（P＜0.05）；HDL-C水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組T-CHO、TG、LDL-C水平明顯降低（P＜0.05）；HDL-C水平明顯升高（P＜0.05）。與辛伐他汀組比較，燈盞花素低、中劑量組T-CHO水平明顯升高（P＜0.05）；HDL-C水平明顯降低（P＜0.05）；燈盞花素低、中、高劑量組TG、LDL-C水平明顯升高（P＜0.05）。與燈盞花素低劑量組比較，燈盞花素中、高劑量組T-CHO、TG水平明顯降低（P＜0.05）；HDL-C水平明顯升高（P＜0.05）；燈盞花素高劑量組LDL-C水平明顯降低（P＜0.05）（圖1）。

圖1 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響（xˉ±s，n=10）

2.2 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠肝臟功能的影響

與正常組比較，模型組和燈盞花素低、中劑量組肝臟系數(shù)明顯增加（P＜0.05）；模型組和燈盞花素低、中、高劑量組ALT水平明顯升高（P＜0.05）；模型組和燈盞花素低劑量組AST水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組肝臟系數(shù)、ALT和AST水平明顯降低（P＜0.05）。與辛伐他汀組比較，燈盞花素低劑量組肝臟系數(shù)、AST水平明顯升高（P＜0.05）；燈盞花素低、中劑量組ALT水平明顯升高（P＜0.05）。與燈盞花素低劑量組比較，燈盞花素高劑量組肝臟系數(shù)和ALT水平明顯降低（P＜0.05）；燈盞花素中、高劑量組AST水平明顯降低（P＜0.05）（圖2）。

圖2 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠肝臟功能的影響

2.3 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠腎臟功能的影響

與正常組比較，模型組和燈盞花素低、中、高劑量組腎臟系數(shù)明顯增加（P＜0.05）；BUN水平明顯升高（P＜0.05）；模型組和燈盞花素低、中劑量組Cr水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組腎臟系數(shù)、Cr和BUN水平明顯降低（P＜0.05）。與辛伐他汀組比較，燈盞花素低、中劑量組腎臟系數(shù)和Cr水平明顯升高（P＜0.05）；燈盞花素低、中、高劑量組BUN水平明顯升高（P＜0.05）。與燈盞花素低劑量組比較，燈盞花素高劑量組腎臟系數(shù)和Cr水平明顯降低（P＜0.05）；燈盞花素中、高劑量組BUN水平明顯降低（P＜0.05）（圖3）。

圖3 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠腎臟功能的影響

2.4 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠肝腎病理的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，大小形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)脂肪滴；腎臟組織形態(tài)正常，肝腎組織均未見(jiàn)病理性變化。模型組大鼠肝細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞腫脹變大，細(xì)胞間分界不清晰，大量脂肪滴存在于細(xì)胞漿內(nèi)；腎臟組織結(jié)構(gòu)存在明顯擠壓，系膜基質(zhì)明顯增加，腎小球局部可見(jiàn)局灶節(jié)段性硬化，腎小管變性，且可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)于組織內(nèi)；辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)無(wú)異常，整體排列較平整，有少量脂肪滴存在于細(xì)胞漿；腎臟組織擠壓及腎小球、腎小管變性程度明顯改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕（圖4）。

圖4 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠肝腎病理的影響（HE，×400）

2.5 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠肝組織p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白水平的影響

免疫組化結(jié)果顯示，正常組肝組織有大量p-AMPK、LKB1表達(dá)，有少量HMGCR表達(dá)。與正常組比較，模型組、辛伐他汀組和燈盞花素低、中劑量組p-AMPK水平明顯降低（P＜0.05），HMGCR水平明顯升高（P＜0.05）；燈盞花素高劑量組p-AMPK水平明顯升高（P＜0.05），HMGCR水平明顯降低（P＜0.05）；辛伐他汀組和燈盞花素低劑量組LKB1水平明顯降低（P＜0.05）；燈盞花素中、高劑量組LKB1水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組p-AMPK、LKB1水平明顯升高（P＜0.05）；HMGCR水平明顯降低（P＜0.05）。與辛伐他汀組比較，燈盞花素低、中劑量組p-AMPK水平明顯降低（P＜0.05），燈盞花素高劑量組p-AMPK水平明顯升高（P＜0.05）；燈盞花素低劑量組LKB1水平明顯降低（P＜0.05），HMGCR水平明顯升高（P＜0.05）；燈盞花素中、高劑量組LKB1水平明顯升高（P＜0.05）；HMGCR水平明顯降低（P＜0.05）（圖5）。

圖5 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠肝組織p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白水平的影響（免疫組化，×400）

2.6 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠腎組織Notch1、Jagged1、Hes1蛋白水平的影響

免疫組化結(jié)果顯示，正常組腎組織中有少量Notch1、Jagged1和Hes1表達(dá)。與正常組比較，模型組和燈盞花素低劑量組Notch1水平明顯升高（P＜0.05），辛伐他汀組和燈盞花素高劑量組Notch1水平明顯降低（P＜0.05）；模型組、辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組Jagged1水平明顯升高（P＜0.05）；模型組和燈盞花素低、中、高劑量組Hes1水平明顯升高（P＜0.05），辛伐他汀組Hes1水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組Notch1、Jagged1和Hes1水平明顯降低（P＜0.05）。與辛伐他汀組比較，燈盞花素低、中劑量組Notch1水平明顯升高（P＜0.05）；燈盞花素低劑量組Jagged1水平明顯升高（P＜0.05），燈盞花素高劑量組Jagged1水平明顯降低（P＜0.05）；燈盞花素低、中、高劑量組Hes1水平明顯升高（P＜0.05）。與燈盞花素低劑量組比較，燈盞花素中、高劑量組Notch1、Jagged1和Hes1水平明顯降低（P＜0.05）（圖6）。

圖6 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠腎組織Notch1、Jagged1、Hes1蛋白水平的影響（免疫組化，×400）

2.7 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠肝組織AMPK、LKB1、HMGCR mRNA水平的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組AMPK mRNA水平明顯降低（P＜0.05），HMGCR mRNA水平明顯升高（P＜0.05）；模型組和燈盞花素低、中、高劑量組LKB1 mRNA水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組AMPK、LKB1 mRNA水平明顯升高（P＜0.05）；辛伐他汀組和燈盞花素中、高劑量組HMGCR mRNA水平明顯降低（P＜0.05）。與辛伐他汀組比較，燈盞花素低劑量組AMPK mRNA水平明顯降低（P＜0.05），HMGCR mRNA水平明顯升高（P＜0.05）；燈盞花素低、中、高劑量組LKB1 mRNA水平明顯降低（P＜0.05）。與燈盞花素低劑量組比較，燈盞花素中、高劑量組中、高劑量組LKB1 mRNA水平明顯升高（P＜0.05），HMGCR mRNA水平明顯降低（P＜0.05）（圖7）。

圖7 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠肝組織AMPK、LKB1、HMGCR mRNA水平的影響

2.8 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠腎組織Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA水平的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA水平明顯升高。與模型組比較，辛伐他汀組和燈盞花素低、中、高劑量組Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA水平明顯降低。與辛伐他汀組比較，燈盞花素低、中劑量組Notch1 mRNA水平明顯升高；燈盞花素低、中、高劑量組agged1、Hes1 mRNA水平明顯升高。與燈盞花素低劑量組比較，燈盞花素中、高劑量組Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA水平明顯降低（圖8）。

圖8 燈盞花素對(duì)高脂血癥大鼠腎組織Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA水平的影響

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活條件的改善，高脂高糖飲食伴隨不良生活習(xí)慣導(dǎo)致了血脂異常發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，而血脂異常升高則會(huì)引起心血管病、腦血管病及肥胖等多種相關(guān)疾病的發(fā)生，從而加重我國(guó)國(guó)民醫(yī)療負(fù)擔(dān)[5,11]。血脂是血漿中T-CHO、TG及類脂的總稱，其水平異常升高即高脂血癥[12]；LDL-C是一種脂蛋白，主要參與T-CHO從肝臟至外周組織的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程；HDL-C是將T-CHO從外周組織轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟代謝的一種脂蛋白[13]，二者功能相互呼應(yīng)，當(dāng)LDL-C水平升高且HDL-C水平下降時(shí)，機(jī)體脂質(zhì)代謝清除能力下降，就會(huì)引起高血脂癥。在對(duì)高脂血癥的病因、病理及降脂新藥研究中，構(gòu)建與人類病變基本相似且具有重復(fù)性的高脂血癥動(dòng)物模型是先決條件。本實(shí)驗(yàn)采用了一次性腹腔注射蛋黃乳液后飼喂高脂飼料的方法，誘導(dǎo)構(gòu)建了大鼠高脂血癥模型[14]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該模型大鼠T-CHO、TG和LDL-C水平升高而HDL-C水平下降，表明造模成功。該模型在臨床上與人類高脂血癥特征相似，可用于高脂血癥研究。

燈盞花學(xué)名為短葶飛蓬（Erigeron breviscapus），屬菊科，性溫，味辛、微苦，能活血通絡(luò)、散寒除濕[15]，而燈盞花素就是從該種植物中分離得到的黃酮類成分，具有活血化瘀、通脈活絡(luò)、去纖降脂、擴(kuò)張血管等功效[16]，且運(yùn)用此藥治療高脂血癥符合“祛瘀通絡(luò)”的治療理念。辛伐他汀是一種HMG-CoA還原酶抑制劑，可以有效降低血脂水平[5]?；谝陨纤悸罚緦?shí)驗(yàn)選擇燈盞花素為治療藥物，以辛伐他汀為陽(yáng)性對(duì)照藥，探討了其對(duì)高血脂大鼠的干預(yù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)燈盞花素可以明顯降低高血脂癥大鼠血清T-CHO、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，表明燈盞花素具有較好地降血脂作用。

肝臟是機(jī)體脂質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所，血脂異常升高會(huì)導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)脂肪堆積，并引起肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)脂肪性病變，肝臟功能受損，脂質(zhì)代謝過(guò)程紊亂。肝臟系數(shù)可以反映肝臟的狀態(tài)，其增加時(shí)則提示肝臟可能出現(xiàn)了腫脹、肥大、充血、水腫、增生等病理變化。ALT和AST水平是反映肝細(xì)胞膜的穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，也是臨床上肝功能的判斷標(biāo)準(zhǔn)，其水平升高提示肝細(xì)胞病變[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠血清ALT、AST水平升高，肝臟系數(shù)增加，燈盞花素可以下調(diào)高脂血癥大鼠血清ALT、AST水平，并使肝臟系數(shù)減??；進(jìn)一步病理觀察發(fā)現(xiàn)，高血脂癥大鼠肝臟細(xì)胞呈現(xiàn)脂肪性病變，燈盞花素可以改善高血脂癥大鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性程度，表明燈盞花素對(duì)高血脂癥大鼠肝臟功能具有保護(hù)作用。

血脂異常升高還可作為一種獨(dú)立的致病因素參與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在高脂條件下，脂質(zhì)可以黏附于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞并穿透至皮下間隙，在細(xì)胞及化學(xué)因子作用下刺激腎小球細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix,ECM）合成和分泌增加，腎小球硬化，腎臟固有細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)改變，功能減退[18-19]。Cr是肌酸代謝的最終產(chǎn)物，由腎小管排泄；BUN是血漿中除蛋白質(zhì)外的一種含氮化合物，由腎小球?yàn)V過(guò)而排出體外，二者均是臨床上檢測(cè)腎臟功能的重要指標(biāo)，其水平升高則提示腎功能受損[20-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高脂血癥模型大鼠血清Cr和BUN水平升高，且腎臟系數(shù)增加，進(jìn)一步病理檢查發(fā)現(xiàn)該模型大鼠腎組織結(jié)構(gòu)明顯擠壓，腎小球硬化，腎小管變性且可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示高脂血癥可造成腎臟損傷。燈盞花素可以下調(diào)高血癥大鼠血清Cr、BUN水平，減小腎臟系數(shù)；改善腎臟病理變化，表明燈盞花素對(duì)高血脂癥大鼠腎臟功能具有保護(hù)作用。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與機(jī)體的能量代謝調(diào)節(jié)過(guò)程，并與多種能量代謝異常疾病密切相關(guān)[22]，而LKB1-AMPK則是肝臟中主要的激活A(yù)MPK的信號(hào)通路。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP升高時(shí)，AMPKα亞基上Thr172位點(diǎn)可被LKB1磷酸化為p-AMPK而激活[23-26]，p-AMPK則可以通過(guò)單磷酸腺苷活化蛋白激酶-白細(xì)胞分化抗原36（AMPK-CD36）、單磷酸腺苷活化蛋白激酶-乙酰輔酶A羧化酶（AMPKACC）、單磷酸腺苷活化蛋白激酶-羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（AMPK-HMG-CoA）等多條通路影響肝臟脂肪酸攝入、氧化及T-CHO的合成[27]。機(jī)體內(nèi)70%-80%的T-CHO在肝臟中合成，涉及多步酶催化反應(yīng)，其中HMGCR是T-CHO合成過(guò)程中的限速酶，其活性降低可以減少膽固醇的合成[28-30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠肝臟組織中AMPK、p-AMPK、LKB1蛋白及mRNA水平降低，LKB1-AMPK通路被抑制，HMGCR蛋白及mRNA水平升高，T-CHO合成增加；燈盞花素可以通過(guò)上調(diào)AMPK、p-AMPK、LKB1蛋白及mRNA水平，下調(diào)HMGCR蛋白及mRNA水平來(lái)提升機(jī)體脂質(zhì)代謝水平。

Notch信號(hào)通路是一條與細(xì)胞增殖、分化、凋亡有關(guān)的重要通路之一，在成熟哺乳類動(dòng)物和人體內(nèi)很少表達(dá)，但在多種腎臟疾病中表達(dá)水平升高[31]。以Notch1-4、DⅡ1-3、Jag1-2及Hey、Hes為代表的Notch信號(hào)受體、配體及胞內(nèi)效應(yīng)器共同參與了腎臟發(fā)育與腎血管形成過(guò)程[32-33]，其中Notch1/Jagged1通路的異常激活與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程有關(guān)。已有研究證實(shí)體外誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞高表達(dá)后可使其胞質(zhì)中Notch1片段大量積累，從而進(jìn)一步激活Notch通路以介導(dǎo)腎損傷過(guò)程；而Notch1在上皮細(xì)胞的異常表達(dá)也能誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化過(guò)程[34-36]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠腎臟組織中Notch1、Jagged1和Hes1蛋白及mRNA水平升高，Notch通路被異常激活，用燈盞花素干預(yù)后Notch1、Jagged1和Hes1蛋白及mRNA水平降低，Notch通路被阻斷，由血脂異常升高引起的腎臟損傷進(jìn)程得到了干預(yù)和延緩，這與腎損傷病理變化一致。

本實(shí)驗(yàn)的小結(jié)如下：①燈盞花素可以明顯降低高血脂癥大鼠血清T-CHO、TG、LDL-C水平，升高HDLC水平，表明燈盞花素具有較好地降血脂作用。②燈盞花素可以改善高血脂癥大鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性程度，表明燈盞花素對(duì)高血脂癥大鼠肝臟功能具有保護(hù)作用。③燈盞花素可以下調(diào)高血癥大鼠血清Cr、BUN水平，減小腎臟系數(shù)；改善腎臟病理變化，表明燈盞花素對(duì)高血脂癥大鼠腎臟功能具有保護(hù)作用。④燈盞花素可通過(guò)激活LKB1/AMPK通路，抑制HMGCR水平來(lái)發(fā)揮其提升脂質(zhì)代謝水平及抑制T-CHO合成的作用。⑤燈盞花素可通過(guò)抑制Notch1/Jagged1通路來(lái)延緩由血脂異常升高引起的腎臟損傷進(jìn)程。⑥6 mg·kg-1和12 mg·kg-1劑量的燈盞花素降血脂及對(duì)肝腎的保護(hù)作用均弱于辛伐他汀，24 mg·kg-1劑量的燈盞花素降血脂及對(duì)肝腎的保護(hù)作用與辛伐他汀相仿。以上觀點(diǎn)均為燈盞花素在高脂血癥治療領(lǐng)域的首次提出，具有較高的研究?jī)r(jià)值。

辨證論治是中醫(yī)精髓所在，高血脂癥臨床治療也要審證求因，做到藥證相對(duì)。與他汀類藥物比較，燈盞花素祛邪之力較強(qiáng)，對(duì)氣滯血瘀型與痰濁阻遏型高脂血癥的療效較好，且在保護(hù)肝腎方面與傳統(tǒng)西藥作用相當(dāng)，適合于長(zhǎng)期用藥。由于中藥的治療作用存在多靶點(diǎn)、多通路共同作用的特點(diǎn)，故深入揭示燈盞花素降血脂及肝腎保護(hù)作用的機(jī)制將是本課題組以后的研究方向。