氣相色譜法測(cè)定魚油脂肪乳注射液中三酰甘油的含量

謝春燕，曾少群，岳峰

（1.廣東嘉博制藥有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511517；2.廣東靜脈脂肪乳工程中心，廣東 清遠(yuǎn) 511517）

魚油在防治冠心病、高血壓、糖尿病、關(guān)節(jié)炎等疾病，以及自身免疫性病變和癌癥中有重要作用，具有極高的營(yíng)養(yǎng)和臨床價(jià)值。魚油中的脂肪酸成分有EPA（二十二碳六烯酸）、DHA（二十碳五烯酸）、棕櫚酸（palmitic acid）、油酸（oleic acid）、9-十六碳烯酸（palmitoleicacid）、肉豆蔻酸（myristic acid）、花生四烯酸（arachidonic acid）、亞油酸（linoleic acid）、亞麻酸（alpha-linolenic acid），其中主要成分DHA和EPA是人體必需的不飽和脂肪酸[1-2]。

EPA和DHA主要有游離型、乙酯型和甘油酯型3種形式。研究結(jié)果顯示，EPA和DHA乙酯在人體中消化和吸收比較困難，可能存在安全隱患，游離型的EPA和DHA容易氧化生成對(duì)人體有害的物質(zhì)，口感不好，直接食用難以被接受。甘油酯型性質(zhì)穩(wěn)定、不易氧化，而且口感好，易被人體消化吸收[3]。天然魚油一般以EPA和DHA甘油酯的形式存在，含量較低，目前廣泛應(yīng)用于乳制品、保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品中的是經(jīng)精制的富含EPA和DHA甘油酯的魚油。

德國(guó)貝朗（B.Braun）公司開發(fā)的魚油中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液（商品名力保魚優(yōu)，Lipoplus），2004年在歐洲上市，2014年在國(guó)內(nèi)上市。該產(chǎn)品采用中鏈甘油三酸酯、大豆油和ω-3精制魚油組合，具有炎癥調(diào)節(jié)作用及減少感染和并發(fā)癥的作用。當(dāng)口服或腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不足、有禁忌或無(wú)法進(jìn)食時(shí)，本品作為腸外營(yíng)養(yǎng)的組成部分，提供包括人體必需ω-6、ω-3脂肪酸在內(nèi)的脂肪。目前國(guó)內(nèi)已有兩個(gè)廠家仿制力保魚優(yōu)的產(chǎn)品并獲得批準(zhǔn)上市，還有費(fèi)森尤斯卡比生產(chǎn)的含精制魚油的多種油脂肪乳注射液（C6～24）。含魚油的脂肪乳注射液在臨床上越來(lái)越受到重視，可為機(jī)體提供必需的能量和代謝底物。此外，還可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)增加機(jī)體免疫力、改善防御能力、減輕氧化應(yīng)激、維護(hù)胃腸功能與結(jié)構(gòu)和促進(jìn)機(jī)體康復(fù)，拓展了其治療臨床危重癥的新途徑[4-5]。

本文測(cè)定的魚油脂肪乳注射液參考力保魚優(yōu)，以中鏈三酰甘油、大豆油和ω-3魚油為主藥。其中ω-3魚油為甘油酯型魚油，中鏈甘油三酸酯的主要成分為辛酸甘油酯和癸酸甘油酯，大豆油主要含油酸甘油酯、亞油酸甘油酯、亞麻酸甘油酯。本文研究的目的是同時(shí)測(cè)定魚油脂肪乳注射液的主要三酰甘油。直接測(cè)定三酰甘油的分析方法主要有高碘酸法、柱層析法、酶法、薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法、高效液相色譜法等，其中化學(xué)法、柱層析法易出錯(cuò)、操作步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)。酶法容易使甘油酯水解，導(dǎo)致脂肪酸位置鑒定困難。

目前儀器分析法是較為常用的方法[6]，有氣相色譜法[7-8]、液相色譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11]、紅外光譜法[12]等。其中高效液相色譜法多以甲醇-水、乙腈-水等為流動(dòng)相體系，EPA甲酯和DHA甲酯的峰形對(duì)稱性較差，與相鄰色譜峰難以有效分離。因脂肪酸甲酯的紫外吸收較弱，選擇220 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，基線噪音大，干擾峰較多，不適合多組分甲酯的測(cè)定[6]。質(zhì)譜法成本較高，紅外光譜法難以準(zhǔn)確定量，而三酰甘油沸點(diǎn)較高，氣相色譜法也很難直接測(cè)定。因此目前多以氣相色譜法測(cè)定脂肪酸甲酯表征對(duì)應(yīng)三酰甘油的含量[13-20]。本文的研究中均以脂肪酸甲酯代替三酰甘油，建立可批量檢測(cè)、操作簡(jiǎn)便、色譜分離完全、專屬性好的氣相色譜檢測(cè)方法，測(cè)定各脂肪酸甲酯，再計(jì)算三酰甘油的含量。

1 儀器與試藥

7820A氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），BT125D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司），AUW220D電子天平（島津儀器有限公司）。

三氯甲烷、甲醇、無(wú)水氯化鈣均為分析純，采購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；正己烷采購(gòu)自Honeywell，甲醇鈉（批號(hào)SHBC0411V）、2，6-二叔丁基甲基苯酚（以下簡(jiǎn)稱BHT，批號(hào)P500117）、十七烷酸甲酯（批號(hào)BCBL1383V，純度99.7%）、辛酸甲酯（MKBN2148，純度99.9%）、癸酸甲酯（BCBS2886V，純度99.6%）、亞油酸甲酯（BCBG7530V，純度99.7%）、EPA甲酯（BCBL3641V，純度99.6%）、DHA甲酯（BCBL9396 V，純度99.6%），辛酸三酰甘油（BCBJ7208V，純度99.6%）、癸酸三酰甘油（SLBB6226V，純度100%）、亞油酸三酰甘油（SLBB9084V，純度98.0%）均采購(gòu)自Sigma。魚油脂肪乳注射液（批號(hào)：15-1，15-2，15-3，廣東嘉博制藥有限公司），規(guī)格是250 mL∶50 g油脂∶3 g磷脂。原研藥（批號(hào)：120578083，德國(guó)貝朗）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；FID檢測(cè)器溫度為275℃；進(jìn)樣口溫度為260℃；載氣：高純氮?dú)猓兌龋?9.99%），載氣流速：1 mL/min；分流比：10∶1；進(jìn)樣量：1 μL。升溫程序：起始溫度為60℃，維持1 min，以每分鐘20℃的速率升至180℃，再以每分鐘4℃的速率升至240℃，保持18 min。

2.2 稀釋劑

取BHT約75 mg，精密稱定，溶于1 000 mL三氯甲烷和500 mL甲醇的混合溶液中，得到稀釋劑。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

取十七烷酸甲酯約100 mg，精密稱定，于50 mL容量瓶中，加入稀釋劑溶解并稀釋至刻度，得到內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（2 mg/L）。精密量取上述溶液10 mL，至100 mL量瓶中，加入稀釋劑稀釋至刻度，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 供試品溶液的制備

精密量取魚油脂肪乳注射液100 μL，至20 mL容量瓶中，加入稀釋劑溶解并稀釋至刻度。精密量取上述溶液與內(nèi)標(biāo)液各1 mL，至具塞試管中，混勻，得到溶液A。在通氮?dú)獾沫h(huán)境下，蒸干溶液A的溶劑，得到殘?jiān)?/p>

將上述殘?jiān)苡? mL正己烷中，加入100 μL甲基化試劑（將1 mL甲醇鈉溶液于1.7 mL甲醇中），混勻并劇烈振蕩。放置30 min，加入約100 mg無(wú)水氯化鈣，搖勻并過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5 混合對(duì)照品溶液的制備

分別取約120 mg辛酸三酰甘油，80 mg癸酸三酰甘油，90 mg亞油酸三酰甘油，16 mg EPA甲酯和11 mg DHA甲酯，精密稱定，至20 mL容量瓶中，加入稀釋劑溶解并定容，得到5種對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述溶液各1 mL，置同一20 mL容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液2 mL，用稀釋劑稀釋至刻度，得到混合對(duì)照品溶液A。取1 mL此溶液，按照“2.4項(xiàng)下”，從“在通氮?dú)獾沫h(huán)境下”開始同法操作，得到混合對(duì)照品溶液。

2.6 單個(gè)對(duì)照品溶液的制備

取“2.5”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL，分別置20 mL容量瓶中，加入稀釋劑稀釋至刻度，得到5種對(duì)照品溶液。取1 mL上述溶液與1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，按照“2.4項(xiàng)下”供試品溶液，從“在通氮?dú)獾沫h(huán)境下”開始同法操作，制備單個(gè)對(duì)照品溶液。

2.7 峰定位溶液的制備

另取辛酸甲酯、癸酸甲酯、亞油酸甲酯、EPA甲酯和DHA甲酯適量，加入稀釋劑溶解，作為峰定位溶液。

2.8 空白溶液的制備

取稀釋劑1 mL，加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，按照“2.4”項(xiàng)下，從“在通氮?dú)獾沫h(huán)境下”開始同法操作，制備空白溶液。

2.9 計(jì)算公式

式中：A對(duì)s為對(duì)照品溶液中待測(cè)物的峰面積；C對(duì)s為對(duì)照品溶液待測(cè)物的濃度；A內(nèi)s為對(duì)照品中內(nèi)標(biāo)的峰面積；C內(nèi)s為內(nèi)標(biāo)的濃度。

式中：f為校正因子；C內(nèi)i為供試品溶液中內(nèi)標(biāo)的濃度；Ai為供試品溶液中待測(cè)組分的峰面積；A內(nèi)i為供試品溶液中內(nèi)標(biāo)的峰面積；a為換算系數(shù)[M三酰甘油/（3×M甲酯）]；M三酰甘油為三酰甘油型化合物的分子量（EPA三酰甘油=945.6/DHA三酰甘油=1023.6）；M甲酯為甲酯型化合物的分子量（EPA甲酯=316.5/DHA甲酯=342.5）。

注：測(cè)定辛酸三酰甘油、癸酸三酰甘油和亞油酸三酰甘油的對(duì)照品均是三酰甘油對(duì)照品，計(jì)算時(shí)不需要換算系數(shù)，200為供試品的稀釋倍數(shù)。

3 方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容

3.1 專屬性

取空白溶液、供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、單個(gè)對(duì)照品溶液和峰定位溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。

結(jié)果顯示：稀釋劑不干擾主成分峰的測(cè)定，供試品溶液中的各目標(biāo)組分色譜峰能與單個(gè)對(duì)照品的色譜峰的保留時(shí)間一致。供試品溶液色譜圖中，目標(biāo)組分色譜峰與相鄰色譜峰分離度不小于1.5。

3.2 線性和范圍

取“2.5”項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置同一20 mL容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液2 mL，用稀釋劑稀釋至刻度。精密量取上述溶液1 mL，按“2.4”項(xiàng)下，從“在通氮?dú)獾沫h(huán)境下”開始同法操作，得到系列濃度的混合對(duì)照品溶液，注入色譜儀。以濃度為橫坐標(biāo)，各組分與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，各對(duì)照品組分在各濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 進(jìn)樣重復(fù)性

取“2.4”項(xiàng)下制備的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，以峰面積計(jì)算RSD值，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，進(jìn)樣6針各脂肪酸甲酯的峰面積RSD＜1.0%，進(jìn)樣重復(fù)性良好。

表2 進(jìn)樣重復(fù)性Table 2 Repeatability of injections

3.4 重復(fù)性

按“2.4”項(xiàng)下方法，制備6份供試品溶液，注入色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算各甘油三酸酯含量和RSD，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，6份供試品中各三酰甘油的含量RSD＜1.5%，供試品測(cè)定重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性結(jié)果Table 3 Results of reproducibility ρ/（g·L-1）

3.5 中間精密度

由不同的實(shí)驗(yàn)員在不同的日期，按“3.4”項(xiàng)下測(cè)定本品各三酰甘油含量，計(jì)算RSD。結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，不同實(shí)驗(yàn)人員測(cè)定各三酰甘油含量的RSD均小于2.0%，方法精密度良好。

表4 中間精密度結(jié)果Table 4 Results of intermediate precision（n=12） ρ/（g·L-1）

圖1 各溶液色譜圖Figure 1 Chromatograms of solutions

表1 線性試驗(yàn)Table 1 Linear test ρ/（g·L-1）

3.6 回收率

取約150 mg辛酸三酰甘油，100 mg癸酸三酰甘油、112 mg亞油酸三酰甘油、20 mg EPA甲酯、14 mg DHA甲酯置同一50 mL量瓶中，精密稱定，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，得到對(duì)照品儲(chǔ)備液。

精密量取魚油脂肪乳注射液0.25 mL，共9份，分別置于100 mL容量瓶中，分別加入上述對(duì)照品儲(chǔ)備液3、5、7 mL（每個(gè)濃度制備3份溶液），用稀釋劑稀釋至刻度。得到相當(dāng)于供試品濃度80%、100%、120%的溶液。分別精密取1 mL上述溶液和1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，按照“2.4”項(xiàng)下同法處理。所得溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果見表5，三酰甘油的平均回收率在99.4%～100.2%之間，RSD在1.3%～4.4%之間，方法的準(zhǔn)確度良好。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of recoveries

3.7 檢測(cè)限和定量限

取混合對(duì)照品溶液，通過(guò)逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣，使目標(biāo)化合物峰信噪比值約為10∶1，作為定量限濃度。確定濃度后連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算保留時(shí)間RSD。使目標(biāo)化合物峰信噪比值約為3∶1，作為檢測(cè)限濃度。結(jié)果見表6。

表6 定量限和檢測(cè)限結(jié)果Table 6 Results of LOQ and LOD

3.8 耐用性

3.8.1 供試品溶液穩(wěn)定性取供試品溶液，分別于0、4、8、16、24、48 h進(jìn)樣，以各脂肪酸甲酯與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值計(jì)算RSD。結(jié)果見表7，供試品溶液放置48 h，峰面積比值RSD均小于1.0%，供試品溶液放置48 h穩(wěn)定性良好。

表7 供試品溶液穩(wěn)定性結(jié)果Table 7 Results of solution stability

3.8.2 色譜條件變化取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液，起始柱溫變化±5℃、載氣流速變化±20%，分別測(cè)定各三酰甘油的含量。結(jié)果見表8，起始柱溫變化±5℃、載氣流速變化±20%，對(duì)測(cè)定結(jié)果未見顯著影響。各三酰甘油的含量RSD均小于1.5%，方法耐用性良好。

表8 耐用性結(jié)果Table 8 Results of robustnessρ（/g·L-1）

3.9 樣品測(cè)定

取本品3批和原研藥一批，按照“2試驗(yàn)方法”項(xiàng)下，分別測(cè)定各三酰甘油的含量，結(jié)果見表9。結(jié)果顯示自研制劑的含量不低于原研藥，且符合本品擬定的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：本品含中鏈三酰甘油（辛酸三酰甘油+癸酸三酰甘油）應(yīng)為95.0～105.0 g/L，含大豆油（按亞油酸三酰甘油計(jì)）不得低于40 g/L，含EPA三酰甘油（C20∶5n-3）和DHA三酰甘油（C22∶6n-3）含量之和不得低于11.0 g/L。

表9 樣品測(cè)定Table 9 Determination of samples ρ/（g·L-1）

4 討論

魚油富含ω-3多不飽和脂肪酸和三酰甘油，制備魚油注射液的油相多為大豆油、棕櫚油、卵磷脂等油脂類，油脂的主要成分為三酰甘油。氣相色譜法適合大多數(shù)的脂肪和脂肪酸，先把脂肪中的三酰甘油進(jìn)行水解得到脂肪酸，脂肪酸經(jīng)甲酯化得到脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯在FID檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器上響應(yīng)好，峰型對(duì)稱，塔板數(shù)高[13-14]。如果脂肪類樣品甲酯化不完全，樣品中可能會(huì)殘留三酰甘油、二酯和單酯，進(jìn)入氣相色譜柱容易沉積在固定液表面，降低色譜柱的柱效。因此需要選擇方便、快捷的甲酯化方法。常用的甲酯化方法為酸催化和堿催化[15-18]，包括三氟化硼甲醇法[21]、鹽酸甲醇法[22]、氫氧化鈉甲醇法[23]、乙酰氯甲醇法[24]。本文分別使用氫氧化鉀-甲醇，硫酸-甲醇加熱回流和甲醇鈉等方法進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)甲酯化效果進(jìn)行比較，最終確定了以甲醇鈉作為甲酯化試劑，操作簡(jiǎn)便，確保三酰甘油和脂肪酸全部轉(zhuǎn)化為甲酯。

本品經(jīng)甲酯化后得到的亞油酸甲酯、EPA甲酯和DHA甲酯含雙鍵，EPA和DHA分別含有4個(gè)和5個(gè)活潑的亞甲基，此類亞甲基的存在使二者極易受到光、氧、高溫、自由基及金屬元素的影響，產(chǎn)生氧化、酸敗、聚合、雙鍵共軛等化學(xué)反應(yīng)[19]。甲酯化過(guò)程需要經(jīng)過(guò)水浴蒸干溶劑、甲基化反應(yīng)、過(guò)濾等一系列操作，因此需要在樣品溶液中加入抗氧化劑保護(hù)不飽和脂肪酸。本研究參考?xì)W洲藥典（EP）通則[20]選擇的BHT抗氧化能力強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中的溶解性較好，在樣品處理中能有效防止不飽和脂肪酸的氧化。

本處方的輔料為磷脂、甘油、氫氧化鈉、水，以上輔料除卵磷脂可能含少量三酰甘油（不多于3%），蛋黃卵磷脂的處方量為1.2%，綜合評(píng)估均不干擾主成分的測(cè)定，因此本研究沒有做輔料干擾試驗(yàn)。

本文采用直接進(jìn)樣毛細(xì)管柱氣相色譜法測(cè)定魚油脂肪乳注射液中三酰甘油的含量，結(jié)果表明線性關(guān)系良好，方法重現(xiàn)性好，平均回收率在99.4%～100.2%之間，回收率高，可更好地進(jìn)行產(chǎn)品的質(zhì)量控制。