基于網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術探討刺梨治療高血脂癥的作用機制

季嘉城，袁敏艷 ，張 碩，唐 麗 ，王鵬嬌 ，張 敏，3，高秀麗，3，4

(1.省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室/貴州醫(yī)科大學藥學院，2.貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州高等學校微生物與生化藥學工程中心，4.貴州省食品營養(yǎng)與健康工程研究中心，貴州 貴陽 550025)

高血脂癥(hyperlipidemia)以血清脂質或脂蛋白異常為特征，主要表現(xiàn)為總膽固醇和甘油三酯水平升高[1]。隨著現(xiàn)代飲食結構的變化，高脂血癥的發(fā)病率出現(xiàn)了顯著提升，高血脂癥已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題[1]。目前，主要用于高血脂癥的為他汀類藥物、膽汁酸螯合劑等藥物，但是長期服用會帶來嚴重如橫紋肌溶解、腹瀉等不良反應[2-3]。因此，藥物的有效性和安全性仍有待探索，新的高血脂癥的干預或者治療策略也有待進一步的發(fā)現(xiàn)。

刺梨(RosaroxburghiiTratt)作為一種藥食同源民族藥，被收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》中。刺梨富含各種營養(yǎng)和功能成分，包括黃酮類化合物、維生素C、三萜類化合物、有機酸、多酚類化合物和超氧化物歧化酶[4]。近年來，由于刺梨具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化和抗腫瘤的作用[5]，它已引起越來越多的關注。目前，對于刺梨治療高血脂癥研究及作用機制研究比較欠缺。本研究結合藥效學實驗和網(wǎng)絡藥理學-分子對接，初步探索了刺梨對高血脂癥的治療作用和可能的作用機制，為深入研究藥效物質基礎、作用機制以及臨床應用提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 刺梨降血脂作用研究

1.1.1高血脂大鼠模型的構建 刺梨原汁由“貴農(nóng)5號”鮮果壓榨得到，采用比色法和HPLC法(Agilent Technologies，USA)測定總多酚含量為(31.26±0.13) g·L-1、總黃酮含量為(9.59±0.15) g·L-1、總多糖含量為(14.52±0.20) g·L-1、維生素C含量為(13.45±0.09) g·L-1。雄性Sprague-Dawley大鼠(180～200 g，SPF)購自貴州醫(yī)科大學動物中心(許可證號：SYXK(黔)2018-0001)，實驗所用刺梨均為同一型號、同一批次。動物實驗得到了貴州醫(yī)科大學動物實驗中心和貴州醫(yī)科大學動物倫理委員會的批準，并按照國家實驗動物福利和動物實驗倫理要求的準則進行。18只SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周，將18只隨機分為空白組(n=6)和高脂組(n=12)，空白組喂普通飼料，高脂組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周，高脂飼料(18%豬油、2%膽固醇、0.2%膽汁鹽和79.8%基礎飼料)，血清TG、TC水平與空白組具有顯著性差異，視為造模成功。造模期間自由飲食飲水，造模成功大鼠分為2組(n=6)，分別為模型組和刺梨組，根據(jù)大鼠體重調(diào)整灌胃劑量，刺梨組給予刺梨原汁灌胃10 mL·kg-1，模型組與空白組灌胃等量生理鹽水?？瞻捉M給予基礎飼料，模型組和刺梨組給予高脂飼料。實驗期間大鼠自由飲食飲水，每周記錄體重，治療周期為3個月。

1.1.2理化指標測定 將血樣在室溫(24±2) ℃下放置1 h，在4 ℃下以3 000 r·min-1離心10 min，分離血清并儲存在-20 ℃。血清脂質指標包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)(南京市建成生物工程研究所，中國南京)使用商業(yè)試劑盒進行測量。

1.1.3肝臟組織切片分析 解剖摘取各組大鼠肝臟，經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、包埋、切片、染色、封片，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察肝臟組織結構。

1.2 刺梨治療高血脂癥網(wǎng)絡藥理學分析

1.2.1刺梨的活性成分庫建立 由于中草藥系統(tǒng)藥理學平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫未收錄“刺梨”，根據(jù)已發(fā)表的有關刺梨成分的文獻，書籍，并結合中藥與化學成分數(shù)據(jù)庫(http：//www.chemcpd.csdb.cn/cmpref/main/tcm_introduce.asp)，收集了刺梨的化學成分。利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找收集的化學成分的2D結構的SDF文件，將該文件導入SwissADME(http：//www.swissadme.ch)了解成分的胃腸道吸收性、類藥性以及能否穿透血腦屏障，篩選條件：GIabsorption為Yes、Druglikeness(包括Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)5項特性中3項為Yes；符合篩選條件的有效成分。通過SwissTargetPrediction (http：//www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫搜集的作用靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)對所有靶基因名稱進行校正，獲得靶點信息。

1.2.2靶點庫建立 以“Hyperlipidemia”為檢索詞，對DrugBank數(shù)據(jù)庫(https：//www.drugbank.ca)、Online Mendelian Inheritance in Man Database(OMIM)數(shù)據(jù)庫(https：//www.omim.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org)進行檢索，合并數(shù)據(jù)庫的過濾結果，刪除重復靶點，獲得高血脂癥相關基因靶點。

1.2.3刺梨降血脂潛在靶點的預測 利用在線工具Venny2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對刺梨的作用靶點與高血脂相關基因靶點互相映射，得到二者的交集靶點，即刺梨降血脂的潛在靶點。

1.2.4蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡的構建和關鍵靶點的篩選 將刺梨治療高血脂的潛在靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)構建PPI網(wǎng)絡。蛋白物種設置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設置為“high confidence>0.9”，并隱藏游離的靶標，其余參數(shù)保持默認設置，得到靶蛋白之間的PPI網(wǎng)絡圖及相互信息數(shù)據(jù)表，利用Cytoscape3.7.2軟件中Network Analyzer插件對以上結果進行網(wǎng)絡拓撲參數(shù)分析。

1.2.5“中藥-活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡的構建 將刺梨的主要活性成分與潛在靶點導入Cytoscape3.7.2軟件中，繪制“中藥-活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡。

1.2.6關鍵靶蛋白GO富集分析和KEGG通路分析 使用DAVIDV6.8數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov)對潛在的治療靶標基因進行基因本體(Gene Ontology，Go)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，獲得刺梨治療高血脂的生物學過程、細胞組分、分子功能和相關信號通路關系。

1.2.7分子對接 通過Pubchem網(wǎng)站(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索獲取化合物的SDF結構文件，并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉化為PDB文件，從Protein Data Bank (http：//www.rcsb.org/pdb)數(shù)據(jù)庫中檢索獲得受體蛋白RXRA(PDB：3NSQ)、AKT1(PDB：4EKL)、ESR1(PDB：5GS4)、PIK3R1(PDB：4WAF)，利用PYMOL 2.3.4軟件對受體蛋白進行去水、去配體等操作，采用AutoDockTools軟件對受體蛋白進行加氫、平衡電荷等修飾，利用AutoDock Vina 1.1.2對受體蛋白與配體小分子進行分子對接，結合能打分。

2 結果

2.1 刺梨降血脂作用研究

2.1.1刺梨對血脂的影響 由Tab 1知，與空白組比，模型組血清TC水平、TG水平、LDL-C水平明顯升高(P<0.05)，HDL-C水平明顯下降(P<0.05)，表明高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠出現(xiàn)血脂異常。經(jīng)刺梨治療后，與模型組比，刺梨組TC、TG、LDL-C水平明顯下降(P<0.05)，HDL-C水平明顯增加(P<0.05)，與空白組相比差異無顯著性(P>0.05)。以上研究結果表明，刺梨能明顯改善高脂飼料誘導的大鼠血脂異常、維持血脂水平穩(wěn)定。

Tab 1 Effect of Rosa roxburghii Tratt on body weight and serum biochemical index of

2.1.2刺梨對肝臟功能的影響 肝臟指數(shù)在一定程度上可以反映肝臟的健康狀況。高血脂組的肝臟指數(shù)均明顯高于空白組(P<0.05)，說明脂肪在肝臟積聚較為嚴重，給藥刺梨后，肝臟指數(shù)明顯降低，見Tab 1。HE染色顯示，模型組肝小葉結構嚴重紊亂，只有少部分肝小葉結構正常，脂肪空泡占整個視野區(qū)域面積小于3/4，脂肪空泡相互融合成片；脂肪空泡集中區(qū)域部分肝細胞體積增大，細胞質著色淺，部分細胞壞死，細胞核溶解。經(jīng)過刺梨治療后肝小葉清晰可見，肝細胞間分布的大小不等的脂肪空泡減少(Fig 1)。結果表明，刺梨汁能顯著改善高脂飼料誘導的大鼠肝臟功能的損傷。

2.2 網(wǎng)絡藥理學及分子對接

2.2.1刺梨活性成分及相關靶標獲取 通過已發(fā)表的有關刺梨成分的文獻，并結合中藥與化學成分數(shù)據(jù)庫檢索得到主要活性化合物14個，槲皮素、棕櫚酸、原兒茶酸、沒食子酸、丁香酸、4-羥基苯甲酸、咖啡酸、鞣花酸、山奈酚、月桂酸、β-谷甾醇、Roxburic acid、α-亞麻酸、4-羥基肉桂酸，共對應347個靶標。

2.2.2高血脂相關靶標篩選和交集靶標獲取 將Genecard數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫和Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索到的高血脂的靶標結果合并，去除重復值，獲得高血脂相關基因疾病靶點1 489個，使用Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對347個刺梨藥物靶點與1 489個高血脂相關基因靶點進行互相映射，獲得129個刺梨治療高血脂癥的交集靶點，如Fig 2。

2.2.3“中藥-活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡 將交集靶點、活性成分、中藥信息導入Cytoscape3.7.2軟件進行可視化分析處理，獲得“中藥-活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡圖，如Fig 3。

2.2.4PPI網(wǎng)絡和關鍵靶點 將刺梨治療高血脂癥的129個潛在靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為Homo Sapiens，設置最低置信度為0.9，同時隱藏游離的點，靶蛋白相互作用信息導入Cytoscape3.7.2軟件中，進行可視化分析，構建PPI網(wǎng)絡關系圖，見Fig 3，該網(wǎng)絡關系圖中，包含104個節(jié)點和534條邊。利用“Analyze Network”功能對PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析，計算出各節(jié)點的度值(degree)、介數(shù)中心性(Between nesscentrality，BC)和接近中心性(Closeness centrality，CC)，其中degree的中位數(shù)為4，BC的中位數(shù)為0.0049，CC的中位數(shù)為0.3055，以degree≥4且BC≥0.0049且CC≥0.3055為篩選出符合的靶蛋白有30個，即為刺梨治療高血脂的關鍵靶點，見Fig 4和Tab 2。按照度值對關鍵靶蛋白進行排序，將前4個靶點作為核心靶點即RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1。

Fig 1 HE staining of liver tissues of rats(×20)A:Control;B:Model;C:Rosa roxburghii Tratt

Fig 2 Venn diagram of Rosa roxburghii Tratt hyperlipidemia target

Fig 3 Traditional Chinese medicine -active ingredients-potential therapeutic targets

2.2.5GO富集分析 為進一步闡明交集靶點的潛在作用，本研究通過對交集靶點進行富集分析。運用David數(shù)據(jù)對刺梨降血脂的潛在靶點進行GO生物學過程富集分析。GO包括生物學過程(BP)，分子功能(MF)以及細胞組分(CC)，共富集到262條GO條目，其中包括190條生物學過程，54條分子功能和18條細胞組分，見Fig 5。生物學過程涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II pro-moter)、凋亡過程的負調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、信號傳導(signal transduction)、類固醇激素介導的信號通路(steroid hormone mediated signaling pathway)、蛋白質磷酸化的正向調(diào)控(positive regulation of protein phosphorylation)等。

Fig 4 Protein interaction network of therapeutic targets of Rosa roxburghii Tratt

Tab 2 Key protein topological parameters of protein-protein interaction network

Fig 5 GO functional enrichment analysis

2.2.6KEGG富集分析 KEGG分析主要涉及癌癥通路(Pathways in cancer)、癌癥蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、甲狀腺激素信號通路(Thyroid hormone signaling pathway)、非酒精性脂肪肝疾病(Non-alcoholic fatty liver disease)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、TNF-信號通路(TNF signaling pathway)等，見Fig 6。

Fig 6 Top20 of KEGG enrichment result

2.2.7分子對接 從成分-核心靶點網(wǎng)絡中將基因靶點以 degree 值高低進行排序，選取前4個關鍵靶點(RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1)，分別與刺梨治療高血脂癥的2個關鍵藥效成分(Roxburic acid和α-亞麻酸)進行分子對接，對接結合能如表Tab 3所示。2個關鍵藥效成分與4個靶標蛋白的結合能均小于0，其中刺梨酸與4個關鍵靶點的結合很好，均小于-5 kcal·mol-1，提示分子間具有很好的結合活性。其對接結果進行可視化如Fig 7所示，見Tab 3。通過Discovery Studio和 PyMOL對結合能最低的組合進行相互作用模式分析，受體蛋白AKT1與Roxburic acid配體小分子之間的結合模式，氨基酸殘基Asp292、Asp274與Roxburic acid配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Lys276、Thr312、Leu295、Gly311、Cys310、Phe309、Glu191、Phe161與Roxburic acid配體小分子形成疏水相互作用，共同維持和AKT1之間的穩(wěn)定構象。

Tab 3 The docking score of Rosa roxburghii Tratt active component and target protein

3 討論

本文通過構建高血脂大鼠模型，研究刺梨對高血脂大鼠的治療作用，結果表明，刺梨明顯降低了高血脂癥大鼠體重，血清TC水平、TG水平、LDL-C水平明顯(P<0.05)，明顯提高了HDL-C水平(P<0.05)，同時刺梨顯著改善了高血脂飲食引起的肝臟功能的損傷，綜上所述，刺梨具有很好的治療高血

Fig 7 Molecular docking model of Roxburic acid with target proteinA：Docking results of AKT1-Roxburic acid;B：Docking results of ESR1-Roxburic acid;C：Docking results of RXRA-Roxburic acid;D：Docking results of PIK3R1-Roxburic acid

脂癥的作用。

本研究共篩選出刺梨活性成分14個，其中主要活性成分有Roxburic acid、α-亞麻酸、山奈酚、槲皮素、鞣花酸等，α-亞麻酸是一種主要來源于植物的ω-3多不飽和脂肪酸，補充α-亞麻酸可明顯改善血脂水平，降低心血管疾病的風險[6-7]；山奈酚通過調(diào)節(jié)脂質代謝、增加能量消耗來改善肥胖[8-9]；槲皮素對肥胖、脂代謝、糖代謝和氧化應激均有明顯的影響[9]；鞣花酸具有改善血脂異常、抗腫瘤、抗突變及抗炎等作用[10]。

通過PPI 網(wǎng)絡拓撲分析得出30個核心靶點，涉及RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1、PIK3CA、RXRG、RXRB、TNF等30個核心靶點，對30個核心靶點進行GO功能和 KEGG 通路富集分析。KEGG 富集通路主要涉及PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路、非酒精性脂肪肝疾病、MAPK信號通路、TNF-信號通路等，這些通路在調(diào)節(jié)能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。

本研究將篩選出的核心成分與關鍵靶點分子對接，2個關鍵藥效成分與4個靶標蛋白的結合能均小于0，提示刺梨中的核心成分與關鍵靶點有著較好的結合活性，說明它們可能是治療高血脂癥的潛在活性成分。RXRA是核配體激活轉錄因子家族成員，參與脂肪酸代謝、膽固醇代謝等多個生物過程，調(diào)節(jié)脂質代謝中的穩(wěn)態(tài)[11-12]。ESR1介導SCL2A4基因表達來影響著脂肪的正常轉化，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖代謝紊亂的作用[13-14]。AKT1和PIK3R1通過影響PI3K/AKT信號轉導通路中發(fā)揮著調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)脂肪酸合成的作用[15-17]。分子對接結果顯示，RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1與Roxburic acid與α-亞麻酸具有很好的結合，其中Roxburic acid 與RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1具有更好的結合，Roxburic acid作為五環(huán)三萜類化合物[18]，目前還缺少對它的研究報告，分子對接的結果顯示，Roxburic acid在刺梨降血脂中可能發(fā)揮著重要的作用，還需我們進一步的研究與探索。

綜上所述，本研究通過構建高血脂大鼠模型，研究了刺梨對高血脂癥的治療作用，運用網(wǎng)絡藥理學分析和分子對接驗證，預測出刺梨治療高血脂癥的作用靶點和主要信號通路。其中關鍵作用靶點有RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1、PIK3CA、RXRG、RXRB、TNF等，關鍵通路主要涉及PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路、非酒精性脂肪肝疾病、MAPK信號通路、TNF信號通路等。刺梨對高血脂癥具有很好的治療作用，同時通過影響著多靶點、多個相關通路來發(fā)揮降低血脂的作用，這也為我們后續(xù)的作用機制進一步探索提供一定的參考。