雷公藤治療乳腺癌主要活性成分篩選及分子機制探討

陳蘋蘋，潘永梅，李 夢，崔春雪，劉彥雙，王麗梅，劉 菲，2

(1.河北中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，河北 石家莊 050200;2.河北省中醫(yī)藥康養(yǎng)照護研究重點實驗室，河北 石家莊 050200；3.河北中醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合學院，河北 石家莊 050200)

乳腺癌(breast cancer，BC)是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的一種惡性腫瘤。近年來發(fā)病率持續(xù)上升，并且呈年輕化趨勢，是嚴重威脅我國乃至全世界女性健康的惡性腫瘤之一。乳腺癌中醫(yī)稱為“乳巖”、“乳石癰”，以乳房部腫塊，質(zhì)地堅硬，疼痛日增為主要表現(xiàn)[1]。

中草藥抗腫瘤臨床應(yīng)用歷史悠久，雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)為衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，具有活血通絡(luò)、消腫止痛等功效。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主治頭風、癰腫、乳腫、疝瘕[2]。中醫(yī)認為乳腺癌的治療應(yīng)活血化瘀、軟堅散結(jié)。雷公藤活血通絡(luò)，消腫散結(jié)止痛，切中病機，能對乳巖發(fā)揮很好的治療作用。臨床研究顯示，在三陰性乳腺癌的辨證施治過程中，對照組給予柴胡疏肝散和補中益氣湯，實驗組在此基礎(chǔ)上加用雷公藤治療，可顯著提高實驗組患者的三年生存率[3]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤主要活性成分對乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細胞具有抑制作用[4-5]。

為了進一步研究雷公藤的抗乳腺癌作用，從而更好的應(yīng)用于臨床。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)篩選雷公藤活性成分，尋找其與乳腺癌靶點之間的關(guān)系。并利用細胞學實驗進一步驗證核心成分的抗乳腺癌活性。為雷公藤抗乳腺癌機制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雷公藤活性成分獲取利用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(TCMSP，http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php )收集雷公藤所有化學成分信息。由于成分較多，首先根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB≥30%)和類藥性( drug-likeness，DL≥0.18)初步篩選活性成分，并根據(jù)目前已報道的雷公藤抗腫瘤成分進行增補，最終確定藥物活性成分。收集活性成分作用靶點，刪除無靶點成分。

1.2 雷公藤抗乳腺潛在靶標篩選利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/ )將收集的雷公藤靶標蛋白轉(zhuǎn)化為基因ID，物種來源限制為人(“Homo Sapiens”)。在人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCard(https：//www.genecards.org)檢索與乳腺癌相關(guān)的靶標基因，選取評分較高相關(guān)性較強的基因與雷公藤活性成分作用靶點取交集，作為雷公藤治療乳腺癌的潛在靶標。

1.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析利用Cytoscape3.6.0軟件構(gòu)建雷公藤治療乳腺癌“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，同時對該網(wǎng)絡(luò)進行核心成分分析。根據(jù)Degree值(連接度)最終認定雷公藤治療乳腺癌的核心成分。

1.4 基因本體(gene ontology，GO)分子功能富集分析應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫(http：//metascape.org/)對雷公藤治療乳腺癌的潛在靶點進行GO分子功能富集分析。

1.5 京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析應(yīng)用Metascape和DAVID 數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)對雷公藤治療乳腺癌潛在靶點進行KEGG通路富集分析，對相關(guān)性前20的通路進一步剖析。

1.6 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)構(gòu)建將篩選的潛在靶點導(dǎo)入蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析平臺String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape3.6.0軟件，對該網(wǎng)絡(luò)進行核心靶點分析，取degree值排名前3的靶點作為雷公藤治療乳腺癌的核心靶點以備進一步分子對接。

1.7 雷公藤與乳腺癌治療核心靶點的分子對接TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載核心成分的3D結(jié)構(gòu)，保存為mol2格式。PDB網(wǎng)站( http：//www.rcsb.org/ )下載靶蛋白結(jié)構(gòu)，利用AutoDock Vina軟件進行分子對接。使用GraphPad Prism 8、Pymol和Maestro 11.9軟件對上述對接結(jié)果進行分析并繪圖。

1.8 CCK-8實驗檢測雷公藤核心成分雷公藤紅素對乳腺癌細胞的抑制作用采用分子對接技術(shù)綜合評價活性成分與靶點的結(jié)合程度，結(jié)果顯示雷公藤紅素與乳腺癌治療核心靶點結(jié)合度較好。因此，實驗進一步驗證雷公藤紅素對乳腺癌細胞的抑制作用。取對數(shù)生長期乳腺癌細胞MCF-7制備單細胞懸液，將細胞以5×104接種于3塊96孔板，每孔接種100 μL。每組設(shè)6個復(fù)孔，加入不同濃度的雷公藤紅素，以1 μmol·L-1鹽酸阿霉素為陽性對照藥，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下孵育24、48、72 h，不同時間點后，每孔棄上清液終止培養(yǎng)，用PBS清洗后，每孔加入20 μL CCK-8，在酶標儀振蕩混勻，選取波長450 nm測定吸收度(A)。以未加細胞孔為空白對照調(diào)零，重復(fù)3次。根據(jù)下列公式計算細胞抑制率，細胞抑制率/%=(1-實驗組吸收度A值/對照組吸收度A值)×100%。根據(jù)細胞抑制率確定雷公藤紅素對乳腺癌細胞活性的影響，并計算IC50。

1.9 克隆形成實驗取對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的MCF-7細胞配制細胞懸液，以每孔800個細胞數(shù)接種于6孔板，培養(yǎng)過夜后分別加入含0.1、1、10 μmol·L-1不同濃度雷公藤紅素的完全培養(yǎng)液，空白對照組加入完全培養(yǎng)液。細胞接受處理48 h后，棄去含雷公藤紅素培養(yǎng)液，用無菌PBS洗去殘留培養(yǎng)液，并加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育14 d后，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，加入甲醇固定15 min，棄去固定液，加入適量新鮮配制的吉姆薩染液染色10 min，流水緩慢洗去染色液，室溫風干，在顯微鏡下計數(shù)≥50個細胞的克隆數(shù)。重復(fù)3次，計算克隆形成率/%=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.10 實時定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(real-time，PCR)將培養(yǎng)72 h的空白組細胞和給予1 μmol·L-1雷公藤紅素的細胞分別加入TRIzol，室溫放置10 min，使其充分裂解。加入氯仿，震蕩混勻后室溫放置15 min，4 ℃，12 000×g離心15 min。小心吸取上層水相，至另一離心管中，加入異丙醇混勻，室溫放置10 min，4 ℃，12 000×g離心10 min。棄上清，RNA沉于管底，加入75%乙醇，溫和震蕩離心管，懸浮沉淀。4 ℃，8 000×g離心5 min，棄盡上清通風廚揮干5 min。25 μL DEPC水溶解，55 ℃，5 min，得到mRNA。選擇純度均在260/280=1.8～2.0之間的mRNA采用Themo逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒合成cDNA，再利用SYBR實時熒光定量PCR(real-time，PCR)試劑盒測定基因(引物序列詳見表1)的表達量，再用2-ΔΔCT法求算目的基因的表達量。ΔCT=CT目的基因-CTBeta-actin，ΔΔCT=ΔCT實驗組-ΔCT對照組。用2-ΔΔCT表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)，當2-ΔΔCT>1時，表明實驗組目的基因表達上調(diào)，當2-ΔΔ△CT<1時，表明實驗組目的基因表達下降。

Tab 1 Sequence of primers

2 結(jié)果

2.1 雷公藤治療乳腺癌的潛在靶點TCMSP平臺收集雷公藤所有化學成分信息。根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18初步篩選并進行增補后，最終確定雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷酚萜甲醚、異落葉松脂素、川陳皮素、山奈酚等共計52個藥物活性成分(Tab 2)。檢索GeneCard數(shù)據(jù)庫篩選并刪除重復(fù)項后共得到乳腺癌相關(guān)的靶點共177個，與雷公藤有效成分靶點基因?qū)Ρ群?，篩選出雷公藤治療乳腺癌的潛在靶標25個(Fig 1)，具體靶點信息如Tab 3所示。

Tab 2 Concrete information about active ingredients of Tripterygium wilfordii Hook.f.

續(xù)表2

Fig 1 Targets of Tripterygium wilfordii Hook. f.in treatment of breast cancer

2.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析利用Cytoscape3.6.0軟件繪制雷公藤治療乳腺癌的“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 2)。結(jié)果篩選出主要活性成分7個，連接度(degree)值前5的活性成分包括雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷酚萜甲醚、川陳皮素和山奈酚。其中，藍色代表活性成分，綠色代表作用靶點，邊則代表藥物與靶點的相互作用。由圖可知雷公藤治療乳腺癌呈現(xiàn)多成分、多靶標的協(xié)同特點。

Fig 2 Herb-active ingredient-target network of Tripterygiumwilfordii Hook. f. in treatment of breast cancer

Tab 3 The potential targets of Tripterygium wilfordii Hook.f.in treatment of breast cancer

Fig 3 GO enrichment and KEGG pathway enrichment in potential targets of Tripterygium wilfordii Hook. f. in treatment of breast cancerA：GO enrichment in Metascape Database；B：KEGG pathway enrichment in Metascape Database；C：KEGG pathway enrichment in DAVID Database

2.3 GO分子功能及KEGG通路富集分析應(yīng)用Metascape和DAVID 數(shù)據(jù)庫對雷公藤治療乳腺癌的25個潛在靶點進行GO分子功能富集分析及KEGG通路富集分析(Fig 3)。

GO分子功能富集結(jié)果顯示，雷公藤治療乳腺癌過程中所調(diào)節(jié)的分子主要涉及轉(zhuǎn)錄因子和抑制轉(zhuǎn)錄因子、核激素受體及腫瘤壞死因子受體等(Fig 3A)。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，差異基因富集通路主要與腫瘤相關(guān)，包括乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌，涉及細胞凋亡、miRNA和MAPK等信號通路過程(Fig 3B、C)。

2.4 PPI構(gòu)建在String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，Cytoscape3.6.0軟件對雷公藤治療乳腺癌的25個靶點構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 4)。結(jié)果顯示degree值排名前3的核心靶點分別是TP53、CCND1和MYC，ESR1、AKT1、VEGF及STAT3在其治療過程中也起到重要作用。

2.5 核心成分與治療靶點分子對接將雷公藤治療乳腺癌的3個核心成分雷公藤甲素、雷公藤紅素和山奈酚與4個核心治療靶點TP53、CCND1、MYC和ESR1的蛋白結(jié)構(gòu)進行分子對接。結(jié)果顯示，3種核心成分中雷公藤紅素與乳腺癌治療核心靶點結(jié)合度較好，其中與CCND1的相互作用最佳，自由結(jié)合能ΔG為-10.30 kca1·mol-1，其次為TP53蛋白(Fig 5A)。分子對接顯示TP53蛋白可在LYS40、LEU48和TYR44位點與雷公藤紅素通過疏水作用穩(wěn)定結(jié)合(Fig 5B)；CCND1蛋白在ARG126、LEU290、ARG26和PHE66位點與雷公藤紅素通過疏水作用結(jié)合(Fig 5C)。

Fig 4 Interaction target network of Tripterygium wilfordiiHook. f. in treatment of breast cancer(Both the size and the color change in circles stand for degree value in descending order)

Fig 5 Results of molecular dockingA：Free binding energy between active ingredients and target;B：Diagram of interaction between TP53 protein and tripterine;C：Diagram of interaction between CCND1 protein and tripterine

2.6 雷公藤紅素對乳腺癌細胞活性的影響根據(jù)CCK-8實驗的結(jié)果(Fig 6)可知，雷公藤紅素抑制乳腺癌細胞的生長，并具有濃度和時間依賴性(與對照組相比P<0.05)，雷公藤紅素對乳腺癌細胞的IC50，在24、48、72 h不同時間點分別為(22.68±1.46)μmol·L-1、(7.56±0.89)μmol·L-1和(0.89±0.067)μmol·L-1。

Fig 6 Concentration-dependent effectof tripterine on MCF-7 viabilityData are means±S.D.from three independent experiments.**P<0.01 vs Control of 24 h，△△P<0.01 vs Control of 48 h，##P<0.01 vs Control of 72 h

2.7 雷公藤紅素對乳腺癌細胞克隆形成的影響根據(jù)平板克隆實驗結(jié)果(Fig 7)可知，雷公藤紅素抑制乳腺癌細胞克隆形成。MCF-7細胞的克隆形成率為(69.54±1.07)%，0.1、1、10 μmol·L-1的雷公藤紅素處理組的克隆形成率分別降至(36.83±1.48)%、(24.67±0.05)%和(10.97±0.03)%(P<0.05)。

Fig 7 Concentration-dependent effectof tripterine on clone of MCF-7

2.8 雷公藤紅素降低TP53、CCND1、MYC和ESR1 mRNA的表達通過Real time qPCR的結(jié)果(Fig 8)，可知給予1 μmol·L-1雷公藤紅素后，TP53、CCND1、MYC和ESR1 mRNA的表達明顯低于空白對照組。

3 討論

雷公藤是一種有悠久應(yīng)用歷史的中藥，其多種活性成分已被證實具有抗腫瘤作用，雷公藤抗癌有效成分開發(fā)及機制研究近幾年受到研究者的廣泛關(guān)注。中醫(yī)藥具有多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)、多靶點的治療特點，研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)全面整合并評估雷公藤抗乳腺癌活性成分。通過數(shù)據(jù)庫比對篩選出雷公藤治療乳腺癌的7個活性成分和25個潛在治療靶點。其中活性最強的抗乳腺癌成分包括雷公藤紅素、雷公藤甲素和山奈酚，4個核心治療靶點為TP53、CCND1、MYC和ESR1，AKT1、VEGF及STAT3也是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。CCK-8、克隆形成實驗及Real-time qPCR初步驗證了最優(yōu)對接單體雷公藤紅素對乳腺癌細胞及核心靶點的抑制作用。

Fig 8 Concentration-dependent effect of tripterine on mRNAof TP53，CCND1，MYC and ESR1A：The melt curve of TP53，CCND1，MYC and ESR1 in the control group and the group of 1 μmol·L-1 tripterine;B：The quantitative representation of TP53，CCND1，MYC and ESR1 mRNA in the control group and the group of 1 μmol·L-1 tripterine on MCF-7 cells，*P<0.05 vs control

雷公藤甲素作為中藥雷公藤的主要活性成分，因其多途徑、多靶點的高效抗腫瘤作用一直以來都是研究的熱點。雷公藤甲素可通過干預(yù)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、阻滯腫瘤細胞周期、影響腫瘤微環(huán)境等機制顯著抑制乳腺癌細胞增殖，其乳腺癌治療效果也得到廣泛認可[6-7]。本研究KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，雷公藤治療乳腺癌過程中差異基因富集通路主要涉及細胞凋亡、miRNA和MAPK等信號通路過程。雷公藤甲素誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡可通過多種途徑實現(xiàn)，包括MAKP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、誘導(dǎo)p53依賴、抗ER活性[8-10]等。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK在乳腺癌中可被顯著激活，其持續(xù)活化過程促進乳腺癌細胞增殖。雷公藤甲素還可通過調(diào)節(jié)ERK1/2-HIF1-α-VEGFA 軸，降低VEGFA水平，從而抑制乳腺癌細胞血管增殖，進而抑制乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移[11]。此外，雷公藤甲素對MDA-MB-468細胞的抗癌活性和對阿霉素增敏作用主要歸因于MDM2介導(dǎo)的AKT激活，其抗腫瘤耐藥作用的發(fā)揮與AKT信號通路密切相關(guān)[12]。

雷公藤紅素屬醌甲基型五環(huán)三萜類化合物，目前發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素對肺癌、卵巢癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種癌細胞具有抑制作用，可在腫瘤細胞增殖、血管新生、癌細胞轉(zhuǎn)移三個階段對癌癥發(fā)生發(fā)展進行干預(yù)，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用[13-14]。雷公藤紅素抗腫瘤作用研究雖起步較晚，但卻極具發(fā)展?jié)摿Α１狙芯糠肿訉咏Y(jié)果顯示，雷公藤紅素與乳腺癌治療核心靶點結(jié)合度最佳，因此，我們利用細胞學實驗進一步考察了雷公藤紅素對乳腺癌治療作用。經(jīng)CCK-8實驗驗證，雷公藤紅素能明顯抑制乳腺癌細胞(MCF-7)的生長并具有濃度和時間依賴性，其對乳腺癌細胞的IC50值約在0.89～23 μmol·L-1之間。有研究顯示，雷公藤紅素可通過調(diào)節(jié)AKT信號通路誘導(dǎo)MDA-MB-231凋亡，其48 h的IC50值為0.93 μmol·L-1[15]，以上結(jié)果均在一定程度上說明雷公藤紅素是雷公藤治療乳腺癌的重要抗癌活性成分。

在雷公藤治療乳腺癌的核心靶點中，雷公藤紅素與細胞周期蛋白D1(CCND1)的相互作用最佳，Real-time qPCR結(jié)果也顯示，雷公藤紅素降低乳腺癌細胞CCND1 mRNA的表達。CCND1的主要功能是促進細胞增殖，是一種公認的原癌基因，其過度表達可致細胞增殖失控[16]，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與CCND1基因過表達和基因擴增有關(guān)。雷公藤紅素與CCND1的高度結(jié)合表明雷公藤紅素可能通過調(diào)節(jié)細胞周期抑制乳腺癌細胞的增殖。平板克隆實驗的周期為14 d，期間經(jīng)過多個細胞分裂周期，干預(yù)48 h后撤去雷公藤紅素繼續(xù)培養(yǎng)。既可評價雷公藤紅素對腫瘤細胞生長的抑制能力，又能說明雷公藤紅素對細胞周期的影響，間接驗證雷公藤紅素干擾了CCND1調(diào)控細胞周期的作用。另外平板克隆實驗在一定程度上還可以看出雷公藤紅素對細胞恢復(fù)能力的影響，克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，接種的細胞必須有增殖活力才能形成克隆，而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。平板克隆形成實驗結(jié)果可進一步驗證雷公藤紅素抑制乳腺癌細胞增殖，且雷公藤紅素處理后的乳腺癌細胞生長恢復(fù)能力變差。據(jù)此推測，雷公藤紅素對乳腺癌復(fù)發(fā)可能有一定抑制作用。此外，分子對接結(jié)果表明，TP53蛋白可在LYS40、LEU48和TYR44位點與雷公藤紅素通過疏水作用穩(wěn)定結(jié)合，Real-time qPCR結(jié)果可知雷公藤紅素降低TP53的表達。TP53 基因的突變(缺失)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，最新研究顯示，TP53是診斷乳腺癌和評價預(yù)后的重要生物標志物[17]。目前關(guān)于TP53蛋白與雷公藤紅素作用機制報道較少，雷公藤紅素抑制乳腺癌細胞生長的具體分子機制尚需進一步深入研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學作為藥理學新興分支學科，可揭示比現(xiàn)代分子藥理學更復(fù)雜的藥理學規(guī)律，特別適用于以多靶標為基礎(chǔ)的中藥學理論及機制研究，但其嚴重受限于現(xiàn)有實驗數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)完整性的劣勢也是不能忽視的[18]。充分利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)，挖掘藥物活性成分，預(yù)測作用靶點，并通過相應(yīng)模型(動物或細胞)對藥物作用進行實驗驗證，兩者結(jié)合可在一定程度更好解析中草藥網(wǎng)絡(luò)藥理學機制。