青藤堿對(duì)有機(jī)錫損傷肝HL02細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制

段治宇，王效蕊，梁婷婷，李青山，3，梁泰剛

(1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 晉中 030600；2.山西省中醫(yī)院，山西 太原 030012；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619)

近幾十年來(lái)，有機(jī)錫化合物在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，如船體防污漆及木材防腐劑等。在使用過(guò)程中，該類(lèi)化合物會(huì)不可避免地向環(huán)境中排放[1]。然而，大多數(shù)有機(jī)錫化合物具有高生物毒性，這些化合物可通過(guò)小腸或皮膚等途徑進(jìn)入人體。特別是三取代體最易被吸收，并主要分布在肝、腎和腦部[2]。其中，作為三丁基氯化錫在人體內(nèi)的主要的降解產(chǎn)物，二氯二丁基錫對(duì)人體產(chǎn)生的危害同樣引起人們的重視。

肝臟作為人體的主要代謝部位，在分子解毒的過(guò)程中可能會(huì)生成過(guò)量的有毒活性氧。這會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成氧化損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)損害這一關(guān)鍵器官的功能[3]。而抗氧化劑的使用可保護(hù)肝臟免受自由基介導(dǎo)的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，一些具有抗氧化作用的天然活性產(chǎn)物對(duì)肝損傷的治療具有顯著效果[4 - 5]。

青藤堿(sinomenine，SIN)是從防己科植物青藤的干燥藤莖中提取的生物堿，具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[6]。此外，SIN具有抗氧化作用[7]。本課題組前期研究證實(shí)了SIN可以保護(hù)H2O2導(dǎo)致的肝HL02細(xì)胞損傷。

本研究通過(guò)建立二氯二丁基錫誘導(dǎo)的HL02細(xì)胞損傷模型觀察SIN對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用及對(duì)凋亡相關(guān)信號(hào)通路的影響，旨在進(jìn)一步闡明SIN發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制，為深入探討其潛在藥用價(jià)值研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器光學(xué)倒置顯微鏡(OPTECBDS200-PH，重慶Optec Instrument公司)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)；臺(tái)式低速離心機(jī)(TD5A-WS，長(zhǎng)沙湘儀有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(TGL-16gR，上海安亭科學(xué)儀器廠)；熒光倒置顯微鏡(IX-51，Olympus)；流式細(xì)胞儀(BD-C6，USA)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(Step One，Applied Biosystems)。

1.2 細(xì)胞株HL02細(xì)胞株來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.3 主要試劑二氯二丁基錫(貨號(hào)205494)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；青藤堿(純度>97%，貨號(hào)S302249)購(gòu)自上海aladdin公司；吖啶橙(AO，貨號(hào)0360-50G)、溴化乙錠(EB，貨號(hào)0492-5G)均購(gòu)自美國(guó)Amerisco公司；活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)C1300-1-2)購(gòu)自北京ApplyGEN公司；雙染凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)KGA106)購(gòu)自江蘇keyGEN BioTECH公司；RNA提取試劑盒(貨號(hào)9753Q)購(gòu)自北京Takara Bio公司；兔抗cleaved caspase-3(貨號(hào)9664)、caspase-9抗體(貨號(hào)9502)均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號(hào)31870082)、胎牛血清(FBS，貨號(hào)10100147)、青鏈霉素雙抗混合液(貨號(hào)15070063)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Life公司；引物合成自生工生物工程有限公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)將HL02細(xì)胞接種于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，將其置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 方法

1.5.1 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

1.5.1.1 SIN毒性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL02細(xì)胞，均勻添加進(jìn)96孔板內(nèi)，孵育過(guò)夜后，分別加入2、4、8、16、32、64、128、256、512 μmol·L-1SIN，24 h后加入10 μL 5 g·L-1MTT。培養(yǎng)4 h后棄去上清液，添加100 μL DMSO，使用酶標(biāo)儀(570 nm)測(cè)量吸光度(OD)值。計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.5.1.2 DBT毒性實(shí)驗(yàn) 將HL02細(xì)胞孵育過(guò)夜后分別加入0.25、1、4、16、32 μmol·L-1DBT孵育24 h。按相同方法計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.5.1.3 SIN保護(hù)活性實(shí)驗(yàn) HL02細(xì)胞經(jīng)SIN(4、8、16 μmol·L-1)培養(yǎng)24 h后加入3 μmol·L-1DBT孵育6 h，測(cè)定OD值。計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.5.2形態(tài)學(xué)觀察 HL02細(xì)胞經(jīng)過(guò)DBT以及SIN處理后，使用倒置顯微鏡(×40)觀察，拍照。

1.5.3AO/EB染色法 HL02細(xì)胞經(jīng)過(guò)DBT以及SIN處理后，添加1 g·L-1AO和EB溶液，暗處孵育15 min，用冷的PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察后拍照。

1.5.4Annexin V-FITC/PI雙染法 使用DBT及不同濃度的SIN處理HL02細(xì)胞，收集細(xì)胞，避光染色。檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5.5ROS含量測(cè)定 HL02細(xì)胞經(jīng)DBT及不同濃度的SIN處理后，加入到10 μmol·L-1DCFH-DA溶液中，37 ℃孵育半小時(shí)，反復(fù)清洗3次后檢測(cè)熒光強(qiáng)度。結(jié)果用實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的平均熒光強(qiáng)度表示。

1.5.6線粒體膜電位檢測(cè) 將JC-1、超純水和染色緩沖液按1 ∶160 ∶40比例配置工作液。取1 mL工作液加入處理后的HL02細(xì)胞樣品中，37 ℃孵育20 min，PBS清洗重懸，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.5.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR 處理后的HL02細(xì)胞提取總RNA，并使用酶標(biāo)儀測(cè)量RNA濃度和純度。之后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的程序獲得到cDNA?；虻南鄬?duì)含量表示為2-ΔΔCt。引物序列如Tab 1所示，內(nèi)參基因是GAPDH。

1.5.8蛋白印記 收集處理后的HL02細(xì)胞，加入裂解液，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，定量，等量等體積蛋白加到上樣孔中進(jìn)行電泳分離。隨后用5%脫脂牛奶封閉1.5 h，一抗在4℃孵育12 h后，二抗室溫培養(yǎng)1 h，顯影，曝光。

Tab 1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 SIN對(duì)DBT誘導(dǎo)HL02細(xì)胞毒性的保護(hù)效果結(jié)果如Fig 1所示，HL02細(xì)胞在不同濃度的SIN(2～512 μmol·L-1)中培養(yǎng)12 h后，濃度低于128 μmol·L-1的SIN未對(duì)HL02細(xì)胞的增殖顯示抑制效果。經(jīng)過(guò)DBT單獨(dú)處理，細(xì)胞活力呈濃度依賴(lài)性降低，IC50值為2.96 μmol·L-1。相比對(duì)照組，DBT處理組的細(xì)胞存活率明顯下降，而使用SIN預(yù)處理可以顯著提升細(xì)胞存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，DBT處理組HL02細(xì)胞變小呈圓珠狀，而不同濃度SIN預(yù)處理后形態(tài)改變的細(xì)胞逐漸減少。

2.2 SIN對(duì)DBT誘導(dǎo)HL02細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果如Fig 2所示，HL02細(xì)胞經(jīng)DBT處理后核染色質(zhì)為桔紅色并呈固縮狀，而不同濃度SIN的預(yù)處理后，上述現(xiàn)象逐漸減少。模型組中細(xì)胞凋亡率為(25.37±0.87)%，而不同濃度SIN預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率分別降為對(duì)照組(22.30±0.50)%、(18.30±1.04)%、(13.07±1.82)%，與單獨(dú)使用DBT處理相比較，SIN組凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 SIN對(duì)DBT誘導(dǎo)HL02細(xì)胞內(nèi)ROS含量及MMP的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 3)，模型組中細(xì)胞內(nèi)ROS為對(duì)照組的(1.99±0.07)倍，而經(jīng)過(guò)不同濃度SIN預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量降低至對(duì)照組的(1.75±0.04)、(1.46±0.04)、(1.25±0.04)倍。同時(shí)，單獨(dú)使用DBT處理降低MMP至對(duì)照組的(0.41±0.04)倍。而經(jīng)不同濃度的SIN預(yù)處理后加入DBT，電位差明顯發(fā)生改變，分別增長(zhǎng)為對(duì)照組的(0.54±0.03)、(0.71±0.05)、(0.83±0.04)倍。

2.4 SIN對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、cytochome c、

Fig 1 The protective effect of SIN on DBT-induced cytotoxicity of HL02 A：Toxicity of SIN on HL02 cells；B：Toxicity of DBT on HL02 cells；C：The protective effect of SIN on the decline of HL02 cell viability induced by DBT；D：Cell morphology observation results.#P<0.05，##P<0.01 vs control；**P<0.01 vs model.

Fig 2 SIN reduced increase of DBT-induced HL02 cell A：The characteristics of cell apoptosis observed by AO/EB fluorescence staining；B：Cell apoptosis rate detected by Annexin V-FITC/PI double staining；C：The corresponding quantitative data of B.##P<0.01 vs control;*P<0.05，**P<0.01 vs model.

Apaf-1、caspase-9和caspase-3 的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示(Fig 4)，DBT能明顯增加Bad、Bax、cytochome-c、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的mRNA水平、降低Bcl-xL和Bcl-2的mRNA水平。而不同濃度SIN的預(yù)處理能明顯逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5 SIN對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響結(jié)果如Fig 5所示，經(jīng)過(guò)DBT單獨(dú)處理，HL02細(xì)胞中的Bcl-2/Bax比例明顯降低。相比之下，SIN的預(yù)處理后二者比例隨SIN濃度的提高而升高(P<0.01)。同時(shí)，caspase-9與cleaved-caspase-3的表達(dá)也降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

自三取代有機(jī)錫化合物因高毒性被禁止使用以來(lái)，二取代有機(jī)錫化合物逐漸發(fā)展。其中，二氯二丁基錫的應(yīng)用十分廣泛。本課題組對(duì)有機(jī)錫類(lèi)化合物的藥理和毒理研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：二氯二丁基錫對(duì)肝細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性。該毒性可能源于自由基引起的氧化損傷。在對(duì)DBT誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性的治療過(guò)程中，我們檢測(cè)了多種中藥活性成分，從中篩選發(fā)現(xiàn)青藤堿具有一定的保護(hù)活性。近期有研究表明，青藤堿可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，凋亡和炎癥發(fā)揮肝保護(hù)作用[8]。

氧化應(yīng)激是肝細(xì)胞損傷重要的機(jī)制之一[9]。過(guò)量的ROS可與生物大分子發(fā)生反應(yīng)，使之失活，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。有研究表明，三苯基錫(TPT)可以誘導(dǎo)HepG2肝細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量ROS，誘導(dǎo)DNA損傷(DNA斷裂)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性[10]。然而，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道青藤堿具有抗氧化應(yīng)激活性。例如：近期Fang等[8]報(bào)道，青藤堿可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，凋亡和炎癥等機(jī)制，對(duì)乙醇誘導(dǎo)的小鼠肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用；Fan等[11]報(bào)道，青藤堿可通過(guò)激活PC12細(xì)胞的內(nèi)源性抗氧化機(jī)制減輕H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。因此，我們推測(cè)青藤堿可能通過(guò)激活肝HL02細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化機(jī)制，清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量ROS，從而保護(hù)線粒體，降低肝細(xì)胞凋亡率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了DBT誘導(dǎo)的HL02細(xì)胞內(nèi)ROS的過(guò)量產(chǎn)生能夠經(jīng)過(guò)SIN的預(yù)處理得到減輕。

Fig 3 SIN reduced DBT-induced ROS production and MMP depolarization in HL02 (A，C)The result of intracellular ROS and MMP measured by flow cytometry.(B，D)The corresponding quantitative data of(A，C).##P<0.01 vs control;*P<0.05，**P<0.01 vs model.

在凋亡發(fā)生的初期，細(xì)胞內(nèi)過(guò)量ROS可以降低抗凋亡蛋白表達(dá)、上調(diào)促凋亡的蛋白表達(dá)。這引起MMP下降與線粒體膜通透性增強(qiáng)[12]。進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中cytochrome-c蛋白增多。其可以和Apaf-1聚合為凋亡體[13]。凋亡體可以激活caspase-9形成cleaved-caspase-9。cleaved-caspase-9進(jìn)一步誘導(dǎo)下游的caspase-3活化形成cleaved-caspase-3并最終可導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。有研究表明，一些mRNA的表達(dá)水平能夠反映相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DBT處理組中Bcl-2和 Bcl-xL的mRNA表達(dá)降低，而B(niǎo)ax、Bad、cytochrome c、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的mRNA表達(dá)升高。經(jīng)過(guò)不同濃度SIN的預(yù)處理，上述結(jié)果發(fā)生逆轉(zhuǎn)。Western blot結(jié)果也證實(shí)SIN能夠顯著提升Bcl-2與Bax的比值、降低caspase-9與cleaved-caspase-3的表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，SIN能夠有效降低DBT誘導(dǎo)的HL02細(xì)胞損傷，其機(jī)制與抑制ROS介導(dǎo)的線粒體凋亡有關(guān)。

Fig 4 The mRNA expression of apoptosis-related ##P<0.01 vs control；**P<0.01 vs model.

Fig 5 Expression of apoptosis-related (A，B)The expression of Bcl-2，Bax，caspase-9 and cleaved-caspase-3 proteins.(C，D)The corresponding quantitative data of(A，B).##P<0.01 vs control;*P<0.05，**P<0.01 vs model.