右美托咪定通過調(diào)控Nrf2減輕HT22細(xì)胞缺氧/復(fù)氧引起的鐵死亡

門運(yùn)政，胡 淼，劉 剛，段方方，童旭輝，黃 杰，金文靜，董淑英,3

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 1.藥學(xué)院藥理學(xué)教研室、2.第一附屬醫(yī)院麻醉科、3.心腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠 233030)

腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其中缺血性腦卒中占比達(dá)80%以上。目前臨床上主要采用溶栓和血管內(nèi)介入療法以恢復(fù)血管再通[1]，然而血液恢復(fù)灌注時(shí)又會(huì)造成腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。

鐵死亡是一種鐵依賴的脂質(zhì)過氧化物的過量累積導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。大量臨床數(shù)據(jù)表明，腦缺血患者腦組織中的鐵水平明顯升高。另有研究報(bào)道，香芹酚通過增加谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)的表達(dá)，抑制沙鼠腦I/R損傷中的鐵死亡，進(jìn)而提高沙鼠腦I/R損傷中海馬神經(jīng)元的存活率[2]，但鐵死亡在腦I/R損傷中具體的作用機(jī)制，仍有待進(jìn)一步的研究。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是胞內(nèi)的重要轉(zhuǎn)錄因子，能夠協(xié)調(diào)胞內(nèi)各種抗氧化基因在應(yīng)激狀態(tài)下的激活，可通過影響脂質(zhì)過氧化的生成進(jìn)而調(diào)控鐵死亡。有研究表明，Nrf2可以通過調(diào)節(jié)其下游基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而提高腫瘤細(xì)胞對鐵死亡的抵抗能力[3]。胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)是編碼谷胱甘肽合成相關(guān)蛋白的基因之一，作為Nrf2的下游，具有抵抗脂質(zhì)過氧化的能力。有研究表明，SLC7A11表達(dá)被抑制后，可導(dǎo)致GPX4活性和抵抗脂質(zhì)過氧化的能力降低，最終發(fā)生鐵死亡[4]。然而，Nrf2是否參與了腦I/R損傷中鐵死亡的發(fā)生仍不清楚。

右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一種臨床上廣泛使用的麻醉輔助用藥，具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮和鎮(zhèn)痛作用[5]。研究表明，DEX對多種組織器官的I/R損傷均具有保護(hù)作用[6]，例如心臟、腎臟和腦等。有文獻(xiàn)報(bào)道，在SK-N-SH細(xì)胞中，DEX的抗氧化作用與其抑制鐵超載有關(guān)[7]。大量研究表明，細(xì)胞內(nèi)鐵離子的超載是誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的主要機(jī)制[8]。然而，DEX在腦I/R損傷中的保護(hù)作用，是否與其對鐵死亡的抑制有關(guān)，卻尚未見報(bào)道。因此本研究采用HT22細(xì)胞H/R損傷模型，探討DEX抗HT22細(xì)胞H/R損傷的作用及其機(jī)制，為DEX在臨床治療腦I/R損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞HT22細(xì)胞購買于中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑鹽酸右美托咪定注射液(貨號H20110076)購自江蘇恩華藥業(yè)有限公司；DMEM干粉(貨號2164119)購自美國Gibco公司；ML385(貨號HY-100523)購自美國MCE公司，丙二醛試劑盒(貨號A003-1)、還原型谷胱甘肽試劑盒(貨號A006-2-1)購自南京建成生物工程研究所，胰蛋白酶(貨號EZ2811A172)購自中國上海Beyotime公司；Nrf2抗體(貨號ab137550)、GPX4抗體(貨號ab125066)、SLC7A11抗體(貨號ab37185)、TFR1抗體(貨號ab8403 )購自英國Abcam公司；GAPDH抗體(貨號10494-1-AP)購自中國Proteintech公司；FerroOrange熒光探針(貨號SH951)購自日本DOJINDO公司，C11 BODIPY 581/591(貨號2115343)購自美國Sigma公司。

1.3 主要儀器酶標(biāo)儀購自美國BioiTek公司，高速冷凍離心機(jī)購自德國艾本德公司，凝膠成像儀購自美國BIO-RAD公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購自上海ESCO公司，缺氧培養(yǎng)箱購自美國賽默飛公司。

1.4 H/R損傷模型建立當(dāng)HT22細(xì)胞占據(jù)培養(yǎng)皿65%左右時(shí)，用PBS清洗細(xì)胞3次，用無血清無糖培養(yǎng)基替換完全培養(yǎng)基至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于缺氧培養(yǎng)箱(94% N2，5% CO2，1% O2)，缺氧12 h，復(fù)糖復(fù)氧24 h。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組HT22細(xì)胞分為:,對照組(Control)、H/R組、DEX低濃度組(H/R+DEX2.5,μmol·L-1)組、DEX中濃度組(H/R+DEX5，5 μmol·L-1)組、DEX高濃度組(H/R+DEX10,10 μmol·L-1)組，探討DEX對HT22細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用的最適濃度；再將HT22細(xì)胞分為4組，即Control、H/R組、H/R+DEX5組和H/R+DEX5+ML385組，進(jìn)一步探究DEX對HT22細(xì)胞H/R保護(hù)作用的機(jī)制。DEX在缺氧時(shí)加入；ML385于復(fù)氧時(shí)立即加入，終濃度為2 μmol·L-1。

1.6 細(xì)胞存活率檢測HT22細(xì)胞接種于96孔板中，分組給藥并處理后，每孔加入20 μL MTT試劑，繼續(xù)孵育4 h。孵育完成后，于孔中加入DMSO，37 ℃烘箱中孵育0.5 h。孵育完成后檢測各孔在490 nm波長處的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.7 細(xì)胞中Fe2+的檢測消化并收集細(xì)胞，將HT22細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，待細(xì)胞長至適宜密度時(shí)，根據(jù)分組，給藥處理。處理后棄去培養(yǎng)液，加入FerroOrange工作液，37 ℃孵育20 min。活細(xì)胞工作站下觀察細(xì)胞，并進(jìn)行圖像采集。

1.8 細(xì)胞內(nèi)Lipid ROS檢測取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于6孔板中培養(yǎng)，按照實(shí)驗(yàn)分組完成相應(yīng)的處理，加入C11 BODIPY 581/591染液，在培養(yǎng)箱中孵育0.5 h。棄去各孔中的培養(yǎng)液，消化并收集細(xì)胞，隨后用250 μL PBS重懸，最后將重懸液通過流式細(xì)胞儀檢測，并數(shù)據(jù)收集。

1.9 MDA、GSH含量檢測不同實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，給藥處理后，消化并收集細(xì)胞，超聲破碎后按照MDA，GSH說明書中的操作于532 nm、405 nm處檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中MDA、GSH的含量。

1.10 Western blot檢測蛋白收集并裂解細(xì)胞，隨后進(jìn)行定量、上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗過夜(Nrf2、TFR1、SLC7A11、GPX4抗體稀釋比例均為1 ∶1 500，GAPDH抗體稀釋比例為1 ∶3 000)。次日孵育二抗，隨后用凝膠成像儀對蛋白條進(jìn)行成像并用Bio Imaging System對圖像進(jìn)行灰度掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 DEX對H/R損傷HT22 細(xì)胞存活率的影響結(jié)果顯示，經(jīng)H/R處理后HT22細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.01)；H/R+DEX2.5、H/R+DEX5、H/R+DEX10組HT22細(xì)胞存活率相較于H/R組均有不同程度的升高(P<0.05)，且H/R+DEX5組與H/R+DEX10組HT22細(xì)胞存活率升高較為明顯(P<0.01)。同時(shí)H/R+DEX5，H/R+DEX10兩組細(xì)胞存活率無明顯差異，所以后續(xù)均采用5 μmol·L-1的DEX開展實(shí)驗(yàn)。B圖顯示，在使用DEX的基礎(chǔ)上使用Nrf2抑制劑ML385(2 μmol·L-1)[9]后，HT22細(xì)胞存活率較H/R+DEX5組降低(P<0.01)。

2.2 DEX對H/R損傷HT22細(xì)胞中Nrf2 蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示，相較于Control組，H/R損傷后的Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；相較于H/R組，DEX處理后中Nrf2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；相較于H/R+DEX組，在DEX基礎(chǔ)上使用ML385后，Nrf2蛋白表達(dá)又明顯降低(P<0.01)。

2.3 DEX對H/R損傷HT22細(xì)胞中Fe2+、Lipid ROS、MDA及GSH的影響采用FerroOrange作為熒光探針，對細(xì)胞內(nèi)Fe2+進(jìn)行熒光成像。結(jié)果顯示，與Control組相比較，H/R組Fe2+熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明細(xì)胞中的Fe2+含量增加；與H/R組相比，H/R+DEX5組Fe2+熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量減少；與H/R+DEX5組相比，H/R+DEX5+ML385組Fe2+熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，胞內(nèi)Fe2+含量增加。

Fig 1 Effect of DEX and ML385 on survival rates of HT22 cells with H/R n=3)A:Different concentrations of DEX increased the survival fraction of HT22 cells with H/R injury；B:ML385 attenuated the protective effect of DEX with H/R injury on HT22 cells n=3).##P<0.01 vs Control;△P<0.05,△△P<0.01 vs H/R;**P<0.01 vs H/R+DEX5+ML385.

Fig 2 Effect of DEX on expression of Nrf2 protein on HT22 cells with H/R injury n=3)##P<0.01 vs Control;△P<0.05 vs H/R;**P<0.01 vs H/R+DEX5+ML385

用流式細(xì)胞儀分析各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Lipid ROS含量以及對胞內(nèi)MDA和GSH的含量測定，結(jié)果表明：相較于Control組，H/R組HT22細(xì)胞內(nèi)Lipid ROS及MDA的含量明顯升高(均P<0.01)、GSH的含量則明顯降低(P<0.01)；使用DEX后，與H/R組相比，胞內(nèi)Lipid ROS及MDA含量明顯降低(均P<0.01)，GSH 的含量則明顯增加(P<0.01)；而在使用DEX的基礎(chǔ)上使用Nrf2抑制劑后，胞內(nèi)Lipid ROS水平及MDA含量明顯升高(均P<0.05)，GSH的含量則明顯降低(P<0.01)。

2.4 DEX對H/R損傷HT22細(xì)胞中GPX4、SLC7A11和TFR1蛋白表達(dá)的影響采用蛋白質(zhì)印跡法檢測HT22細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白：GPX4、SLC7A11以及TFR1蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果如圖所示，HT22細(xì)胞經(jīng)H/R處理后，細(xì)胞中GPX4、SLC7A11蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.05)，TFR1蛋白表達(dá)則明顯升高(P<0.01)；在給予DEX后發(fā)現(xiàn)，GPX4、SLC7A11蛋白的表達(dá)明顯增加(均P<0.05)，而TFR1蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01)；在DEX的基礎(chǔ)上使用Nrf2抑制劑后，HT22細(xì)胞中GPX4、SLC7A11蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.01)，TFR1蛋白表達(dá)則明顯升高(P<0.01)。

Fig 3 Effect of DEX on Fe2+,lipid ROS,MDA and GSH on HT22 cells with H/R n=3)A:The fluorescence image of Fe2+ in different groups；B，C:The levels of Lipid ROS in HT22 cells with different treatment；D:MDA levels on HT22 cells with different treatment.E:GSH levels on HT22 cells with different treatment.##P<0.01 vs Control;△△P<0.01 vs H/R;*P<0.05,**P<0.01 vs H/R+DEX5+ML385

Fig 4 Effect of DEX on expression of ferroptosis related proteins on HT22 cells with H/R injury n=3)#P<0.05,##P<0.01 vs Control;△△P<0.01 vs H/R;**P<0.01 vs H/R+DEX5+ML385

3 討論

近年來，腦卒中在中老年群體中的發(fā)病率逐年增加，給患者及其家屬帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。DEX作為臨床常用的麻醉輔助劑，具有良好的鎮(zhèn)靜、抗焦慮等作用。有研究發(fā)現(xiàn)，DEX可通過AKT信號通路減輕大鼠心肌I/R損傷[10]，Yin等[11]研究發(fā)現(xiàn)，DEX和Netrin-1聯(lián)合使用可以通過調(diào)節(jié)ERK5/MEF2A信號通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕腦I/R損傷。目前關(guān)于DEX抗腦I/R損傷的研究愈發(fā)深入，但其可能的保護(hù)機(jī)制尚需進(jìn)一步探明。為了探究DEX對HT22細(xì)胞H/R損傷后的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測不同濃度的DEX對HT22細(xì)胞H/R后的生存情況。結(jié)果顯示：低、中、高濃度的DEX均能增加HT22細(xì)胞在H/R后的存活率，說明DEX能夠減輕HT22細(xì)胞H/R損傷。與單獨(dú)使用DEX相比較，在DEX基礎(chǔ)上使用Nrf2抑制劑ML385后，細(xì)胞存活率明顯降低，這表明Nrf2可能參與了DEX對HT22細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用。

鐵死亡涉及到胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的失衡和脂質(zhì)過氧化的累積，是誘導(dǎo)腦I/R損傷的機(jī)制之一。在神經(jīng)系統(tǒng)中，鐵穩(wěn)態(tài)可維持胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物和DNA的氧化和修飾[2]。然而，鐵離子在應(yīng)激條件下會(huì)在細(xì)胞內(nèi)過度累積，過多的Fe2+通過芬頓(Fenton)反應(yīng)引起膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致Lipid ROS過度累積，線粒體結(jié)構(gòu)皺縮，功能損傷，最終造成細(xì)胞死亡[12]。流行病學(xué)研究已經(jīng)確定了鐵蓄積會(huì)加重腦卒中患者的神經(jīng)損傷[13]。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1，TFR1)是胞內(nèi)鐵代謝的重要蛋白，腦I/R損傷時(shí)，TFR1的表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而增加其對鐵的攝取，最終導(dǎo)致胞內(nèi)的鐵離子過載[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)DEX可以明顯抑制HT22細(xì)胞H/R后TFR1的表達(dá)，同時(shí)，F(xiàn)erroOrange熒光探針的結(jié)果也表明使用DEX后可以明顯降低胞內(nèi)Fe2+的水平。上述結(jié)果表明，DEX可能通過抑制TFR1的表達(dá)，進(jìn)而降低由H/R引起的胞內(nèi)鐵離子的過量蓄積。

正常細(xì)胞中，膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物被胞內(nèi)的抗氧化體系所清除，其中以SLC7A11/GPX4為核心的抗脂質(zhì)過氧化體系可以將脂質(zhì)過氧化物的過氧鍵轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基，失去其過氧化物的活性[15]。神經(jīng)細(xì)胞H/R損傷后，伴隨著抗脂質(zhì)過氧化體系的破壞，SLC7A11、GPX4蛋白的表達(dá)降低，以及胞內(nèi)抗氧化物GSH含量的大幅減少。因此鐵蓄積和抗脂質(zhì)過氧化體系的損傷導(dǎo)致了大量Lipid ROS的產(chǎn)生以及生物膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的累積。而DEX具有優(yōu)秀的抗氧化能力，可以通過清除細(xì)胞內(nèi)過多的氧自由基減輕氧化損傷[16]。在HT22細(xì)胞H/R損傷中，使用DEX后明顯提高SLC7A11和GPX4的蛋白表達(dá)以及胞內(nèi)GSH的水平，DEX對于HT22細(xì)胞抗氧化體系的保護(hù)顯然增強(qiáng)了其對脂質(zhì)過氧化物的分解能力：Lipid ROS和MDA的水平相較于H/R損傷均明顯下降。

Nrf2是具有神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)責(zé)維持細(xì)胞氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡。研究表明，人參皂苷Rg1可以通過激活Nrf2減輕心肌細(xì)胞H/R損傷[17]。此外，在腦I/R損傷中的研究表明，激活Nrf2可以通過抑制神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激減輕神經(jīng)損傷[18]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，DEX可以明顯提高H/R損傷下HT22細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，為了進(jìn)一步探究Nrf2在DEX抗HT22細(xì)胞H/R損傷中的作用，我們使用ML385抑制Nrf2的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Nrf2被抑制后DEX對胞內(nèi)亞鐵離子的運(yùn)輸能力明顯降低，同時(shí)，胞內(nèi)的各種抵抗脂質(zhì)過氧化的能力及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物均明顯下降，這表明Nrf2的抑制降低了DEX對細(xì)胞H/R損傷引起的鐵死亡的抵抗能力。

鐵在氧氣運(yùn)輸，能量代謝和DNA合成中均發(fā)揮著重要的作用，然而過量的鐵對于細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)是有害的。同樣，鐵離子依賴的胞內(nèi)脂質(zhì)氧化穩(wěn)態(tài)的失衡是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞H/R損傷的重要原因。我們的研究表明DEX可以通過Nrf2抑制TFR1的表達(dá)，調(diào)控受損狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞鐵離子的運(yùn)輸，進(jìn)而維持胞內(nèi)鐵離子水平的穩(wěn)態(tài)。同時(shí)，鐵離子作為芬頓反應(yīng)的重要參與者，當(dāng)其在胞內(nèi)過度蓄積的情況得以緩解時(shí)，芬頓反應(yīng)也會(huì)受到抑制。此外，DEX經(jīng)由Nrf2增強(qiáng)了神經(jīng)細(xì)胞以SLC7A11/GPX4為核心的抗脂質(zhì)過氧化的能力，最終使得脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物L(fēng)ipid ROS以及MDA水平的降低。本研究以鐵死亡為切入點(diǎn)，探究了DEX在抗HT22細(xì)胞H/R損傷中的作用及機(jī)制，為臨床上合理使用DEX提供了新的理論依據(jù)。