柱前衍生化高效液相色譜法分析大鼠體內(nèi)D-絲氨酸和L-絲氨酸

型氨基酸主要位于哺乳動物的大腦皮層、海馬和外周組織中，被認為是重要的生物標(biāo)志物。-絲氨酸(-Ser)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中-甲基--天冬氨酸受體的重要內(nèi)源性配體，由-絲氨酸(-Ser)經(jīng)絲氨酸消旋酶轉(zhuǎn)化而來。-Ser是一種神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸傳遞、突觸可塑性等生理功能的調(diào)節(jié)，與-甲基--天冬氨酸受體功能障礙相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切關(guān)系，如阿爾茲海默癥、神經(jīng)分裂癥、抑郁癥等。內(nèi)源性-Ser水平的變化是當(dāng)前神經(jīng)生物學(xué)研究的熱點，因此研究并建立內(nèi)源性-Ser高效靈敏的檢測方法對疾病預(yù)防和治療、臨床醫(yī)學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)研究等具有重大意義。

大多數(shù)氨基酸不具有紫外或熒光信號，氨基酸分析儀通過柱后衍生可一次性檢測多種氨基酸，但不能區(qū)分不同構(gòu)型的氨基酸。生物體內(nèi)的-Ser含量豐富，-Ser含量較低，且含有大量肽、胺類物質(zhì)以及氨基酸，給-Ser的檢測帶來諸多干擾，目前常用的方法有毛細管電泳法、手性高效液相色譜法和酶分析方法，但這些方法均有缺點。本研究建立了以鄰苯二甲醛(OPA)和-乙酰--半胱氨酸(NAC)衍生化高效液相色譜分離紫外檢測的分析方法，具有操作簡單、價格低、靈敏度高、適用性好等優(yōu)勢，可作為神經(jīng)科學(xué)研究的有效技術(shù)和方法。此外，應(yīng)用該方法測定了對照組和缺硒組大鼠血漿和腦組織中-Ser和-Ser含量，探究-Ser和-Ser與硒缺乏的關(guān)系，并可能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治提供新的臨床診斷手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀、DAD紫外檢測器，美國安捷倫公司；BS210S電子天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；DELTA 320 pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；多樣品組織研磨儀，上海賀帆儀器有限公司；OPA、NAC，上海麥克林生化科技有限公司；-Ser、-Ser，Sigma-Aldrich公司；甲醇，色譜級，Merck公司；硼砂、醋酸銨，天津市康科德科技有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精密稱取-Ser、-Ser 各0.050 0 g，用超純水溶解并稀釋到50 mL，配制成1 mg/mL的儲備溶液。

1.2.2 衍生化試劑溶液的配制 分別精密稱取OPA 0.050 0 g、NAC 0.050 0 g，用5 mL甲醇溶解，加入20 mL 0.1 mol/L的硼砂緩沖液(pH 9.8)混合均勻，使用前配制。

從表6可見，綜合得分排在前4位的樣方依次是11、12、6和8號樣方。因為第一主成分代表多度，多度的方差貢獻率最大，因此11號、12號樣方以紫穗槐為優(yōu)勢種的植被多度最多，生態(tài)重建性最好。而10、5、2號樣方分別以沙棘和白檸條為優(yōu)勢種的植被多度最低，生態(tài)重建性最差。

1.3 方法

NAC-OPA衍生化法的一個缺點是衍生產(chǎn)物存在不穩(wěn)定性，以峰面積評價穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，衍生化產(chǎn)物在30 ℃條件下4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。低溫可以延長衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性，在4 ℃條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.4 液相色譜條件 色譜柱：Xbridge Amide column(250 mm × 4.6 mm，3.5 μm)；流動相：A：50 mmol/L醋酸銨，B：乙腈；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：340 nm；進樣量：10 μL；洗脫梯度見表1。

在上述衍生化條件和色譜條件下，-Ser 和-Ser得到很好地分離，如圖1所示，皮質(zhì)樣品中-Ser和-Ser的分離度大于1.5，說明該色譜條件適合樣品中-Ser與-Ser含量分析。

1.3.2 樣品收集 實驗至第532天，缺硒組和對照組各取5只大鼠，眼靜脈叢取血0.5 mL，置于肝素鈉抗凝的離心管中，1 520×g條件下離心10 min，分離上清得到血漿；大鼠斷頭后迅速在冰盤上分離大腦皮質(zhì)、海馬，將樣本于-80 ℃保存，用于后續(xù)-Ser和-Ser含量的測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性實驗

1.3.3 樣品處理與衍生化反應(yīng) (1)血漿：將360 μL甲醇加入到40 μL血漿中，渦旋5 min，8 100×g條件下離心10 min，取上清液350 μL在氮氣下吹干，加入70 μL新鮮配制的衍生化試劑，渦旋反應(yīng)5 min后于8 100×g條件下離心5 min，取上清液10 μL進樣測定。(2)腦組織：精密稱取0.050 0 g腦組織，加入1 mL甲醇，冰浴條件下組織勻漿，勻漿液在8 100×g條件下離心10 min，取上清液400 μL氮氣下吹干，加入100 μL超純水渦旋反應(yīng)5 min后于8 100×g條件下離心5 min，取上清液40 μL，加入40 μL新鮮配制的衍生化試劑，渦旋反應(yīng)5 min后于8 100×g條件下離心5 min，取上清液10 μL進樣測定。

基于資源整合的農(nóng)工商雙向流通電商模式研究..................................................................................................................................尹 超 張明玉（69）

冰浴條件下制備腦組織提取液，分別加入不同濃度水平的-Ser和-Ser的標(biāo)準(zhǔn)品，衍生化并離心分離后進樣測定。每個濃度3個樣本，計算方法回收率，結(jié)果見表2。方法回收率為97.29%～101.88%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.87%。

2.2 線性關(guān)系和定量下限

分別用儲備液配制-Ser和-Ser混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，即-Ser為 4、6、12、18、22、28 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；-Ser為16、24、48、64、80、112 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取各標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL與等體積衍生化試劑衍生化后測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別得到-Ser和-Ser的回歸方程為：Y=14.946X-18.496(=0.998 2)、Y=12.339X-44.555(=0.999 4)。結(jié)果表明，-Ser在2～14 μg/mL的范圍，-Ser在8～56 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。以10倍信噪比計算定量限，-Ser和-Ser的定量限為0.04 μg/mL。

近年來還有研究提出，將右美托咪定等藥物作為神經(jīng)阻滯的輔助用藥可顯著增長術(shù)后鎮(zhèn)痛時效，并降低術(shù)后阿片類藥物的用量[10]，但是需要權(quán)衡鎮(zhèn)痛時效延長與相關(guān)血流動力學(xué)副作用，在臨床上應(yīng)審慎對待。

2.3 穩(wěn)定性

1.3.1 動物實驗 3 w齡斷乳雄性Sprague-Dawley大鼠10只，體重(48.3±5.9)g，采購于三峽大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(鄂)2017-0012。將大鼠分為缺硒組(SD組，=5)、對照組(SS組，=5)，缺硒組飼喂低硒飼糧(含0.02 mg Se/kg飼糧)，正常組飼喂正常飼糧(含0.18 mg Se/kg飼糧)。低硒飼糧按照AIN-93標(biāo)準(zhǔn)配制，正常飼糧是在低硒飼糧的基礎(chǔ)上添加亞硒酸鈉制成。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(20±2)℃，相對濕度為55%～65%，自由飲食。

開學(xué)第二天清晨，高三全體學(xué)生在操場上集合宣誓。黎明前的空中，還殘留著一些凜冽的夜色，但天空慢慢就被紅光占領(lǐng)，太陽就要升起了。

2.4 回收率

(3)政府激勵政策有效，相應(yīng)的政策法規(guī)出臺和宣傳所花費的成本為C1；政府激勵政策有效，購房者響應(yīng)政府號召，積極購買和使用被動房，政府對這些購房者進行獎勵所花費的成本C2，購房者購買被動房的額外增量成本C3。

2.5 精密度

冰浴條件下制備腦組織提取液，分別加入240 μg/mL的-Ser和60 μg/mL的-Ser的標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，加入50 μL衍生化試劑，渦旋反應(yīng)5 min后8100×g離心5 min，取上清液置于液相小瓶中，進樣檢測峰面積。重復(fù)衍生化反應(yīng)及后續(xù)步驟，測定6次，計算得到峰面積的RSD值為1.63%和1.83%，表明精密度良好。

2.6 方法學(xué)應(yīng)用

用上述建立的方法檢測對照組和缺硒組大鼠血漿、大腦皮質(zhì)和海馬組織中-Ser和-Ser含量。結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，缺硒組大腦皮質(zhì)和海馬中-Ser和-Ser含量無明顯差異，血漿中-Ser含量顯著升高(<0.05)，-Ser含量無顯著變化。血漿中-Ser含量有可能與硒缺乏有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究建立了NAC-OPA柱前衍生化法反相液相色譜紫外檢測測定大鼠血漿和腦組織中-Ser和-Ser的方法，該方法快速、靈敏、專屬性好、檢測時間短、應(yīng)用范圍廣。經(jīng)方法學(xué)驗證該方法的精密度、穩(wěn)定性、線性關(guān)系、加樣回收率均良好，適用于動物血漿和腦組織中-Ser和-Ser的同時檢測，為硒缺乏與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進一步研究提供方法學(xué)參考。