基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討益氣和血方治療肝硬化的作用機(jī)制

張瑩雪，孫鳳霞，李曉玲，徐春軍，郭雨菲，陳紫夢

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院感染科，北京 100010）

肝硬化是由各種因素導(dǎo)致慢性肝損害的一類晚期肝纖維化疾?。?］，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化、增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，與多個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)［2，3］。全世界每年約有200 萬人死于肝病，100 萬人死于肝硬化并發(fā)癥，肝硬化目前是全球第11 個(gè)最常見的死亡原因，給全球帶來嚴(yán)重衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［4］。肝硬化的治療目前主要是病因治療，抗炎抗肝纖維化，積極防治并發(fā)癥，如果肝臟嚴(yán)重受損，治療的唯一可能選擇是肝移植［5，6］。中醫(yī)藥在治療肝硬化中發(fā)揮了獨(dú)特優(yōu)勢，尤其在抗肝纖維化方面得到普遍關(guān)注與認(rèn)可，成為治療肝硬化的重要手段之一［7］。

北京中醫(yī)醫(yī)院關(guān)幼波教授認(rèn)為，疾病的發(fā)生及其發(fā)展、轉(zhuǎn)歸離不開氣血這個(gè)主題，肝硬化以氣虛血滯為本，慢性肝病久病體虛，首先要注重氣血，活血化瘀，化瘀要軟堅(jiān)。因此，肝硬化治療應(yīng)以益氣和血、養(yǎng)血柔肝、軟堅(jiān)散結(jié)為基礎(chǔ)［8，9］。北京中醫(yī)醫(yī)院肝病科長期秉承關(guān)幼波教授“氣血辨證”的學(xué)術(shù)思想，采用益氣和血軟堅(jiān)散結(jié)法，擬方益氣和血基礎(chǔ)方，應(yīng)用益氣和血方加減治療肝硬化患者，取得了顯著的療效，并積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動物實(shí)驗(yàn)研究，探討益氣和血方可能的抗肝硬化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 益氣和血方有效成分及靶點(diǎn)的獲取

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫，分別檢索黃芪、當(dāng)歸、白芍，設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18。利用BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫，檢索鱉甲、雞內(nèi)金，設(shè)置score cutoff ≥20，校正后P＜0.05，篩選得到有效化合物及其作用靶點(diǎn)。然后應(yīng)用“PERL”軟件對所獲得的藥物成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行合并，并應(yīng)用Uniprot 校正靶點(diǎn)蛋白為規(guī)范的基因名稱。

1.2 肝硬化的相關(guān)基因的獲取

以“cirrhosis”為關(guān)鍵詞，分別從GeneCard、PharmGkb、OMIM、DrugBank、TTD 數(shù)據(jù)庫對肝硬化相關(guān)基因進(jìn)行搜索。應(yīng)用R×64 4.0.2 軟件中的“venn”安裝包以及腳本將結(jié)果取并集，繪制韋恩圖。

1.3 獲取潛在靶點(diǎn)

利用R 軟件將藥物活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，并繪制韋恩圖，獲得益氣和血方活性成分的潛在治療肝硬化作用靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建“藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

首先將1.1 與1.2 最終獲得的數(shù)據(jù)通過“PERL”軟件以及腳本進(jìn)行整理，然后應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“藥物成分-疾病靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)圖。節(jié)點(diǎn)的degree 值越大，則提示其參與生物功能越多。

1.5 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將交集基因?qū)氲絊TRING 數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置物種條件為人，置信度＞0.9，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape，采用cytoHubba 插件中的MCC 算法得到hub 基因。

1.6 KEGG 通路富集分析

利用R 軟件對交集基因進(jìn)行id 轉(zhuǎn)換，并進(jìn)行KEGG 通路富集分析。將P值過濾條件及校正后的過濾條件均設(shè)為0.05，從KEGG 通路富集結(jié)果中選定后續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的通路，并繪制通路圖。

1.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級SD 雄性大鼠35 只，6 周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0011。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京市中醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物管理委員會批準(zhǔn)（倫理號2021030102）。

1.7.2主要試劑與儀器 四氯化碳（CCl4），for HPLC，≥99.0%（上海麥克林生化科技有限公司）；HE 染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；Masson染色液由實(shí)驗(yàn)室配制；RNA 提取試劑盒（賽默飛，PureLinkTMRNA Mini Kit）；一步法熒光定量RTPCR 試劑盒（096A）（TaKaRa）；熒光定量PCR 儀（Roche 德國，型號：LightCycler 480 Ⅱ）。

1.7.3 中藥制備 益氣和血方由生黃芪30 g、當(dāng)歸12 g、白芍15 g、醋鱉甲15 g、醋雞內(nèi)金10 g 組成，在臨床使用中，一日一副。購于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院。大鼠灌胃劑量參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［10］，按照成人與大鼠的給藥劑量換算系數(shù)折算成大鼠用量，劑量為0.861 g/100 g。

1.7.4 大鼠造模及給藥 造模參考相關(guān)文獻(xiàn)［11，12］并進(jìn)行改良，35 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)選取3 只大鼠作為空白組，其余32 只造模組大鼠以50% CCl4溶液（溶劑為橄欖油）2 mL/kg 的劑量進(jìn)行腹腔注射2 周，3 mL/kg 注射4 周，每周均2 次，所有大鼠自由飲水和攝食。造模共6 周后，隨機(jī)選取造模組3 只，通過病理檢測評估造模成功后，將其隨機(jī)分為模型組、益氣和血方組，每組各10 只。中藥組給予益氣和血方中藥灌胃，其余大鼠予等量生理鹽水灌胃，所有大鼠每日灌胃1 次，給藥容量：1 mL/100 g，連續(xù)給藥4 周。

1.7.5 病理標(biāo)本的采集 予戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠固定，剖開腹腔，切取大鼠肝臟，取同一位置的肝臟組織，置于4%多聚甲醛溶液，再取多塊肝臟組織于液氮中迅速冷凍，將所有樣品保存于-80 ℃冰箱，以便于后期RT-qPCR 檢測。

1.7.6 指標(biāo)檢測 （1）每組各取3 只，進(jìn)行HE 染色與Masson 染色，觀察肝組織病理學(xué)變化；（2）每組各取3 只，RT-qPCR 法 測 定 肝 組 織JAK2、STAT3mRNA 表達(dá)水平。按照試劑盒說明書提取各組大鼠肝組織中總RNA 并合成cDNA，進(jìn)行RT-qPCR分析。 引物序列：JAK2上游引物5' - ATGCTTCCTGTATTCACCTGCCTTG-3'，下 游 引物5' - GCTCCTGCCCTTTCATTCCTCTG - 3'，STAT3上游引物5'-CGGTTCAGTGAGAGCAGCAAGG-3'，下 游 引 物5'-AGTGAGACAAGAGGAGCAGGTGAG-3'。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.2 軟件和SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，若方差齊則多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣和血方有效成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測

共獲得43 個(gè)有效成分，其中白芍13 個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，黃芪20 個(gè)，鱉甲1 個(gè)，雞內(nèi)金7 個(gè)；同時(shí)共獲得1 081 個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)。將有效成分及靶點(diǎn)預(yù)測文件采用“PERL”軟件及其腳本進(jìn)行合并，然后應(yīng)用Uniprot 數(shù)據(jù)庫及“PERL”軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化注釋、整理，最終獲得648 個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 肝硬化相關(guān)基因

通 過GeneCard 數(shù) 據(jù) 庫、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫、TTD 數(shù)據(jù)庫、DrugBank 數(shù)據(jù)庫分別獲得肝硬化相關(guān)靶基因3 158 個(gè)、9 個(gè)、1 個(gè)、23 個(gè)、86個(gè)，經(jīng)整理后共獲得3 220 個(gè)肝硬化相關(guān)靶基因（圖1）。

圖1 肝硬化相關(guān)靶基因圖Fig 1 Map of target genes related to liver cirrhosis

2.3 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)基因交集

經(jīng)過整理、分析共獲得藥物潛在活性成分靶點(diǎn)648 個(gè)，疾病靶點(diǎn)3 220 個(gè)，兩者得出的交集基因?yàn)?06 個(gè)（圖2）。

圖2 益氣和血方和肝硬化相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖Fig 2 Venn diagram of Yiqi Hexue Formula common target related to liver cirrhosis

2.4 “活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析

活性成分-核心靶點(diǎn)圖中共有336 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中來源于化合物的有30 個(gè)，來源于基因的有306 個(gè)（圖3）。將degree 排前10 的有效成分列出（表1）。

圖3 “活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Network diagram of"active ingredients-core targets"

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將交集基因?qū)氲絊TRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape，根據(jù)MCC 值對節(jié)點(diǎn)進(jìn)行有序排列，前10 個(gè)靶點(diǎn)依次為JUN、RELA、IL6、IL1B、CXCL8、IL1A、CCL2、IL4、TP53、IL10（圖4、5），推測這些靶點(diǎn)是益氣和血方治療肝硬化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖4 益氣和血方治療肝硬化的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 4 PPI network of Yiqi Hexue Formula in the treatment of liver cirrhosis

2.6 KEGG 通路富集分析

經(jīng)過KEGG 通路富集分析共得到180 條通路富集 結(jié) 果，涉 及PI3K/Akt、MAPK、IL-17、JAK/STAT 等信號通路等。見圖6。提示益氣和血方可能通過以上通路發(fā)揮對肝硬化的治療作用。

圖5 益氣和血方治療肝硬化的hub 基因（Top10）Fig 5 Hub gene（Top10）of Yiqi Hexue Formula in the treatment of liver cirrhosis

圖6 JAK/STAT 信號通路（紅色邊框代表共同基因）Fig 6 JAK/STAT signaling pathway（red borders represent common genes）

2.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.7.1 模型評估 造模結(jié)束后，HE 染色及Masson染色結(jié)果顯示：空白組無明顯炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞索呈放射態(tài)整齊排列，小葉結(jié)構(gòu)完整。模型組可見肝細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤，脂肪變性嚴(yán)重，肝細(xì)胞索排列混亂，彌漫性纖維增生，假小葉形成。見圖7、8。

圖7 大鼠肝臟組織HE 染色（×200）Fig 7 HE staining of rat liver tissue（×200）

圖8 大鼠肝臟組織Masson 染色（×200）Fig 8 Masson staining of rat liver tissue（×200）

2.7.2 益氣和血方對肝硬化大鼠肝組織病理改善 治療結(jié)束后，HE 染色及Masson 染色結(jié)果顯示，空白組肝細(xì)胞索排列整齊，無明顯炎性細(xì)胞浸潤。模型組可見肝小葉結(jié)構(gòu)損害，部分尚可見肝細(xì)胞脂肪性變，炎細(xì)胞浸潤。與模型組相比，益氣和血方組肝纖維化程度明顯減輕，纖維著色明顯變淡，炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減少，肝細(xì)胞散在脂肪空泡。見圖9、10。

圖9 大鼠肝臟組織HE 染色（×200）Fig 9 HE staining of rat liver tissue（×200）

圖10 大鼠肝臟組織Masson 染色（×200）Fig 10 Masson staining of rat liver tissue（×200）

2.7.3 各組大鼠肝組織JAK2、STAT3mRNA 表達(dá)比較 與空白組比較，模型組JAK2、STAT3mRNA 表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，益氣和血方組JAK2、STAT3mRNA 表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖11。

圖11 各組大鼠肝組織JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)比較Fig 11 Comparison of JAK2 and STAT3 mRNA expression in liver tissues of rats in each group

3 討論

本課題組前期在益氣和血方治療肝硬化方面積累了一定的研究基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)，益氣和血方聯(lián)合恩替卡韋片治療乙肝肝硬化有助于改善患者中醫(yī)證候積分，減輕肝臟炎癥，改善肝臟合成儲備功能，改善脾臟大小、門脈寬度，降低Child 評分，提高再代償率等，臨床療效確切［13-15］，但其具體機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可初步預(yù)測中藥的作用機(jī)制，在中藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［16］。本課題擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究益氣和血方的多種活性成分，探討益氣和血方治療肝硬化的作用機(jī)制，進(jìn)而采用動物實(shí)驗(yàn)對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測出的信號通路加以驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)益氣和血方中關(guān)鍵化合物主要為膽汁三烯、槲皮素、煙酸、山奈酚、維生素C 等活性成分。其中膽汁三烯是雞內(nèi)金的主要化學(xué)成分之一［17］，通過活性成分-核心靶點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)膽汁三烯作用靶點(diǎn)包括PDGFB、SCNN1A、KCNJ8 等，具體機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。槲皮素是一種多酚類黃酮，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠抗CCl4 誘導(dǎo)的肝纖維化［18，19］。通過網(wǎng)絡(luò)藥理研究發(fā)現(xiàn)槲皮素的作用靶點(diǎn)包括PTGS1、PTGS2、JUN、STAT1、AKT1、IL6R 等，相關(guān)作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)槲皮素等黃酮類化合物能干預(yù)與肝纖維化發(fā)生密切相關(guān)的信號通路［20］。網(wǎng)絡(luò)藥理研究表明煙酸與PPARA、IL13、IL6、MAPK9、TP53 等靶點(diǎn)密切相關(guān)，姜黃素與煙酸聯(lián)合用藥可明顯降低肝臟TNF-α、IL-6 的表達(dá)［21］。煙酸可以通過 調(diào) 節(jié)PPARα、DGAT2、SREBP1cmRNA 的 表達(dá)，明顯改善肝細(xì)胞脂肪變性及纖維化［22］。山奈酚的 作用 靶 點(diǎn) 包括STAT1、JUN、MMP1、MAPK8等，體外實(shí)驗(yàn)表明山奈酚可顯著抑制HSC-T6 細(xì)胞的增殖，且作用較強(qiáng)［23］；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明山奈酚有抗纖維化療效，其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)IL-13和COL1的mRNA 表達(dá)，抑制膠原合成，以及上調(diào)MMP-2的mRNA 表達(dá)促進(jìn)膠原分解［24］。研究表明抗氧化劑維生素C 可能通過抑制瘦素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而抑制HSC 增殖［25］，臨床研究發(fā)現(xiàn)維生素C聯(lián)合微生態(tài)制劑，有助于改善肝硬化患者的肝功能、肝纖維化指標(biāo)等［26］。

關(guān)于KEGG 通路富集，主要涉及PI3K/Akt、MAPK、IL-17、JAK/STAT 等 信 號 通 路。PI3K/Akt 信號通路參與肝纖維化的形成，主要與調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的降解、干預(yù)HSC 的活化等相關(guān)［27］。MAPK 信 號 通 路 與 肝 纖 維 化 密 切 相 關(guān)［28］，其 中ERK/MAPK 信號通路參與了HSC 的增殖、分化和遷移［29］，JNK 和p38 可以調(diào)節(jié)纖維形成過程中細(xì)胞的分化［30］。IL-17 通過多種機(jī)制誘導(dǎo)肝纖維化，如促進(jìn)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-1β 和TNF-α，并能增加TGF-β1 的表達(dá)，還可以通過激活STAT3 信號通路直 接誘導(dǎo)HSC 產(chǎn)生I 型膠原［31］。JAK/STAT 信號通路廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及炎癥等過程，對肝纖維化形成過程中的瘦素、IL-4、IFNα 發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［32］。JAK2 和STAT3，在該通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有著重要的地位［33，34］，相關(guān)研究表明，一些細(xì)胞因子與HSC 細(xì)胞膜受體結(jié)合后，激活JAK2/STAT3 通路，暴露出核定位信號，STAT3 進(jìn)入HSC 胞核，與DNA 上的特定調(diào)節(jié)序列結(jié)合并啟動其轉(zhuǎn)錄，使HSC 增殖，促進(jìn)肝纖維化形成［35，36］。但查閱大量文獻(xiàn)，關(guān)于肝硬化/肝纖維化與經(jīng)典的JAK2/STAT3 信號通路的研究相對較少，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，本研究選擇該通路進(jìn)行驗(yàn)證，探討益氣和血方治療肝硬化的部分作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示：模型組肝組織JAK2、STAT3mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)，說明JAK2/STAT3 信號通路參與肝硬化的形成，益氣和血方治療組JAK2、STAT3mRNA的表達(dá)較模型組明顯下調(diào)，表明益氣和血方抑制JAK2、STAT3的表達(dá)。

綜上，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動物實(shí)驗(yàn)研究益氣和血方治療肝硬化的作用機(jī)制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)益氣和血方能夠通過多成分、多靶點(diǎn)、多條通路達(dá)到治療肝硬化的目的，為進(jìn)一步從益氣和血方中提取有效活性成分治療肝硬化提供了理論依據(jù)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明JAK2/STAT3 信號通路參與肝硬化的形成，益氣和血方對治療肝硬化有明確療效，能夠改善其病理表現(xiàn)，其作用機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3 信號通路傳遞有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張瑩雪：構(gòu)思研究，完成網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、執(zhí)行和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。孫鳳霞：寫作審查和監(jiān)督做出了貢獻(xiàn)。李曉玲、徐春軍：執(zhí)行數(shù)據(jù)分析。郭雨菲、陳紫夢：參與實(shí)驗(yàn)執(zhí)行。所有作者設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、撰寫并修改論文。

所有作者聲明本論文的發(fā)表不存在利益沖突。