生髓健骨膠囊對酒精性骨質(zhì)疏松大鼠骨轉(zhuǎn)換影響的研究

任樹軍，高 偉，于長江，梁彥林，李遠(yuǎn)峰，譚福柱，徐煒明，徐西林

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，黑龍江 哈爾濱 150040；3. 寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院，寧夏銀川 750021；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001）

酒精性骨質(zhì)疏松癥（alcohol-induced osteoporosis，AOP）是指由于長期大量攝取酒精破壞骨轉(zhuǎn)換平衡，影響骨組織塑造與重建，破壞骨的微觀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)退變及脆性增加，進(jìn)而增加骨折風(fēng)險(xiǎn)的一種繼發(fā)性周身骨轉(zhuǎn)換紊亂性疾?。?，2］。研究表明長期過量攝入酒精可以直接作用于成骨細(xì)胞，或者可通過影響肝腎功能、維生素及血清鈣等骨代謝間接影響骨密度，提高骨折風(fēng)險(xiǎn)［3］。骨組織通過破骨細(xì)胞的自我更新進(jìn)行不斷塑造和重建的過程被稱為骨轉(zhuǎn)換［4］。25 羥基維生素D3［25（OH）D3］作為維生素D3在體內(nèi)的主要貯存方式，可通過檢測血清中25（OH）D3水平含量，評估體內(nèi)維生素營養(yǎng)情況［5］；此外其活性代謝物1，25 二羥基維生素D3［1，25（OH）2D3］在體內(nèi)可誘導(dǎo)合成鈣蛋白，從而促進(jìn)鈣、磷離子在腸道的吸收與被腎小管細(xì)胞的重吸收，有利于新骨的鈣化與生成［6］。1 型原膠原N-端前肽（P1NP）作為骨轉(zhuǎn)換過程中首選反映成骨細(xì)胞活性的骨形成標(biāo)志物，1 型膠原交聯(lián)羧基端肽（β-CTX）則為首選可代表破骨細(xì)胞活性的骨吸收標(biāo)志物，能夠具有特異性、敏感性地反映全身骨形成［7］及骨吸收［8］的狀態(tài)。

由《醫(yī)學(xué)正傳》中化裁而來的生髓健骨膠囊，具有補(bǔ)腎健脾壯骨、燥濕化瘀活絡(luò)的功效。本研究通過建立AOP 大鼠模型，旨在觀察生髓健骨膠囊對AOP 大鼠血清中維生素D3指標(biāo)［25（OH）D3、1，25（OH）2D3］與骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物（β-CTX、P1NP）和骨密度（bone mineral density，BMD）的影響和相關(guān)性，以期探討本方治療AOP 可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)試驗(yàn)中心提供的清潔級雄性SD 大鼠120 只，年齡平均6 個(gè)月，體重（220±20）g，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（黑）20160103。黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)了此次調(diào)查中的動物研究，并按照《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》（中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部）研究進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

生髓健骨膠囊（黑龍江中醫(yī)大附一院制劑室，規(guī)格：0.35 g/粒，批號：黑衛(wèi)藥制字Z20110036；執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：黑Z-ZJ-0560-2010）；碳酸鈣片（規(guī)格：600 mg/片，惠氏制藥有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H10950029）；阿法D3（以色列Teva Pharmaceutical Industries Limited 生產(chǎn)，昆明Baker Norton Pharmaceutical 有限公司分裝，批號：J20130162）；白酒［規(guī)格：500 mL/瓶，北京紅星二鍋頭56°清香型白酒，生產(chǎn)日期：2020 年7 月27 日，北京紅星有限股份公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB/T10781.2（優(yōu)級）］；0.9% NaCl 注射液［規(guī)格：500 mL：4.5 g（軟袋），浙江天瑞藥業(yè)有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H33022240］。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)器材和試劑

臺式高速低溫離心機(jī)（型號：CenLee20R 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司提供）；雙能X 線骨密度測量儀［型號：PLODIGY 美國通用（Lunar）公司］；酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA 法）：［大鼠25（OH）D3ELISA 試 劑 盒，貨 號：ml028301；大 鼠1，25（OH）2D3ELISA 試劑盒，貨號：ml028285，上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；大鼠β-CTX 酶聯(lián)免疫試劑盒，規(guī)格：96 T/48 T，貨號：CSB-E12776r；大鼠P1NP 酶聯(lián)免疫試劑盒，規(guī)格：96 T/48 T，貨號：CSB-E12774r，武漢華美生物工程有限公司提供］。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動物分組 將黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的實(shí)驗(yàn)大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，進(jìn)行隨機(jī)編號，并根據(jù)體重按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（酒精性骨質(zhì)疏松癥模型組）、空白對照組、西藥對照組（碳酸鈣片與阿法D3對照組）、中藥實(shí)驗(yàn)組（生髓健骨膠囊實(shí)驗(yàn)組）4 組，各30 只，分籠喂養(yǎng)。

1.4.2實(shí)驗(yàn)動物模型 參考文獻(xiàn)［9，10］方法采用慢性白酒灌胃法造模：將健康雄性SD 大鼠按照體質(zhì)量10 mL·kg-1·d-1（酒精量4.4 g/10 mL）的劑量，用56°紅星二鍋頭白酒灌胃，每日一次，分別于干預(yù)8、12、16 周后取材，依據(jù)每周監(jiān)測的大鼠體重，調(diào)整酒精用量。最后一次灌胃成功后禁食禁水12 h，采集標(biāo)本，并進(jìn)行檢測。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)動物干預(yù)方法 模型組：每日上午用紅星二鍋頭56°白酒灌胃，劑量為10 mL·kg-1·d-1（酒精量4.4 g/10 mL），下午用相同劑量0.9%NaCl 注射液灌胃，每日1 次。

空白對照組：等量0.9%NaCl 注射液每日上午、下午各灌胃1 次。

西藥對照組：每日上午用與模型組相同劑量的白酒灌胃；下午用碳酸鈣、阿法D3混懸液與0.9%NaCl 注射液配制混懸液灌胃（碳酸鈣的用量標(biāo)準(zhǔn)為85 mg/10 mL/kg，阿法D3的用量依據(jù)大鼠體質(zhì)量為0.05 μg/10 mL/kg），每日1 次。

中藥實(shí)驗(yàn)組：每日上午用與模型組相同劑量的白酒灌胃；下午用生髓健骨膠囊與0.9% NaCl 注射液配制混懸液灌胃（用量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)大鼠體質(zhì)量4.7 g/10 mL/kg），每日1 次。

以上各組大鼠灌胃容量均為每日10 mL/kg，實(shí)驗(yàn)期間均給予標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)飼料同等喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，共持續(xù)灌胃及給藥16 周。每周依據(jù)監(jiān)測到的大鼠體重調(diào)整用藥劑量［11］。

1.5 取材及檢測方法

分別于實(shí)驗(yàn)干預(yù)后的8、12、16 周末，從各組隨機(jī)抽取空腹12 h 以上的實(shí)驗(yàn)大鼠采用頸椎脫臼法處死，剖開腹腔，采腹主動脈血，經(jīng)高速低溫離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行分離后保存?zhèn)溆?，?yán)格按照ELISA 法試劑盒內(nèi)說明書操作，對大鼠血清中維生素D3指標(biāo)［25（OH）D3、1，25（OH）2D3］與 骨 轉(zhuǎn) 換 標(biāo) 志 物（β-CTX、P1NP）進(jìn)行測定；將大鼠頸椎脫臼處死后，取出大鼠左側(cè)股骨，將其附著組織剔除，用生理鹽水沖洗，無菌生理鹽水包裹后，置于雙能X 線骨密度測量儀下，進(jìn)行大鼠股骨骨密度測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 生髓健骨膠囊對AOP 大鼠左側(cè)股骨骨密度的影響

根據(jù)造模干預(yù)8、12、16 周末骨密度檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠股骨骨密度明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明采用白酒灌胃法導(dǎo)致骨質(zhì)疏松造模成功。與模型組相比，中藥實(shí)驗(yàn)組可以明顯提升酒精性骨質(zhì)疏松大鼠股骨的骨密度（P＜0.01），且明顯優(yōu)于西藥對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 生髓健骨膠囊對AOP 大鼠左側(cè)股骨骨密度的影響（n=10，±s）Tab 1 Effect of Shengsui Jiangu Capsule on bone density of left femur in AOP rats（n=10，±s）

表1 生髓健骨膠囊對AOP 大鼠左側(cè)股骨骨密度的影響（n=10，±s）Tab 1 Effect of Shengsui Jiangu Capsule on bone density of left femur in AOP rats（n=10，±s）

注：與空白對照組相比，▲P＜0.01；與模型組相比，●P＜0.01；與西藥對照組相比，★P＜0.05。

16 周末0.274±0.015 0.206±0.019▲0.246±0.017●0.260±0.015●★30.92＜0.01組別空白對照組模型組西藥對照組中藥實(shí)驗(yàn)組FP 8 周末0.275±0.017 0.223±0.018▲0.236±0.015●0.248±0.023●★14.57＜0.01 12 周末0.273±0.019 0.216±0.014▲0.239±0.019●0.254±0.016●★19.97＜0.01

2.2 實(shí)驗(yàn)中大鼠血清25（OH）D3、1，25（OH）2D3、β-CTX 及P1NP 水平變化情況

根據(jù)造模干預(yù)8、12、16 周末生化檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組血清25（OH）D3、1，25（OH）2D3及P1NP 水平明顯降低（P＜0.01），血清中β-CTX 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示酒精的大量攝入能夠?qū)е聦?shí)驗(yàn)大鼠血液中活性維生素D3水平及骨形成降低，從而刺激骨吸收指標(biāo)的升高。與模型組相比，西藥對照組和中藥實(shí)驗(yàn)組血清25（OH）D3、1，25（OH）2D3及P1NP 水平明顯升高，血清β-CTX 水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示兩種方式的藥物干預(yù)均有益于提高實(shí)驗(yàn)大鼠的骨轉(zhuǎn)換的能力。與西藥對照組對比，中藥實(shí)驗(yàn)組對大鼠血清維生素D3指標(biāo)及骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的改善程度優(yōu)于西藥對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 造模干預(yù)8、12、16 周末大鼠血清25（OH）D3、1，25（OH）2D3、β-CTX、P1NP 水平比較（n=10，±s）Tab 2 comparison of serum levels of 25（OH）D3，1，25（OH）2D3，β-CTX，P1NP in rats after 8，12 16 weeks of modeling intervention（n=10，±s）

表2 造模干預(yù)8、12、16 周末大鼠血清25（OH）D3、1，25（OH）2D3、β-CTX、P1NP 水平比較（n=10，±s）Tab 2 comparison of serum levels of 25（OH）D3，1，25（OH）2D3，β-CTX，P1NP in rats after 8，12 16 weeks of modeling intervention（n=10，±s）

注：同時(shí)間段與空白對照組相比，▲P＜0.01；與模型組相比，●P＜0.01；與西藥對照組相比，★P＜0.05。

指標(biāo)25(OH)D3（ng/L）F P 1,25(OH)2D3（ng/mL）＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01 P1NP（ng/mL）β-CTX（μg/L）時(shí)間8 周末12 周末16 周末8 周末12 周末16 周末8 周末12 周末16 周末8 周末12 周末16 周末空白對照組502.89±24.48 496.37±24.00 498.34±25.32 596.62±34.59 600.30±28.59 603.94±43.36 8.12±0.99 8.09±1.38 7.94±1.07 20.69±3.66 21.65±3.48 21.88±1.68模型組429.37±21.11▲423.74±20.68▲414.13±20.33▲506.95±32.38▲501.54±35.67▲495.82±34.18▲4.83±1.13▲4.26±1.58▲3.38±1.06▲30.25±2.56▲32.90±2.08▲32.57±2.42▲西藥對照組446.34±21.24●448.56±21.42●450.77±21.22●545.64±35.64●552.90±38.78●556.81±40.10●6.33±1.17●6.22±1.05●6.43±1.08●25.28±1.51●25.47±2.22●23.84±2.63●中藥實(shí)驗(yàn)組473.60±19.10●★478.66±21.95●★486.12±21.84●★586.40±32.33●★586.64±33.42●★589.68±37.88●★7.65±0.90●★8.05±1.26●★7.99±1.34●★22.50±2.51●★21.20±3.66●★20.79±2.87●★22.29 21.28 29.06 14.78 16.44 16.40 19.73 18.74 35.68 24.32 33.77 48.03

2.3 酒精性骨質(zhì)疏松大鼠血清中維生素D3 指標(biāo)［25（OH）D3、1，25（OH）2D3］與骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)（P1NP及β-CTX）和骨密度的相關(guān)性

經(jīng)Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)分析，酒精性骨質(zhì)疏松大鼠血清中維生素D3指標(biāo)［25（OH）D3、1，25（OH）2D3］與血清骨形成標(biāo)志物P1NP 及骨密度呈正相關(guān)性關(guān)系，與血清骨吸收標(biāo)志物β-CTX 水平呈負(fù)相關(guān)性關(guān)系。見表3。

表3 酒精性骨質(zhì)疏松大鼠血清中維生素D3指標(biāo)［25（OH）D3、1，25（OH）2D3］與骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)（P1NP 及β-CTX）和骨密度的Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果Tab 3 Pearson correlation analysis of serum vitamin D3［25（OH）D3、1，25（OH）2D3］with bone turnover index（P1NP and β-CTX）and bone mineral density in rats with alcoholic osteoporosis

3 討論

長期高劑量攝入酒精可以通過成骨細(xì)胞壞死性凋亡誘導(dǎo)骨質(zhì)減少，從而損害骨骼重塑，減少骨量，并增加骨質(zhì)疏松癥和骨折的風(fēng)險(xiǎn)［12］。目前攝入足量的鈣與維生素D 是防治骨質(zhì)疏松的核心方案［13］，長期高劑量飲酒可以抑制骨骼成熟的大鼠骨形成水平，破壞骨轉(zhuǎn)換平衡，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)行性的骨質(zhì)流失，骨密度下降［14］。本實(shí)驗(yàn)通過建立AOP 大鼠模型，觀察生髓健骨膠囊對AOP 的防治作用及相關(guān)機(jī)制，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生髓健骨膠囊能有效改善AOP 大鼠骨密度，調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換水平，具有顯著的防治AOP 的作用。

骨轉(zhuǎn)換作為維持體內(nèi)骨骼損傷修復(fù)及礦物質(zhì)穩(wěn)定與平衡的重要過程，受多方面因素影響。維生素D 作為一種脂溶性活性甾體分子的維生素，其主要生理功能就是維持血清鈣、磷代謝及骨礦物質(zhì)沉積的穩(wěn)定，通過監(jiān)測機(jī)體內(nèi)維生素D3血清指標(biāo)，可以評估維生素營養(yǎng)狀況，從而達(dá)到提早發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)變化，并及時(shí)防治骨質(zhì)疏松的目的［15］。25（OH）D3作為機(jī)體內(nèi)維生素D3的主要貯存方式，半衰期遠(yuǎn)比1，25（OH）2D3要長，可有效維持骨轉(zhuǎn)換與血清鈣水平的動態(tài)穩(wěn)定；其代謝的活性成分1，25（OH）2D3可增強(qiáng)小腸黏膜細(xì)胞合成鈣蛋白的能力，提升腎臟對血清鈣、磷的重吸收能力，促進(jìn)骨礦鹽的沉積，提升骨密度，提高骨形成標(biāo)志物的表達(dá)；此外，1，25（OH）2D3缺乏時(shí)，可致血清鈣含量降低及破骨細(xì)胞活性升高，刺激骨骼加速溶解，維持血清鈣水平穩(wěn)定，提升骨吸收標(biāo)志物的表達(dá)。P1NP 是由占機(jī)體有機(jī)骨質(zhì)90%以上的1 型膠原經(jīng)蛋白酶作用被儲存在類骨質(zhì)中的代謝產(chǎn)物，能更靈敏反映全身骨形成狀況［7］。β-CTX 作為穩(wěn)定膠原結(jié)構(gòu)的一類1 型膠原交聯(lián)物，在骨吸收過程中可以隨著1 型膠原降解而被釋放，可靈敏且特異地體現(xiàn)骨吸收狀況［8］。

祖國醫(yī)學(xué)根據(jù)AOP 的癥狀將其歸于“骨痿”、“骨枯”等范疇［16］，其主要病因病機(jī)為平素肝脾腎虧虛為主，加之偏嗜飲酒，最終損傷筋肉骨髓［17］。由《醫(yī)學(xué)正傳》中化裁而來的生髓健骨膠囊，針對AOP的病因病機(jī)特點(diǎn)，精選君藥龜板及鹿角膠，補(bǔ)腎益精、填髓壯骨，滋養(yǎng)先天之本，研究表明［18，19］，鹿角膠及龜板的有效成分能夠有效改善血清鈣、磷的代謝，調(diào)控成骨分化及骨轉(zhuǎn)換。生黃芪、熟地黃、白術(shù)等作為臣藥，不僅可燥濕利水，解酒毒痰濕，更可滋養(yǎng)后天之源，藥理研究［20，21］表明，黃芪與熟地黃，可通過直接或間接的方式影響與調(diào)節(jié)骨的微觀結(jié)構(gòu)，抑制破骨細(xì)胞的分化，并對心血管系統(tǒng)有一定調(diào)節(jié)作用。佐以葛根、丹參、骨碎補(bǔ)、杜仲等藥，解酒毒，活血瘀，止疼痛，其中葛根不僅具有解酒毒的作用，其提取物葛根素更被證明可調(diào)控氧化應(yīng)激狀態(tài)，維持正常水平的骨轉(zhuǎn)換效率，提高骨密度［22］；丹參的活性成分丹參酮ⅡA 與骨碎補(bǔ)可調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換進(jìn)程，從而改善骨代謝［23］；杜仲可通過刺激抗氧化應(yīng)激蛋白，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，提升骨密度［24］。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，酒精不僅可以直接或間接對骨細(xì)胞及骨組織有毒害作用，抑制骨髓中成纖維細(xì)胞的增生，而且還能通過影響肝腎功能及血清內(nèi)有機(jī)物分子間接破壞骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡，導(dǎo)致骨量減少［25］。長期攝入酒精可降低腎臟中1α 羥化酶活性，從而導(dǎo)致血清中維生素D3指標(biāo)［25（OH）D3及1，25（OH）2D3］含量下降，減緩血清鈣、磷代謝及骨基質(zhì)鈣化進(jìn)度［26］。本課題前期研究已表明，生髓健骨膠囊對AOP 大鼠有以下作用：（1）明顯提升大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)，增加骨骼強(qiáng)度與韌性［27］；（2）提高骨密度，維持骨礦物質(zhì)生成與流失動態(tài)平衡，改善骨代謝紊亂［28］。（3）通過激活Wnt 信號通路干擾脂質(zhì)轉(zhuǎn)錄基因PPAR γ 2的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)AOP 的防治［17］；（4）提高血清鈣、磷和堿性磷酸酶等水平，改善骨代謝，降低破骨率，抑制骨丟失［29］；（5）可以影響骨組織中TNF-α、TGF-β1 的表達(dá)，降低空骨陷窩率，維持骨代謝平衡，修復(fù)部分骨壞死［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，生髓健骨膠囊可以顯著提升AOP 大鼠骨密度，其機(jī)制可能與促進(jìn)AOP 大鼠血清鈣的吸收，調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換水平，改善骨的微觀結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。

綜上所述，生髓健骨膠囊可通過促進(jìn)血清中鈣離子的吸收，維持骨轉(zhuǎn)換中骨骼修復(fù)及礦物質(zhì)的穩(wěn)定與平衡，并提高骨骼密度；本研究從維生素D3吸收與骨轉(zhuǎn)換水平的角度說明了AOP 大鼠骨密度的變化及生髓健骨膠囊對AOP 的影響與作用機(jī)制，為今后中藥生髓健骨膠囊的臨床應(yīng)用及研究提供思路與參考。

作者貢獻(xiàn)度說明：

任樹軍：獲取基金、統(tǒng)籌實(shí)驗(yàn)；高偉、于長江：文獻(xiàn)檢索及論文撰寫；梁彥林、譚福柱：記錄及統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；李遠(yuǎn)峰、徐煒明、徐西林：實(shí)驗(yàn)室的日常維護(hù)及耗材的更新。

所有作者均不存在利益沖突。