一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定獨(dú)活中3種活性成分的含量

胡奕勤

（江西省撫州市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，江西 撫州 344000）

獨(dú)活是一種傳統(tǒng)的中藥，是傘形科植物重齒毛當(dāng)歸A.pubescentis Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根[1]，在我國(guó)四川、湖北、甘肅、重慶、貴州和山西省等地有廣泛分布[2]。香豆素又稱雙二乙烯基氧化物或1,2-苯并吡喃酮，已被證明是獨(dú)活中含量最豐富的生物活性物質(zhì)，目前已從獨(dú)活中分離和鑒定出60余種香豆素類成分[3]。香豆素最初用作香料，后發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗人體免疫缺陷病毒、抗高血壓、抗心律失常、抗骨髓骨質(zhì)疏松、鎮(zhèn)痛和光敏作用[4-6]。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素是主要的香豆素類藥用生物活性成分，并已被用作獨(dú)活的質(zhì)量控制指標(biāo)。

高效液相色譜法（HPLC）廣泛用于中藥定量分析，通常包括外標(biāo)法（ESM）和一測(cè)多評(píng)法（QAMS）。一測(cè)多評(píng)法用于表征中藥活性成分的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，通過(guò)僅測(cè)量一種成分（內(nèi)標(biāo)物）實(shí)現(xiàn)多組分的同步測(cè)定，并引入相對(duì)校正因子進(jìn)行定量。外標(biāo)法需要使用所有待測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)品且測(cè)定對(duì)應(yīng)的含量，而一測(cè)多評(píng)法只需使用和測(cè)定內(nèi)標(biāo)物一種成分的含量[7]。在某種程度上，一測(cè)多評(píng)法不僅大大減少傳統(tǒng)中藥質(zhì)量控制的檢測(cè)時(shí)間和分析成本，且提高傳統(tǒng)中藥或植物產(chǎn)品質(zhì)量控制方法的實(shí)用性和可行性，被認(rèn)為是中藥及其制劑質(zhì)量控制的良好替代方法[8-9]。目前，2020年版《中國(guó)藥典》中采用HPLC分別測(cè)定蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量以控制獨(dú)活的質(zhì)量，其他文獻(xiàn)資料雖然也有一些采用HPLC同時(shí)測(cè)定獨(dú)活藥材中多成分含量控制其質(zhì)量的方法，但還沒(méi)有結(jié)合QAMS來(lái)控制獨(dú)活藥材質(zhì)量的相關(guān)報(bào)道[10-12]。本文建立了基于QAMS同時(shí)測(cè)定獨(dú)活中蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素3種活性成分含量的方法。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀（配2996型二極管陣列檢測(cè)器）；LC-2030高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）；ME104E型電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 藥材與試劑

蛇床子素對(duì)照品（批號(hào)：110822-201911，≥98 %）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（批號(hào)111587-202009，≥98 %）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；異歐前胡素（批號(hào)：110827-200407，含量≥98 %，上海恒遠(yuǎn)）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。獨(dú)活藥材分別來(lái)自四川、湖北、甘肅、江西和山西省，按照藥典方法處理、干燥，粉碎，過(guò)40目篩，密封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-水（B），比例為65:35；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μl；樣品分析時(shí)間為25 min。在此色譜條件下，3種香豆素類成分及在獨(dú)活樣品中的色譜表征見(jiàn)圖1，各色譜峰分離效果較好，分離度＞1.5。

圖1 混合對(duì)照品（A）和獨(dú)活樣品（B）HPLC色譜圖

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別稱取蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素對(duì)照品各2.5 mg，用甲醇溶解于25 ml量瓶中定容，混勻。取1 ml該溶液置入10 ml量瓶，稀釋至刻度，得到濃度為100 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備

精密稱取獨(dú)活藥材粉末約25 mg，用100 ml甲醇超聲（40 min，40 ℃）提取2次，合并提取液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓（60 ℃，80 r/min，0.07 MPa）濃縮，精密稱取30 mg濃縮提取物用2 ml甲醇超聲使溶解，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 將混合對(duì)照品溶液用甲醇分別稀釋至濃度為80，40，20，10和5 μg/ml后注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。結(jié)果以峰面積y為縱坐標(biāo)，以各組分的濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性回歸

2.4.2 檢測(cè)限和定量限 取5 μg/ml的混合對(duì)照品溶液，用甲醇將其稀釋至各成分信噪比約為10:1，此時(shí)的相應(yīng)濃度即為各成分的定量限，繼續(xù)稀釋至信噪比為3:1，此時(shí)的相應(yīng)濃度即為各成分的檢測(cè)限。結(jié)果，獨(dú)活中蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素的檢測(cè)限分別為2.2，2.7和1.7 μg/ml，定量限分別為7.3，9.1和5.7 μg/ml。

2.4.3 耐用性實(shí)驗(yàn) 分別考察不同柱溫（25，30，35 ℃）、不同流速（0.8，1，1.2 ml/min）、不同流動(dòng)相比率（60 %，65 %，70 %甲醇）等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果，獨(dú)活中蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素在25～35 ℃柱溫范圍內(nèi)，3種組分含量測(cè)定結(jié)果的RSD值分別為1.12 %，0.97 %和0.86 %，其中30 ℃分離效果最佳；在0.8～1.2 ml/min流速范圍內(nèi)3種組分含量測(cè)定結(jié)果的RSD值分別為1.35 %，1.46 %和1.52 %，分離效果均良好；在流動(dòng)相甲醇含量為60 %～70 %范圍內(nèi)3種組分含量測(cè)定結(jié)果的RSD值分別為0.94 %，1.12 %和1.47 %，分離效果均良好。在考察范圍內(nèi)，柱溫、流速和流動(dòng)相比率對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響，可用于獨(dú)活中3組分含量的測(cè)定。

2.4.4 精密度實(shí)驗(yàn) 系統(tǒng)精密度試驗(yàn)：精密吸取40 μg/ml濃度梯度混合對(duì)照品溶液20 μl，注入液相色譜儀，連續(xù)6次進(jìn)樣測(cè)定峰面積，分別計(jì)算RSD。結(jié)果，蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素的RSD值分別為0.38 %，0.40 %和0.52 %，表明方法的精密度良好。

中間精密度試驗(yàn)：由不同人員（甲、乙、丙3個(gè)實(shí)驗(yàn)者）使用不同的儀器，按照上述含量測(cè)定方法分別測(cè)定6份獨(dú)活藥材樣品中各組分的含量，并計(jì)算測(cè)定結(jié)果的RSD值。結(jié)果表明，蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素的RSD值分別為0.98 %，1.02 %和1.34 %，表明該分析方法中間精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次獨(dú)活藥材6份，按照上述樣品制備方法制備供試品溶液，在相同的色譜條件下測(cè)定3種成分的含量和RSD值。結(jié)果表明，蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素的含量分別為5.62，0.82和0.32 mg/g，RSD值分別為0.98 %，1.02 %和1.23 %，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液和獨(dú)活供試品溶液，分別在制備后的第0，2，4，8，12，16，24 h分別進(jìn)樣20 μl，測(cè)定蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素的峰面積，計(jì)算對(duì)照品溶液3種組分的RSD值分別是0.87 %，1.04 %和0.97 %，供試品溶液3種組分的RSD值分別是1.12 %，1.38 %和1.24 %，表明在該檢測(cè)條件下對(duì)照品和供試品均是穩(wěn)定的。

2.4.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知各組分含量的獨(dú)活藥材粉末6份，分別加入與獨(dú)活樣品中各組分含量等量的3種對(duì)照品溶液，按照上述樣品制備方法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品平行6次。加樣回收率結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明，蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的平均加樣回收率分別為100.58 %，100.01 %和102.30 %，RSD分別為1.06 %，1.27 %和2.39 %，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表2 獨(dú)活中3種成分的加樣回收率

2.5 相對(duì)校正因子的確定

2.5.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算 精密吸取40 μg/ml的混合對(duì)照品溶液4，8，10，16，20 μl，按照優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)樣，記錄各組分的色譜峰面積。以蛇床子素（s）為內(nèi)標(biāo)物，采用多點(diǎn)法計(jì)算異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對(duì)校正因子（fk/s）分別為0.60±0.00800和0.58±0.00800，RSD值分別為1.30 %和1.04 %。

2.5.2 相對(duì)校正因子的耐用性 分別采用島津LC-2030和Waters 2695高效液相色譜儀，考察不同廠家的高效液相色譜儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果使用島津LC-2030高效液相色譜儀得到的異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對(duì)校正因子分別為0.59±0.00775和0.56±0.02350，RSD值分別為1.14 %和1.29 %；使用Waters 2695高效液相色譜儀得到的異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對(duì)校正因子分別為0.60±0.00786和0.56±0.01272，RSD值分別為1.40 %和1.18 %。

分別采用安捷倫Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱和漢邦 KU60826 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，考察不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果，使用安捷倫Zorbax SB-C18色譜柱得到的異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對(duì)校正因子分別為0.60±0.00820和0.56±0.01052，RSD值分別為1.36 %和1.24 %。使用漢邦 KU60826 C18色譜柱得到的異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對(duì)校正因子分別為0.59±0.01103和0.57±0.00935，RSD值分別為1.30 %和1.65 %。

此外，在其他色譜條件不變的情況下，考察了不同柱溫（20，25，30，35，40 ℃）和不同流速（0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 ml/min）對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果，異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯在不同流速下的相對(duì)校正因子分別為0.60±0.00801和0.57±0.00894，RSD值分別為1.37 %和1.31 %；在不同柱溫下的相對(duì)校正因子分別為0.60±0.00400和0.56±0.01010，RSD值分別為0.78 %和1.61 %。

結(jié)果表明，使用不同的儀器、色譜柱、流速和柱溫對(duì)相對(duì)校正因子影響較小。RSD值均小于2 %，所建立的獨(dú)活中3種香豆素類成分的測(cè)定方法適用于實(shí)際分析。

2.6 樣品含量測(cè)定

采用建立的QAMS法和ESM法同時(shí)測(cè)定了不同產(chǎn)地獨(dú)活藥材中3種香豆素類成分的含量，并比較兩種方法所得結(jié)果的差異，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，當(dāng)蛇床子素用作內(nèi)標(biāo)物時(shí)，QAMS和ESM方法的結(jié)果無(wú)顯著性差異，表明QAMS法用于獨(dú)活藥材中3種香豆素類活性成分的含量測(cè)定可行性較高。

表3 不同方法測(cè)定獨(dú)活中香豆素類成分含量的結(jié)果比較

3 討論

3.1 樣本制備方法的選擇

在實(shí)驗(yàn)前期選擇了不同的提取方法和提取溶劑對(duì)藥材的提取方案進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，相對(duì)超聲提取法，水蒸汽回流法和恒溫水浴加熱法提取時(shí)間較長(zhǎng)（約3～5 h）且提取率較低；乙醇作為提取溶劑時(shí)3種香豆素類化合物的提取回收率均低于甲醇，因此本研究選擇甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取。

此外，對(duì)獨(dú)活提取液進(jìn)行濃縮時(shí)比較了減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法和水浴干燥法。兩種方法所需的時(shí)間大致相同。然而，當(dāng)在水浴上干燥時(shí)，提取液與空氣直接接觸，易導(dǎo)致雜質(zhì)污染提取物。因此，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法來(lái)干燥獨(dú)活提取物。

3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

獨(dú)活藥材中含有多種香豆素類成分，但考慮對(duì)照品的價(jià)格和可用性，本實(shí)驗(yàn)選定蛇床子素作為內(nèi)標(biāo)物計(jì)算異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對(duì)校正因子，能有效解決其余兩種中藥對(duì)照品稀缺、性質(zhì)不穩(wěn)定和價(jià)格昂貴等問(wèn)題。

4 結(jié)論

本研究報(bào)告的QAMS方法可用于獨(dú)活中3種香豆素類活性成分的測(cè)定，并經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證是準(zhǔn)確、科學(xué)和可行的，適用于獨(dú)活藥材多指標(biāo)的質(zhì)量控制。此外，本研究首次報(bào)道的使用QAMS方法測(cè)定獨(dú)活藥材中3種香豆素類成分含量的新方法可為獨(dú)活及其制劑的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供指導(dǎo)。