氣相色譜法測定食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉方法研究

于艷麗

（上海杉達(dá)學(xué)院，上海 201209）

環(huán)己基氨基磺酸鈉，別名甜蜜素，是GB2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》允許使用的人工合成甜味劑，可廣泛用于調(diào)味品、果醬、果凍、冰淇淋、糕點(diǎn)、蜜餞、飲料等食品，同時(shí)還可以與其它甜味劑混合使用，是目前我國食品行業(yè)中應(yīng)用較多的一種甜味劑，其甜度約為蔗糖的30倍，風(fēng)味較自然，后苦不明顯，熱穩(wěn)定性高，是不被人體吸收的低熱能甜味劑[1]。環(huán)己基氨基磺酸鈉作為一種食品添加劑，其安全性在世界范圍內(nèi)仍然存在爭議，在我國雖然國標(biāo)中規(guī)定了明確的使用限量，但是超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[2-3]，所以對食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的檢測方法進(jìn)行研究非常必要。環(huán)己基氨基磺酸鈉檢測方法很多，GB5009.97-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》中規(guī)定了3種方法：氣相色譜法[4-9]、液相色譜法[10-12]和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[13-14]。其他研究還有氣相色譜-質(zhì)譜法[15-16]，毛細(xì)管電泳/電導(dǎo)法[17]、核磁共振波譜法[18]等。在這些方法中，氣相色譜法最經(jīng)典，關(guān)于其實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化也較多[18]。其實(shí)驗(yàn)原理是食品中的環(huán)己基氨基磺酸鈉用水提取后，在硫酸介質(zhì)中與亞硝酸反應(yīng)，生成環(huán)己醇亞硝酸酯，酯不穩(wěn)定部分分解為環(huán)己醇，而二者的峰面積之和保持穩(wěn)定，故定量計(jì)算可用兩者峰面積之和，采用外標(biāo)法定量。不同研究關(guān)于實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化多集中于反應(yīng)試劑用量、時(shí)間和酯化溫度等，關(guān)于萃取劑的種類選擇和冷凍時(shí)間研究較少。本文建立氣相色譜外標(biāo)法測定食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的方法，主要探討冷凍時(shí)間、萃取劑種類、色譜柱溫條件的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890B型氣相色譜儀（美國安捷倫公司，附FID檢測器）；AL204電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SORVALL ST16R離心機(jī)（美國賽默飛公司）。

1.2 試藥

環(huán)己基氨基磺酸鈉對照品（99.9 %，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；正己烷、環(huán)己烷、正庚烷（色譜純，美國Fisher公司）；石油醚（沸程為30～60 ℃）；硫酸，亞硝酸鈉，亞鐵氰化鉀，硫酸鋅，氯化鈉（分析純）?；鹜取⑻妓犸嬃?、話梅、奶香味瓜子、黃桃罐頭、虎皮蛋糕、冰糖雪梨飲料、蔥姜料酒均購自某電商平臺。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：HP-5毛細(xì)管柱（30 m× 0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度80 ℃保持1 min，以5 ℃/min升溫至90 ℃保持0.5 min，以40 ℃/min升溫至 200 ℃保持2 min；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；檢測器：FID，檢測器溫度：260 ℃；進(jìn)樣量：2 μl；載氣：氦氣，流量1 ml/ min；尾吹流量（He）：25 ml/ min；空氣流量：400 ml/ min，氫氣流量：40 ml/ min；分流比：5:1。

2.2 樣品處理

高脂樣品如火腿：稱取打碎、混勻的樣品5.00 g于50 ml 離心管中，加入25 ml石油醚，振搖，超聲提取3 min，再混勻，離心（1000 r/min以上）10 min，棄石油醚，再用25 ml石油醚提取1次，棄石油醚，60 ℃水浴揮發(fā)去除石油醚，殘?jiān)?0 ml水，混勻，超聲提取20 min，加2 ml濃度為150 g/L亞鐵氰化鉀溶液，混勻，再加入2 ml濃度為300 g/L硫酸鋅溶液，混勻，離心（3000 r/min）10 min，過濾，用水洗滌殘?jiān)占癁V液并定容至50 ml，混勻備用。液體試樣處理如碳酸飲料：稱取25.0 g試樣于燒杯中，60 ℃水浴加熱30 min以除二氧化碳，放冷，用水定容至50 ml，備用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液（5.00 mg/ml）：稱取0.5000 g環(huán)己基氨基磺酸鈉對照品，加水溶解并定容至100 ml，即配得 5 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.00 mg/ml）：準(zhǔn)確移取20.0 ml環(huán)己基氨基磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水稀釋并定容至100 ml，混勻。環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)系列：準(zhǔn)確移取1.00 mg/ml環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50，1.00，2.50，5.00，10.0，25.0 ml，置入50 ml量瓶，加水定容，配成濃度為0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 mg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4 衍生化

準(zhǔn)確移取10 ml系列標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品處理液分別置于50 ml帶蓋離心管中，離心管置試管架上-18 ℃冰柜中5 min后，加入2.5 ml濃度為50 g/L的亞硝酸鈉溶液，2.5 ml濃度為200 g/L的硫酸溶液，蓋緊離心管蓋，搖勻，在-18 ℃冰柜中放置15 min；加入2.5 g氯化鈉，蓋上蓋后置旋渦混合器上振動(dòng)1 min，準(zhǔn)確加入5.00 ml正己烷，低溫靜置5 min，分層后取上清液供氣相色譜分析。

2.5 色譜分析

分別吸取2 μl衍生化處理后的標(biāo)準(zhǔn)系列各濃度溶液及樣品處理液，注入氣相色譜儀中，獲取色譜圖，以保留時(shí)間定性，環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇兩峰面積之和定量。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，兩峰之和為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣液中的待測樣品濃度。

2.6 圖譜

對照品按2.4項(xiàng)步驟衍生化，按2.5項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測量，所得色譜圖見圖1。在此反應(yīng)條件下的色譜圖呈現(xiàn)兩個(gè)峰型良好的色譜峰，保留時(shí)間分別為3.901，4.071 min，這是因?yàn)榄h(huán)己醇亞硝酸酯穩(wěn)定性不高，發(fā)生分解轉(zhuǎn)化為環(huán)己醇的現(xiàn)象，前峰為酯化反應(yīng)產(chǎn)物環(huán)己醇亞硝酸酯，后峰為環(huán)己醇。不過因?yàn)閮煞N物質(zhì)并存，且保留時(shí)間接近，表現(xiàn)在色譜峰上的雙峰更容易識別，利于定性，定量時(shí)應(yīng)以兩峰面積的加和計(jì)算。實(shí)際樣品檢測的圖譜和標(biāo)準(zhǔn)品相近，見圖2。

圖1 標(biāo)品色譜圖

2.7 線性范圍與檢出限、定量限

取衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列在上述優(yōu)化后的儀器條件下上機(jī)檢測，以環(huán)己基氨基磺酸鈉濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，獲得回歸方程Y= 6388.9X+5.36，相關(guān)系數(shù)r=0.99996。環(huán)己基氨基磺酸鈉含量在0.01～0.50 mg/ml有良好的線性關(guān)系。

固體空白樣品中添加 1.00 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μl于5 g（即加標(biāo)濃度為：0.010 g/kg），樣品經(jīng)前處理，儀器測定后，被測物信噪比=3.3≥3，表明方法的檢出限可至0.010 g/kg，定量限可至0.030 g/kg。液體空白樣品中添加 1.00 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液250 μl于25 g（即加標(biāo)濃度為：0.010 g/kg），樣品經(jīng)前處理，儀器測定后，被測物信噪比=17.0≥3，表明方法的檢出限可至0.010 g/kg，定量限可至0.030 g/kg。

2.8 加標(biāo)回收率

選取未檢出環(huán)己基氨基磺酸鈉的某品牌紅腸和某品牌的碳酸飲料，各稱取6份，紅腸每份5 g，碳酸飲料每份25 g，按表1 所示分別添加4個(gè)水平的環(huán)己基氨基磺酸鈉，計(jì)算加標(biāo)回收率。紅腸的回收率在100.2 %～102.1 %之間，碳酸飲料的回收率在99.5 %～101.0 %之間。

表1 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 實(shí)際樣品檢測

用本方法對市售蜜餞、炒貨、水果加工制品、糕點(diǎn)、飲料、調(diào)味品等六大類食品進(jìn)行分析。分別挑選市售話梅、奶香味瓜子、黃桃罐頭、虎皮蛋糕、冰糖雪梨飲料、蔥姜料酒各10個(gè)樣品進(jìn)行檢測分析。檢測結(jié)果表明，話梅和奶香味瓜子的檢出率均為100 %，但是均未超標(biāo)；虎皮蛋糕和蔥姜料酒未檢出；黃桃罐頭、冰糖雪梨飲料檢出率低，分別有1個(gè)樣品檢出甜蜜素，含量分別為0.91 g/kg，0.84 g/kg，依據(jù)國標(biāo)判定，甜蜜素含量超標(biāo)。

3 討論

3.1 衍生化時(shí)間優(yōu)化

探討最佳衍生化時(shí)間，加入衍生試劑后的離心管分別在-18 ℃冰柜中冷凍放置0，5，10，15，20，30，40 min，獲得不同衍生化時(shí)間后的色譜峰峰面積，見圖3。0～40 min的不同衍生化時(shí)間內(nèi)，酯的峰面積優(yōu)勢明顯，均約260，醇峰面積均約9.5，表明在此條件下由酯向醇的轉(zhuǎn)化較少。直接上機(jī)測量的0 min樣品，峰面積已達(dá)最大值，和其他衍生化時(shí)間的峰面積無顯著差異。表明酯化反應(yīng)瞬時(shí)發(fā)生，亞硝酸鈉和硫酸溶液加入并充分搖勻后，酯化反應(yīng)已經(jīng)完成。這和梁曉涵[22]認(rèn)為的的衍生化反應(yīng)在10 min后回收率最大的結(jié)論不同。本文認(rèn)為，-18 ℃冷凍時(shí)間對于衍生化反應(yīng)的影響較小，冷凍的意義更多是來自于大批量樣品的同步處理而產(chǎn)生漫長等待上機(jī)時(shí)間時(shí)兩個(gè)方面的影響：一是低溫有效減少待測物質(zhì)的揮發(fā)，二是減緩環(huán)己醇亞硝酸酯向環(huán)己醇的轉(zhuǎn)化速度。江豐等[23]認(rèn)為當(dāng)正庚烷提取液處于酸性條件時(shí)，環(huán)己醇亞硝酸酯不會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)生成環(huán)己醇。本文認(rèn)為溫度同樣是一個(gè)重要的因素。

圖3 不同衍生化時(shí)間的峰面積

對于冷凍時(shí)間的選擇，本文建議對于批量樣品的檢測，-18 ℃冷凍衍生化時(shí)間可選擇30 min，而較少樣品的測定冷凍衍生15 min即可，本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)衍生化條件選取-18 ℃冷凍15 min，替代國標(biāo)冰浴30 min。筆者欲考慮更長的冷凍衍生化時(shí)間的影響，但是體系50 min后開始結(jié)冰，考慮到等待冰融化才可測量的時(shí)間內(nèi)，亦會(huì)發(fā)生環(huán)己醇亞硝酸酯向環(huán)己醇的轉(zhuǎn)化，且會(huì)增加檢測等待時(shí)間，更長的冷凍時(shí)間則無必要。

3.2 提取劑的選擇

分別采用正己烷、環(huán)己烷、正庚烷作為提取劑所獲色譜圖，見圖4。3種提取劑提取衍生化產(chǎn)物后進(jìn)行測定，均獲得環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇兩個(gè)比較明顯的色譜峰，主峰保留時(shí)間一致，均在3.9 min，且峰型良好。按照正己烷、環(huán)己烷、正庚烷的順序，三者作為溶劑所獲得的色譜峰的峰寬逐漸變窄，峰型變得更為尖銳，環(huán)己烷和正庚烷作為提取劑所測量的峰面積也略大于正己烷。

圖4 不同提取劑色譜圖

正庚烷所獲得色譜圖顯示，除環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇的色譜峰外，二者之間出現(xiàn)一個(gè)明顯的雜峰，且無法和待測物峰有效分離。三種提取試劑的空白實(shí)驗(yàn)所獲色譜圖如圖5所示。由圖5C來看，正庚烷在環(huán)己基氨基磺酸鈉出峰時(shí)間（4 min左右）有幾個(gè)明顯的小的雜峰，正庚烷不是測量環(huán)己基氨基磺酸鈉的理想提取劑。同樣，環(huán)己烷也不是測定環(huán)己基氨基磺酸鈉的理想提取劑。雖然正己烷作為提取劑所獲峰面積稍小，但是峰型良好，在此時(shí)間段內(nèi)無雜峰干擾，是測量環(huán)己基氨基磺酸鈉的理想提取溶劑。

圖5 試劑空白色譜圖

3.3 色譜柱溫升溫程序優(yōu)化

考察3種不同的色譜柱溫度條件對色譜圖的影響，見圖6。A恒溫程序：恒溫80 ℃，保持6 min，200 ℃后運(yùn)行2 min。B程序升溫：初溫80℃保持1 min，5 ℃/min升溫至90 ℃保持0.5 min，40 ℃/min升溫至 200 ℃保持2 min。C程序升溫：初溫55 ℃保持3 min，10 ℃/min升溫至90 ℃保持0.5 min，20 ℃/min升溫至 200 ℃保持3 min。由圖6可見，3種柱溫條件都能獲取可供準(zhǔn)確分析的色譜圖。C也是國標(biāo)方法中的升溫程序，色譜峰的兩峰面積和最大，峰型最尖銳，且兩峰完全分開，實(shí)現(xiàn)基線分離。A和B所獲色譜峰的色譜峰面積相當(dāng)，分別是172和168，從色譜峰來看，C檢測效果最佳。從所需時(shí)間來看，C需求時(shí)間為15.5 min，B為8.25 min；A為8 min，A和B檢測時(shí)間大大縮短，檢測效率高?？紤]到恒溫程序?qū)ιV柱的污染較大，在兼顧效率和色譜柱壽命的情況下，選擇B柱溫條件。

圖6 不同柱溫程序色譜圖

4 結(jié)論

環(huán)己基氨基磺酸鈉與亞硝酸鈉的酯化反應(yīng)是瞬間完成的，-18 ℃的冷凍條件能有效減少待測物的揮發(fā)及環(huán)己醇亞硝酸酯向環(huán)己醇的轉(zhuǎn)化；冷凍時(shí)間長短，可依據(jù)批量檢測的樣品數(shù)確定。提取劑正己烷與環(huán)己烷和正庚烷相比，無雜峰干擾，是一種理想的提取試劑及溶劑；色譜柱溫的升溫條件：初溫80 ℃保持1 min，5 ℃/min升溫至90 ℃保持0.5 min，40 ℃/min升溫至 200 ℃保持2 min，可進(jìn)行有效快速分析，并兼顧色譜柱壽命及檢測效率。

本文實(shí)驗(yàn)條件和國標(biāo)相比，檢測時(shí)間顯著縮短，其一來自衍生化過程冷凍時(shí)間的縮短，-18 ℃冷凍15 min，替代國標(biāo)冰浴30 min。其二來自于色譜柱程序升溫時(shí)間的減少，現(xiàn)有程序的8.25 min替代國標(biāo)的15.5 min。通過固體樣品香腸和液體樣品碳酸飲料的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)本方法有很好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足固體及液體食品樣品中環(huán)己基氨基磺酸鈉含量測定的方法要求。