UPLC-MS/MS同時快速檢測清咽類制劑25種化學藥物的方法

周 穎，黎 強，陳立波，陳 潔，李冬云

（1.玉林市食品藥品檢驗監(jiān)測中心，廣西 玉林 537000；2.玉林中藥材（含香型料）質量檢測與評價工程技術研究中心，廣西 玉林 537000）

近年，有不法分子向涼茶制品、潤喉糖等改善咽喉不適的食品中添加化學藥物，達到快速有效地緩解咽喉不適的目的，廣西、廣東等地陸續(xù)有多起涼茶中非法添加對乙酰氨基酚、土霉素等化學藥物的報告和案件[1-2]，嚴重影響人體健康和產業(yè)健康發(fā)展[3]。

根據一定范圍的市場調研及查閱文獻[4-11]發(fā)現，宣稱清熱解毒、消炎利咽的制劑有添加化學藥物的可能，目前發(fā)現的藥物以非甾體解熱鎮(zhèn)痛藥、激素、抗菌藥和中樞興奮劑等，種類復雜。宋寧寧等[9]建立QuEChERS-UPLC-MS/MS測定涼茶中12種化學藥物的方法；韓婉清等[10]采用SPE-UPLCMS/MS測定涼茶15種植物源性興奮劑和外源性藥物。以上研究中未覆蓋顆粒劑、茶劑、果脯、潤喉糖等不同劑型清咽類產品，而這類劑型的產品也越來越受消費者歡迎。本文以添加適應癥吻合、價廉易得、臨床應用廣泛的25種化學藥物作為研究對象，采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）快速篩查非法添加藥物，本方法便捷、重復性好、檢測準確、耐用性高，為清咽類制劑的監(jiān)督檢驗提供技術支持。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Xevo-TQ-Smicro高效液相-質譜聯用儀（Waters ACQUITY H-Class PLUS四元系統，Empower色譜工作站，美國Waters公司）；XS-205DU電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.2 藥品與試劑

對乙酰氨基酚（批號：100018-201610，含量：99.9 %）、安替比林（批號：100506-200301，含量：100.0 %）、氨基比林（批號：100503-200301，含量：100.0 %）、沙丁胺醇（批號：100204-201103，含量：99.7 %）、氫溴酸右美沙芬（批號：100201-201003，含量：95.1 %）、頭孢他定（批號：130484-200502，含量：84.2 %）、馬來酸氯苯那敏（批號：100047-201507，含量：99.7 %）、鹽酸克侖特羅（批號：100072-200402，含量：100.0 %）、雙氯芬酸鈉（批號：100334-201803，含量：100.0 %）、保泰松（批號：100481-200601，含量：99.9 %）、富馬酸酮替芬（批號：100230-201904，含量：99.8 %）、磷酸苯丙哌林（批號：100237-200702，含量：99.8 %）、鹽酸二氧丙嗪（批號：10299-0001，含量：100.0 %）、青霉素（批號：130437-200603，含量：88.8 %）、乙酰螺旋霉素（批號：130347-200403，含量：78.3 %）、頭孢泊肟酯（批號：130517-200802，含量：73.6 %）、紅霉素（批號：130307-200716，含量：93.5 %） 、麥迪霉素（批號：130337-9803，含量：95.9 %）、交沙霉素（批號：130359-200301，含量：100 %）、羅紅霉素（批號：130557-200502，含量：94.1 %）、阿司匹林（批號：100113-200603，含量：100.0 %）、茶堿（批號：100121-201104）、尼美舒利（批號：100555-200501，含量：100.0 %）、吲哚美辛（批號：100258-200904，含量：99.9 %）、頭孢呋辛酯（批號：130492-200402，含量：80.8 %）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純（美國Fisher，色譜純）；氯化鈉、乙酸為國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為自制超純水。

1.3 樣本來源

本文研究中使用的涼茶、潤喉糖、顆粒劑、蜜餞類產品，收集于廣西、廣東各縣市市售以及市監(jiān)督抽檢樣品，涵蓋有現場制作銷售的涼茶、清咽類蜜餞和預包裝產品共計110批，其中樣品編號1～89為市售涼茶，編號90～110為潤喉糖、顆粒劑、蜜餞類等。根據市售涼茶、清咽類蜜餞等配方，選取常用的中藥材作為制備空白基質溶液的品種，均采購于玉林市銀豐中藥材市場，經玉林市食品藥品檢驗檢測中心中藥室鑒定為正品。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL CORE C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）分離，以水-甲醇-0.025 %乙腈系統為流動相梯度洗脫；流動相A相為水，B相為甲醇，C相為含0.025 %甲酸的乙腈溶液梯度洗脫（見表2）；流速0.25 ml/min；柱溫：35 ℃；進樣量5 μl。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（electro-spray ion，ESI），電離模式：正離子模式、負離子模式；檢測方式：多反應監(jiān)測（multi reaction monitoring，MRM）模式；毛細管電壓 （kV）：2.50；錐孔電壓 （V）：30.00；離子源溫度 （℃）：150；脫溶劑氣體溫度 （℃）：500；錐孔氣流量 （L/Hr）：20；脫溶劑氣體流量 （L/Hr）：1000。

25種非法添加藥物的質譜參數見表2，總離子流圖見圖1。

圖1 25種非法添加藥物的總離子流圖

2.3 樣品溶液的制備

精密稱取/量取1.3項下的樣品 0.20 g/0.20 ml（固體研磨成粉碎，液體樣品振搖均勻）置入15 ml離心管，加入1 ml飽和氯化鈉溶液，渦旋30 s使分散，精密加入0.5 %甲酸的乙腈溶液5 ml，渦旋30 s，超聲提取30 min，10 000 r/min離心5 min，吸取上清置入10 ml量瓶，加50 %乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液定容至刻度，搖勻，提取液過0.22 μm濾膜，待測。若樣品中待測成分濃度超出曲線范圍，用50 %乙腈適當稀釋。

2.4 空白基質溶液的制備

取生地、大青葉、板藍根、麥冬、知母、薄荷、桑葉、牡丹皮、石斛、女貞子、甘草中藥材各2～10 g，加清水500 ml大火煎煮燒開后，小伙熬制30 min，制成約100 ml的空白基質溶液，放涼，用濾紙濾過。

2.5 基質匹配標準曲線的配制

2.5.1 對照品儲備溶液配制 精密稱取各對照品10 mg，其中頭孢他定、頭孢泊肟酯，頭孢呋辛酯、青霉素置于10 ml量瓶，沙丁胺醇、氫溴酸右美沙芬、鹽酸克侖特羅、富馬酸酮替芬、苯丙哌林、二氧丙嗪、乙酰螺旋霉素、紅霉素、麥迪霉素、交沙霉素、羅紅霉素置于50 ml量瓶，其余對照品分別置于各20 ml量瓶中，加乙腈適量（沙丁胺醇和鹽酸特倫特羅加適量水溶解）振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.5.2 混合對照品儲備液配制 精密量取上述各單標溶液頭孢他定0.4 ml、頭孢泊肟酯0.2 ml、頭孢呋辛酯0.2 ml、青霉素0.2 ml、沙丁胺醇0.1 ml、氫溴酸右美沙芬0.2 ml、鹽酸克侖特羅0.1 ml、富馬酸酮替芬0.2 ml、苯丙哌林0.1 ml、二氧丙嗪0.1 ml、乙酰螺旋霉素0.4 ml、紅霉素、麥迪霉素、交沙霉素、羅紅霉素各0.2 ml，其余對照品各0.16 ml置入同一20 ml量瓶，用50 %的乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液稀釋至刻度，搖勻即得。

2.5.3 混合對照品標準曲線配制 分別精密量取上述混合對照品儲備液各0.025，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 ml，分別置入 15 ml離心管，加入制備好的空白基質溶液0.2 ml，按2.3項方法制備混合對照品標準曲線，用50 %乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液定容至10 ml，照2.1和2.2項方法進樣測定。

3 結果

3.1 標準曲線

按照2.5.3項的測得結果，以25種化學藥物成分的進樣濃度為X，對應的峰面積為Y，得25種化學藥物的標準曲線，結果見表3。

3.2 系統適應性考察

3.2.1 精密度 取2.4項下空白基質溶液0.2 ml，加入2.5.2項下混合對照品儲備液0.05 ml，置入15 ml離心管，按2.3項方法制備精密度溶液，加50 %乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液定容至10 ml，連續(xù)進樣6次測定。結果表明，25種化學藥物的RSD為0.23 %～1.52 %，可見儀器的精密度良好。

3.2.2 重復性 取2.4項下空白基質溶液6份各0.2 ml，加入2.5.2項下混合對照品儲備液0.05 ml，置入15 ml離心管，按2.3項方法制備重復性溶液，加50 %乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液定容至10 ml，連續(xù)進樣6次測定。結果表明，25種化學藥物的RSD為0.23%～1.52%，可見儀器的精密度良好結果表明，25種化學藥物的RSD為1.01 %～2.24 %，可見方法的重復性良好。

3.2.3 穩(wěn)定性 取2.4項下空白基質溶液0.2 ml，加入2.5.2項下混合對照品儲備液0.05 ml，置入15 ml離心管，按2.3項方法制備穩(wěn)定性溶液，加50 %乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液定容至10 ml，在0，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0 h分別進樣測定，以25種化學藥物成分峰面積為指標，測定其穩(wěn)定性。結果表明25種化學藥物的穩(wěn)定性RSD為1.75 %～3.07 %。表明各成分均在24 h內穩(wěn)定。

3.3 檢出限與定量限

以2.5.3項下混合對照品標準曲線配制的最低點濃度標準溶液稀釋20倍后，重復測定6次，以信噪比S/N≥3確定檢測下限（LOD），以信噪比S/N≥10確定定量下限（LOQ），結果見表3。

3.4 加標回收率

取空白基質溶液9份，分別添加3個不同濃度混合對照品儲備液0.025，0.10，0.20 ml各3份，按照2.3項下制備的樣品溶液，平行測定6次，結果表明，采用本方法檢測的25種化學藥物的回收率范圍為75.80 %～111.11 %，RSD（n=6）在0.78 %～3.41 %。其中鹽酸特倫特羅、頭孢拉定的回收率較低。線性回歸方程，線性范圍、相關系數結果見表3。

3.7 抽檢樣品測定

應用本法測定市售產品中25種化學藥物，結果在涼茶中有各種化學藥物的檢出，而顆粒劑、茶劑、果脯、潤喉糖中均未檢出。有檢出樣品的情況見表4。

4 討論

4.1 色譜柱的選擇

本實驗考察了Agilent SB-C18、Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18、CAPCELL PAK C18（IF2）、及CAPCELL CORE C18這4種型號的色譜柱，對25種化合物進行分離，結果發(fā)現Agilent SB-C18出峰峰型好，但是頭孢類成分未能很好分離，Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18還不及Agilent SB-C18的分離效果，CAPCELL PAK C18（IF2）各成分基本能分離，但是頭孢類峰型差，CAPCELL CORE C18出峰峰型較好，響應高，各成分分離較好，故本實驗選擇CAPCELL CORE C18色譜柱進行分離。

4.2 流動相選擇

流動相的組成和比例直接影響物質的分離，靈敏度[12]。本實驗要求的流動相既要達到分離25種化合物的效果，還要保證離子化效率，以滿足質譜的監(jiān)測，在流動相中加入揮發(fā)性有機酸可提高離子化效率，同時也利于樣品的溶解。由于甲酸相對分子量小，酸性較乙酸強，更有利于離子化和質譜的解析[13]。故考察多種流動相系統，其中采用0.1 %甲酸水-甲醇和0.1 %甲酸水-乙腈系統[14]，經過實驗發(fā)現加入乙腈流動相比甲醇的出峰較快，但是頭孢類和個別青霉素不出峰或者峰型差，負離子模式相應較低。采用水-甲醇-含0.025 %甲酸的乙腈溶液系統，正負離子響應良好，且大部分頭孢類成分可成峰，目標化合物能較好實現分離。最終采用水-甲醇-0.025 %乙腈溶液系統梯度洗脫，結果見表1。

4.3 子離子選擇性及碰撞能優(yōu)化

根據25種化學藥物的理化性質及母離子，采用正離子監(jiān)測方法對這25種對照品溶液進行MS/MS分析，首先進行一級掃描，對母離子進行篩選，優(yōu)化毛細管電壓、錐孔電壓、離子源溫度，脫溶劑氣溫度、脫溶劑流量了等質譜參數，再施加一定量的碰撞氣，對母離子進行子離子掃描獲得響應的子離子峰。選擇豐度強，干擾小的離子作為定量和定性離子，得到優(yōu)化后優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，結果見表2。

4.4 空白基質溶液的選擇

根據市售涼茶以及宣稱清咽類產品的中藥配方，本實驗選取其中通常選用的中藥材，其均有清熱解毒、潤肺涼血等功效，借鑒此類制劑傳統的清水煎煮的方式，制備空白基質溶液進行系統適應性實驗，以減少樣品測定過程中的基質干擾影響。

5 結論

本方法通過采用液相色譜儀串聯質譜法，在20 min內對清咽類涼茶、顆粒劑、茶劑、蜜餞、潤喉糖中25種成分進行快速定量定性分析。經篩查110批樣品，發(fā)現涼茶、梨膏糖、蜜餞類均有非法添加化學藥物的情況，特別是涼茶中，添加對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、阿司匹林、紅霉素情況較多。（1）對乙酰氨基酚的添加濃度多數達到2～10 mg/g；（2）多數檢出情況存在同時非法添加兩種以上化學藥物，個別甚者同時添加5種藥物；（3）在89批的涼茶中，檢出有非法添加化學藥物的樣品24批，檢出率為27 %，在20批的其他制劑中檢出有化學藥物的樣品3批，檢出率為14 %，均為梨膏糖、潤喉糖。

本方法考察的樣品均為市售品種，是消費者食用的普通食品，目前市場上品種繁多，民眾無法按劑量服用，容易導致重復用藥，過量用藥，同時也給監(jiān)管帶來盲區(qū)。本方法提取方便，準確度高，精密度，耗時短，在實際應用中可高效的對此類清咽類制劑中非法添加化學藥物進行快速確證篩查。