酶聯(lián)免疫吸附法測定藥食同源中藥飲片中黃曲霉毒素的研究

中藥材在生產、運輸、儲存過程中容易受到黃曲霉的侵染從而產生黃曲霉毒素[1]。黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產生的雙呋喃環(huán)類毒素，主要分為B族和G族兩種，其中以黃曲霉毒素B1的毒性最大，致癌性最強。

目前黃曲霉毒素的檢測方法有薄層色譜法、色譜分析法和免疫分析法[2]?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版將酶聯(lián)免疫法列入2351通則中真菌毒素測定法的黃曲霉毒素測定法，為中藥材、中藥飲片及中藥制劑中黃曲霉毒素的測定提供了新的檢測方法。黃曲霉毒素在食品中的研究較為廣泛，而在中藥飲片的研究仍較少。傳統(tǒng)的色譜分析方法有著靈敏度高、重復性好的優(yōu)勢，但操作復雜不利于大批次快速檢測。隨著酶聯(lián)免疫吸附法的發(fā)展與應用，能快速、簡便地測定出樣品中的黃曲霉毒素，為黃曲霉毒素的檢測提供了便捷的檢測手段，有利于大批次快速篩查出中藥飲片中的黃曲霉毒素。本文通過建立酶聯(lián)免疫吸附法，考察其在中藥飲片中黃曲霉毒素檢測的應用，并對檢測結果進行探討研究。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥飲片，珠海市場銷售。

1.2 試劑

甲醇，分析純；乙腈、正己烷、三氯甲烷，分析純；超純水；黃曲霉毒素B1殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（北京勤邦生物技術有限公司，批號：S220223A10）；黃曲霉毒素總量殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（批號：S220223A10，北京勤邦生物技術有限公司）；黃曲霉毒素B族和G族混標溶液（批號：S 095875；含量：黃曲霉毒素B199.9%；黃曲霉毒素B299.9%；黃曲霉毒素G199.7%；黃曲霉毒素G299.7%；天津阿爾塔科技有限公司）以及黃曲霉毒素B1標準溶液（批號：GBW（E） 100302；含量：100%；國家糧食和物資儲備局科學研究院）。

1.3 儀器設備

Multiskan FC型酶標儀，賽默飛；Centrifuge-V型離心機，賽默飛；XSR205電子分析天平型，梅特勒-托利多；N-EVAP24氮吹儀型，Organomation；888型洗板機，賽默飛。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品和試劑的制備

（1）中藥飲片樣品。將中藥飲片用打粉機粉碎，混勻，稱取供試品粉末約2.0 g，參照《中國藥典》2020年版四部通則2351真菌毒素測定法，黃曲霉毒素測定法第三法（酶聯(lián)免疫法）制備樣品[3]。

（2）樣品復溶工作液、酶結合物工作液及洗滌工作液。參照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書[4-5]。

（3）混合對照品溶液的制備。①黃曲霉毒素混合對照品溶液：精密量取黃曲霉毒素B族和G族混標溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2標示濃度分別為1.0 μg·mL-1、0.3 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1和0.3 μg·mL-1）1 mL，置于100 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，作為黃曲霉毒素混合對照品溶液。

（4）黃曲霉毒素B1對照品溶液的制備。精密量取黃曲霉毒素B1對照品溶液（黃曲霉毒素B1標示濃度為1.96 μg·mL-1）1 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為黃曲霉毒素B1對照品貯備溶液。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附法測定黃曲霉毒素B1含量

在96孔反應板中分別加入標準品、樣品50 μL到對應微孔中，然后加入黃曲霉毒素B1酶結合物工作液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后于25 ℃避光反應45 min。揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250 μL/孔，充分洗滌5次，每次間隔10 s，棄去洗滌液，用吸水紙拍干。每孔依次加入底物顯色A液50 μL，再依次加入底物顯色B液50 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后于25 ℃避光反應15 min。最后每孔依次加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻后，采用酶標儀測定每孔吸光度值，儀器參數(shù)為測定波長450 nm，參比波長620 nm。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附法測定黃曲霉毒素總量

在96孔反應板中分別加入標準品、樣品20 μL到對應微孔中，然后加入黃曲霉毒素總量酶結合物工作液80 μL/孔，按1.4.2操作步驟處理。黃曲霉毒素總量以黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2總量計算。

1.5 方法學驗證

1.5.1 標準曲線的繪制

將濃度為0 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.15 μg·mL-1、0.45 μg·mL-1和1.35 μg·mL-1的 黃 曲 霉 毒 素B1系 列標 準 品 溶 液，濃 度 為0 μg·mL-1、0.025 μg·mL-1、0.075 μg·mL-1、0.225 μg·mL-1和0.675 μg·mL-1的黃曲霉毒素總量系列標準品溶液，按試劑盒操作步驟處理，測定吸光度值。以標準品溶液濃度的對數(shù)值（lgC）為橫坐標，對應標準品溶液的百分吸光率為縱坐標，繪制標準曲線。

1.5.2 檢測限

實驗以酶聯(lián)免疫法分別檢測6份陰性的樣本，計算陰性樣本中黃曲霉毒素B1及黃曲霉毒素總量的含量，方法的檢出限等于陰性樣本的檢測平均值加上陰性樣本檢測濃度的3倍標準偏差。

1.5.3 精密度實驗

分別取濃度為1.35 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1標準品溶液、濃度為0.675 μg·mL-1的黃曲霉毒素總量標準品溶液，按試劑盒操作步驟處理，各平行6孔，測定吸光度值，計算其相對標準偏差。

1.5.4 回收率實驗

準確稱取薏苡仁供試品2組，每組各6份，每份樣品約2 g，置于50 mL離心管中，第一組加入黃曲霉毒素B1對照品溶液1 mL，第二組加入黃曲霉毒素混合對照品溶液1 mL，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，按試劑盒操作步驟處理，每份平行2孔，測定吸光度值并計算百分吸光率，由標準曲線回歸方程計算各成分濃度，計算回收率及其RSD值。

2 結果與分析

2.1 酶聯(lián)免疫測定中藥飲片中黃曲霉毒素B1的結果

2.1.1 線性方程

由表1可知，黃曲霉毒素B1在0～1.35 μg·mL-1，濃度的對數(shù)與其百分吸光率呈現(xiàn)良好的線性關系。

表1 黃曲霉毒素B1線性方程數(shù)據(jù)表

2.1.2 檢測限

由表2可知，黃曲霉毒素B1方法檢出限為1 μg·kg-1，方法靈敏度高。

表2 黃曲霉毒素B1檢出限測定結果表

2.1.3 精密度實驗

由表3可知，黃曲霉毒素B1試劑盒的RSD為13%，符合方法分析驗證精密度限度范圍。

表3 黃曲霉毒素B1精密度測定結果表

2.1.4 回收率實驗

由表4可知，薏苡仁黃曲霉毒素B1的加標回收率在100.8%～118.9%，符合方法分析驗證回收率限度范圍。

表4 黃曲霉毒素B1回收率測定結果表

2.1.5 樣品測定結果

根據(jù)黃曲霉毒素B1的檢出限為1 μg·kg-1，由此可得出當檢測結果低于或等于1 μg·kg-1時可判定為未檢出，當檢測結果高于1 μg·kg-1時可判定為黃曲霉毒素B1陽性。而編號為2、5、8、24、25和26的樣品，測得的結果稍高于1 μg·kg-1，按照修約規(guī)則可認為其結果為1 μg·kg-1，而且其目測顏色與其他未檢出的樣品顏色一致，可根據(jù)目測顏色的結果判定為未檢出，檢測結果見表5。

表5 中藥飲片中黃曲霉毒素B1檢測結果表

2.2 酶聯(lián)免疫測定中藥飲片中黃曲霉毒素總量的結果

2.2.1 線性方程

由表6可知，黃曲霉毒素總量在0～0.675 μg·mL-1，濃度的對數(shù)與其百分吸光率呈現(xiàn)良好的線性關系。

表6 黃曲霉毒素總量線性方程數(shù)據(jù)表

2.2.2 檢測限

由表7可知，黃曲霉毒素總量方法檢出限為0.5 μg·kg-1，方法靈敏度高。

表7 黃曲霉毒素總量檢出限測定結果表

2.2.3 精密度實驗

由表8可知，黃曲霉毒素總量試劑盒的RSD為13%，符合方法分析驗證精密度限度范圍。

表8 黃曲霉毒素總量精密度測定結果表

2.2.4 回收率實驗

由表9可知，薏苡仁黃曲霉毒素總量加標回收率在84.6%～90.5%，回收率較好，符合方法分析驗證回收率限度范圍。

表9 黃曲霉毒素總量回收率測定結果表

2.2.5 樣品測定結果

根據(jù)黃曲霉毒素總量的檢出限為0.5 μg·kg-1，由此可得出當檢測結果低于或等于0.5 μg·kg-1時可判定為未檢出，當檢測結果高于0.5 μg·kg-1時，可判定為黃曲霉毒素總量陽性，檢測結果見表10。

表10 中藥飲片中黃曲霉毒素總量檢測結果表

3 結論與討論

3.1 討論

《中華人民共和國藥品管理法》的第三條要求“藥品管理……全面提升藥品質量，保障藥品的安全、有效、可及”，國家“十四五”規(guī)劃中也提到了要“嚴格食品藥品安全監(jiān)管”，國家藥監(jiān)局藥監(jiān)綜藥注函〔2022〕87號關于《中華人民共和國藥品管理法》第一百一十七條第二款適用原則的指導意見就是充分考慮了中藥飲片的特點作出的專門規(guī)定[6]，廣東省藥監(jiān)局在2021年印發(fā)了《廣東省藥品監(jiān)督管理局中藥飲片不符合藥品標準尚不影響安全性、有效性的認定指導原則》，其中就提到了“影響中藥飲片安全性的檢驗項目有二氧化硫殘留量、重金屬及有害元素、農藥殘留量、真菌毒素……”。中藥藥材是中藥產業(yè)的原料，中藥飲片是一種處方藥。中藥飲片主要用在中醫(yī)臨床辨證論治的治療中，也是中醫(yī)用藥效果的主要保障。中藥飲片的質量和中醫(yī)的臨床療效具有密切的關系，安全質量問題甚至會影響到用藥的安全性。而中藥飲片的質量和中藥的發(fā)展不可分開，中藥的發(fā)展可弘揚中醫(yī)文化，具有高度的重要性。

為了適應監(jiān)管需求，本實驗選取了31批次共26個品種的中藥飲片作為檢測對象，其中大部分為藥食同源的中藥飲片。市面上大部分藥食同源的中藥飲片常被用作食品，其來源和質量參差不齊，雖然食品安全國家標準、《中國藥典》及行業(yè)標準等多個標準可作為藥食同源食品質量控制研究的依據(jù)，但這些標準并不完全適用于藥食同源食品的質量控制，所以其安全性更加難以保證。絕大部分被用作藥食同源中藥飲片含有大量淀粉、糖類、蛋白質等容易發(fā)生變質的成分，儲存不當很容易產生霉變，因此安全問題更加值得關注。食品中黃曲霉毒素檢測的相關規(guī)定有很多，而這部分被用作藥食同源的中藥飲片的歸屬性不在食品安全中，導致安全檢測容易被忽視，2020年版《中國藥典》項下規(guī)定要檢測黃曲霉毒素的品種僅有25種，在與眾多品種的中藥飲片相比之下，該范圍少之又少，是否會存在未規(guī)定檢測的品種檢測出被污染黃曲霉毒素，該安全性問題也值得人們深思。所以，增加檢測這類中藥飲片中的黃曲霉毒素檢測方法探索，可以為藥食同源中藥飲片進行科學、適宜、符合其使用特點的安全性評價研究提供一定的參考。

3.2 結論

在本次實驗結果中，31批次的中藥飲片，有5批次檢出黃曲霉毒素B1、6批次檢出黃曲霉毒素總量。《中國藥典》規(guī)定中藥飲片黃曲霉毒素B1的限量標準為5 μg·kg-1，黃曲霉毒素總量（以黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2總量計）的限量標準為10 μg·kg-1[3]。根據(jù)試劑盒說明書及上述結果可得，黃曲霉毒素總量的靈敏度為0.025 μg·kg-1[5]，檢 出 限 為0.5 μg·kg-1；黃 曲 霉 毒 素B1的 靈 敏 度 為0.05 μg·kg-1[4]，檢出限為1 μg·kg-1。故當檢測結果超出檢出限時，可認為其黃曲霉毒素檢出陽性。酶聯(lián)免疫測定法是通過測定其吸光值計算出黃曲霉毒素的含量，由于中藥飲片中含有多種復雜的成分，致使其提取液中含有各種雜質和色素，部分雜質和色素能與抗原抗體結合，且在特定的波長下存在一定的吸收，還有其他各種不確定因素的影響，有可能出現(xiàn)假陽性的檢測結果。雖然酶聯(lián)免疫測定法用于快速篩查能定量檢測出黃曲霉毒素含量，其結果具有一定的不準確性，結果確證仍需要通過液相色譜-串聯(lián)質譜法進行確認。