不同方法脫蝦殼蛋白的效果研究

隨著我國(guó)水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展，水產(chǎn)品加工廢棄物激增。然而這些廢棄物中往往含有可利用的高價(jià)值物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、ω-3不飽和脂肪酸、甲殼素、蝦青素和其他生物活性物質(zhì)等[1]。其中甲殼素是迄今為止僅次于纖維素的第二大可再生天然聚合物，每年的生物合成量約為100億t[2]。甲殼素資源豐富并具有許多特殊的生物理化性質(zhì)，被認(rèn)為是可替代石油的生物燃料和其他功能性化合物的生物質(zhì)來(lái)源[3]。作為21世紀(jì)環(huán)境友好型的新型生物高分子材料，甲殼素及其衍生物在醫(yī)學(xué)、制藥、化妝品、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、生物等相關(guān)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域都展現(xiàn)出了巨大的潛力，具有廣闊的應(yīng)用前景和較高的商業(yè)價(jià)值。

我國(guó)主要從蝦、蟹的甲殼中提取甲殼素及殼聚糖[4-6]。目前提取甲殼素、殼聚糖的方法主要有傳統(tǒng)酸堿法、物理法、酶法、化學(xué)改良法、發(fā)酵法、微生物合成法等[7-9]。制取過(guò)程主要為脫鈣及脫蛋白，為了解各方法在脫蛋白方面的效果及對(duì)比各方法的脫除效果，最終選擇以單一酶解及復(fù)合酶解為研究對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蝦殼，廣東省湛江市北橋菜市場(chǎng)；冰乙酸（AR）、無(wú)水乙醇（AR），廣東化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心；酸性蛋白酶、中性蛋白酶，夏盛公司；堿性蛋白酶，諾維信中國(guó)銷售代理廣州明曜公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子分析天平FA2104N，上海蒲春計(jì)量?jī)x器股份有限公司；紫外分光光度計(jì)TU-1810DASPC，廣州市紅圖儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州榮華儀器制造有限公司；pHS-3C酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱DHG-9035A，上海一恒鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蝦粗甲殼素蛋白質(zhì)含量測(cè)定

稱取干燥后樣品0.2 g，分別用20 mL 4%NaOH浸泡樣品，將這3份樣品于90 ℃水浴鍋中水浴3 h，冷卻過(guò)濾，分別收集好濾渣和濾液，濾液于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。將上述定容的濾液用移液槍移取1 mL于試管中，然后加入2 mL蒸餾水（稀釋3倍），混勻，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定280 nm和260 nm處的吸光度，另用20 mL 4%的NaOH溶液加蒸餾水定容至50 mL容量瓶中，做空白對(duì)照。蛋白質(zhì)含量（mg·mL-1）計(jì)算公式為蛋白質(zhì)含量=1.31A280-0.57A260。

1.3.2 水打醇洗粗蝦甲殼素制備

新鮮蝦下腳料加蒸餾水，于豆?jié){機(jī)高速打漿2 min，然后用篩網(wǎng)過(guò)濾，濾渣中加入食用乙醇，于豆?jié){機(jī)再打0.5 min，然后用篩網(wǎng)過(guò)濾收集濾渣，水洗4次，備用。

1.3.3 單一酶解

（1）酸性蛋白酶酶解后再堿提。樣品加水（料液比1∶10），調(diào)pH值為5.0，加入酸性蛋白酶（按底物0.1%計(jì)），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，90 ℃滅酶10 min，冷卻過(guò)濾，分別收集好濾渣和濾液，過(guò)濾時(shí)用少許蒸餾水多次沖洗燒杯殘?jiān)?，濾液于100 mL容量瓶中定容，用蒸餾水定容至刻度，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定280 nm和260 nm處的吸光度，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。同時(shí)烘干濾渣，測(cè)定蛋白質(zhì)殘留量。

（2）堿提后再用堿性蛋白酶酶解。樣品約5 g，分別加入50 mL 0.1%NaOH溶液（pH=13.17）和0.05%NaOH溶液（pH=12.65）浸泡，于90 ℃水浴鍋中水浴3 h。冷卻過(guò)濾，分別收集好殘?jiān)蜑V液，過(guò)濾時(shí)用少許蒸餾水多次沖洗燒杯殘?jiān)?，濾液于100 mL容量瓶中定容，用蒸餾水定容至刻度，待測(cè)。將過(guò)濾好的濾渣，加入25 mL蒸餾水和2.5 μL的諾維信堿性蛋白酶（按底物0.1%計(jì)），測(cè)定其pH值為8.0，于50 ℃水浴鍋中水浴3 h，90 ℃滅酶10 min，同時(shí)測(cè)定濾液蛋白質(zhì)含量和濾渣蛋白質(zhì)殘留量。

（3）復(fù)合酶解。①樣品約5 g，按料液比1∶10加水，調(diào)pH值為5.0，加入酸性蛋白酶（按底物0.1%計(jì)），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，調(diào)pH值為7.0，加入中性蛋白酶（按底物0.1%計(jì)），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，測(cè)定濾液和濾渣蛋白質(zhì)含量。②樣品約5 g，按料液比1∶10加水，調(diào)pH值為5.0，加入酸性蛋白酶（按底物0.1%計(jì)），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，調(diào)pH值為8.0，加入堿性蛋白酶（按底物0.1%計(jì)），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，測(cè)定濾液和濾渣蛋白質(zhì)含量。③樣品約5 g，按料液比1∶10加水，調(diào)pH值為7.0，加入中性蛋白酶（按底物0.1%計(jì)），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，調(diào)pH值為8.0，加入堿性蛋白酶（按底物0.1%計(jì)），50 ℃水浴鍋中水浴3 h，測(cè)定濾液和濾渣蛋白質(zhì)含量。

（4）復(fù)合酶解后再堿提取。樣品復(fù)合酶解后烘干0.2 g，加入4 mL 0.1%氫氧化鈉于90 ℃水浴3 h，分別測(cè)定濾液和濾渣蛋白質(zhì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel 2007整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦粗甲殼素蛋白質(zhì)含量測(cè)定

由圖1可知，蝦下腳料的蛋白含量高于處理完畢的水打醇洗樣品，而0.1%NaOH提取液中蛋白質(zhì)含量為20.23%，0.05%NaOH提取液中蛋白質(zhì)含量為18.1%。由以上數(shù)據(jù)可知在堿提過(guò)程中0.1%NaOH的提取效果比0.5%NaOH的提取效果好。

圖1 不同濃度的NaOH提取蛋白質(zhì)效果對(duì)比圖

2.2 單一酶解

由圖2、圖3、圖4可知，水打醇洗蝦殼樣品經(jīng)酸性蛋白酶酶解再堿提后殘余的蛋白質(zhì)含量分別為2.68%（0.1%NaOH）、3.59%（0.05%NaOH）。堿 提后再堿性蛋白酶酶解殘余的蛋白質(zhì)含量分別為2.55%（0.1%NaOH）、3.44%（0.05%NaOH）。由此可知，在單一酶解過(guò)程中堿提加堿性蛋白酶酶解的提取效果優(yōu)于酸性蛋白酶加堿提，且用0.1%的NaOH提取優(yōu)于使用0.05%的NaOH提取。

圖2 蛋白酶酶解后酶解液中蛋白質(zhì)含量比較圖

圖3 堿提液中蛋白質(zhì)含量對(duì)比圖

圖4 蝦殼中殘留蛋白質(zhì)含量對(duì)比圖

2.3 復(fù)合酶解

由圖5、圖6、圖7可知，在復(fù)合酶解的過(guò)程中初次酶解中性蛋白酶酶解液中蛋白質(zhì)含量最高為28.57%，第二次酶解中堿性蛋白酶酶解液中蛋白含量最高為24.89%。烘干后殘留蛋白質(zhì)含量分別為11.51%、5.60%、5.57%。由此可知，復(fù)合酶解時(shí)由酸性-中性提取效果最差，酸性-堿性，中性-堿性效果差異不大，中性-堿性略優(yōu)于酸性-堿性。

圖5 復(fù)合酶解第一次酶解蛋白含量對(duì)比圖

圖6 復(fù)合酶解第二次酶解液蛋白質(zhì)含量對(duì)比圖

圖7 烘干后粗甲殼素殘留蛋白質(zhì)含量對(duì)比圖

2.4 復(fù)合酶解后干燥樣品再堿提取蛋白質(zhì)

由圖8、圖9可知，復(fù)合酶解后再用低濃度的堿液提取過(guò)程中，酸性-中性提取量最高為10.07%，酸性-堿性最低為4.6%。而濾渣中殘留蛋白質(zhì)含量也是酸性-堿性最低為3.61%。結(jié)合復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，復(fù)合酶解中酸性-堿性的提取效果最好，酸性-中性提取效果最差。

圖8 0.1%堿提取液中蛋白質(zhì)含量對(duì)比圖

圖9 甲殼素中蛋白質(zhì)含量對(duì)比圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要研究不同方法脫蝦殼蛋白質(zhì)的效果，其中包括酸性蛋白酶酶解后再堿提，堿提后再用堿性蛋白酶酶解以及采用復(fù)合酶包括酸性蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶。通過(guò)對(duì)比不同方法處理后烘干樣品中蛋白質(zhì)的含量即可得出脫蛋白效果最好的方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，復(fù)合酶解提取效果略低于單一酶解再堿提的效果，而復(fù)合酶解后再使用低濃度的堿液進(jìn)行提取可使殘留蛋白質(zhì)達(dá)到較好的效果。堿提后再用堿性蛋白酶酶解，殘留蛋白質(zhì)含量最低，即該方法脫蛋白效果最好。