黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠心室重構(gòu)和NOX/ROS/TNF-α信號(hào)通路的影響

趙佩，鄒青，李澤霖

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安710038

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由于冠狀動(dòng)脈供血突然嚴(yán)重減少或中斷，使心肌嚴(yán)重急性缺血進(jìn)而產(chǎn)生缺血性壞死的心血管系統(tǒng)疾病。近年來(lái)，雖然全球AMI死亡率和發(fā)病率持續(xù)下降，但后續(xù)死亡率較一般人群高30%［1］，表明AMI對(duì)人類(lèi)生命安全仍具有較大威脅。患者在AMI后心室形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化稱(chēng)為心室重構(gòu)，表現(xiàn)為心肌梗死區(qū)域變薄，而非梗死區(qū)域心肌肥厚，使心室腔逐漸擴(kuò)大，是導(dǎo)致心力衰竭的主要原因［2］，因此延遲或防止心室重構(gòu)是預(yù)防心力衰竭的關(guān)鍵。有研究者認(rèn)為，中成藥在改善AMI心室重構(gòu)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)［3-4］。黃芪甲甙主要來(lái)源于中藥黃芪生物皂苷的提取物，具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括抗腫瘤、抗炎、抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等［5-8］。王皓等［9］發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可通過(guò)激活一氧化氮合酶信號(hào)通路，抑制炎性因子生成，對(duì)AMI模型大鼠具有保護(hù)作用，也有研究表明，黃芪甲甙可抑制心室重構(gòu)，改善心功能，降低慢性心力衰竭大鼠游離脂肪酸水平［10］。然而黃芪甲甙對(duì)AMI后心室重構(gòu)的潛在機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，因此本研究通過(guò)建立AMI大鼠模型進(jìn)行黃芪甲甙處理并進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，以期為AMI的治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠36只，SPF級(jí)，6～7周齡，體質(zhì)量226～250 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。

1.2 試劑

黃芪甲甙（純度≥98%）購(gòu)于北京索萊寶公司；阿司匹林腸溶片（國(guó)藥準(zhǔn)字H20065051）購(gòu)于沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)有限公司；血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）、內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）大鼠酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；Trizol購(gòu)于默克公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)于大連寶日生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及藥物干預(yù) 造模前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、黃芪甲甙低劑量組、黃芪甲甙中劑量組、黃芪甲甙高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組共6組，每組6只。除假手術(shù)組大鼠外，其他5組大鼠按榮霞等［11］的方法建立急性心肌梗死大鼠模型，用10%水合氯醛麻醉大鼠，連接683呼吸機(jī)和SurgiVet V3404+心電圖機(jī)（中國(guó)香港友誠(chéng)生物科技有限公司），結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，待左心室部分心肌變白且收縮逐漸減弱后，將心臟放回胸腔并排出胸腔氣體后縫合，心電圖出現(xiàn)Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高表示造模成功，假手術(shù)組大鼠開(kāi)胸后僅分離冠狀動(dòng)脈左前降支，不做結(jié)扎處理；之后逐層縫合。造模后第2天開(kāi)始藥物干預(yù)：黃芪甲甙低劑量組給予20 mg·kg-1黃芪甲甙灌胃處理；黃芪甲甙中劑量組給予40 mg·kg-1黃芪甲甙灌胃處理；黃芪甲甙高劑量組給予60 mg·kg-1黃芪甲甙灌胃處理；陽(yáng)性對(duì)照組給予100 mg·kg-1阿司匹林灌胃處理［12］；假手術(shù)組和模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃處理，各組大鼠均持續(xù)干預(yù)4周。末次干預(yù)1 h后，各組大鼠均進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，再取腹主動(dòng)脈血5 mL，L535-1離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）3 000 r·min-1離心15 min，收集血清，處死大鼠后取心臟，0.9%氯化鈉溶液清洗表面，取部分樣本制備單細(xì)胞懸液用于活性氧檢測(cè)，另一部分樣本液氮速凍，血清和心臟均保存于-80℃冰箱。

1.2.2 大鼠心功能檢測(cè) 比較治療第0、2、4周各組大鼠心功能變化，采用大小鼠超聲影像系統(tǒng)（玉研儀器，Sigma Vet）檢測(cè)心功能指標(biāo)，包括左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)后，迅速處死大鼠，開(kāi)胸摘取心臟計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）。

1.2.3 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠在進(jìn)行末次超聲心動(dòng)圖檢測(cè)后，左心室連接壓力傳感器，并用心臟血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司，型號(hào)：BL-420N）檢測(cè)血流動(dòng)力參數(shù)左心室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）和左室內(nèi)壓最大上升/下降速率（±dp/dtmax）。

1.2.4 大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平，將稀釋抗體添加至96孔板中，再加入稀釋后的血清樣品，37℃孵育1 h，加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育1 h，洗板，加入3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）底物溶液，37℃孵育30 min后終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀上以450 nm波長(zhǎng)讀取OD值。

1.2.5 檢測(cè)心肌組織活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量 采用酶消化法制備大鼠心肌單細(xì)胞懸液（1×106個(gè)·mL-1），用稀釋后的熒光染料重懸細(xì)胞沉淀，37℃孵育1 h后，離心收集細(xì)胞沉淀，磷酸緩沖液（phosphoric acid buffer，PBS清洗并重懸，采用930F熒光分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為502 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。

1.2.6 檢測(cè)心肌組織NADPH氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）mRNA相對(duì)表達(dá)量 采用Trizol法提取大鼠心肌組織總核糖核酸，并用紫外分光光度計(jì)確定濃度和純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸，并按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配置PCR反應(yīng)體系，在PCR儀（Biorad，型號(hào)：CFX96）上進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序：95℃1 min；95℃5 s，60℃30 s，循環(huán)40次；72℃延伸1 min。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算NOX和TNFα mRNA的相對(duì)表達(dá)量，所有操作均在超凈臺(tái)上進(jìn)行，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 檢測(cè)心肌組織NOX和TNF-α蛋白表達(dá)水平將大鼠心肌組織充分勻漿、冰上裂解后提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。采用Western blot檢測(cè)心肌組織NOX和TNF-α蛋白表達(dá)水平，配置電泳凝膠，電泳至藍(lán)色染料標(biāo)記到達(dá)凝膠末端，采用聚偏氟乙烯膜進(jìn)行電轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶中封閉1.5 h，緩沖液洗膜15 min，4℃孵育一抗過(guò)夜，緩沖液洗膜15 min，室溫孵育二抗2 h，緩沖液洗膜15 min，顯色后在凝膠成像系統(tǒng)中拍攝照片，并采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，柱狀圖制作采用Graphpad Prism 6.0軟件，計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠心功能指標(biāo)的影響

由表2可知，隨著治療時(shí)間的增加，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組LVEF、LVFS水平呈逐漸升高的趨勢(shì)（P＜0.05），但假手術(shù)組、模型組和黃芪甲苷低劑量組LVEF、LVFS水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療第0、2、4周，與假手術(shù)組比較，模型組LVEF、LVFS水平均顯著降低（P＜0.05）。治療第0周，與模型組比較，黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組LVEF、LVFS水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療第2周，黃芪甲苷高劑量組LVEF、LVFS水平均顯著升高（P＜0.05），黃芪甲苷低劑量組、中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組LVEF、LVFS水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療第4周，與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組LVEF、LVFS水平均顯著升高（P＜0.05），黃芪甲苷中低劑量組LVEF、LVFS水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療第4周，與假手術(shù)組比較，模型組LVMI水平顯著升高（P＜0.05）；治療第4周，與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組LVMI水平均顯著降低（P＜0.05），但與黃芪甲苷低劑量組LVMI水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，黃芪甲苷能改善AMI大鼠心臟射血功能和收縮功能，減輕左心室肥厚，改善心室重構(gòu)，且高劑量改善效果最優(yōu)。

表2 黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠心功能指標(biāo)影響（±s）Table 2 Effects of AstragalosideⅣon cardiac function indicators in rats with acute myocardial infarction(±s)

表2 黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠心功能指標(biāo)影響（±s）Table 2 Effects of AstragalosideⅣon cardiac function indicators in rats with acute myocardial infarction(±s)

注：LVEF—左心室射血分?jǐn)?shù)；LVFS—左心室短軸縮短率；LVMI—左心室質(zhì)量指數(shù)?！硎镜?周與同組治療第0周比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；△表示第4周與同組治療第2周比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*表示與相同治療時(shí)間假手術(shù)組比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；#表示與相同治療時(shí)間模型組比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別（n=6）假手術(shù)組模型組黃芪甲苷低劑量組黃芪甲苷中劑量組黃芪甲苷高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組治療時(shí)間/周0 2 4 0 2 4 0 2 4 0 2 4 0 2 4 0 2 4 LVEF/%83.48±3.22 81.54±2.41 82.96±2.21 68.52±1.48*69.85±1.29*70.17±1.30*68.73±1.32*69.81±1.14 70.68±1.65 68.48±1.40 71.65±2.13※75.42±1.79△#69.01±1.59*73.16±1.63※#79.74±1.68△#68.54±1.46 71.58±2.12※75.84±1.48△#LVFS/%35.15±4.41 34.68±3.47 35.02±3.42 23.82±3.29*23.77±3.75*23.67±2.52*23.07±2.12 26.79±2.58 27.63±2.26 23.85±2.97 30.14±3.28※#34.31±2.59△#23.94±4.13 29.55±3.51※#36.08±2.98△#23.28±2.47 29.39±2.62※#33.72±1.43△#LVMI/（g·m-2）— —92.37±6.78— —174.92±9.37*— —168.44±10.82— —108.42±9.64#— —99.28±8.21#— —112.69±9.26#

2.2 黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響

由圖1可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVSP、±dp/dt均顯著降低（P＜0.05），LVEDP顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組LVSP、±dp/dt均顯著升高（P＜0.05），LVEDP顯著降低（P＜0.05），但與黃芪甲苷低劑量組LVSP、LVEDP、±dp/dt差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，黃芪甲苷可增強(qiáng)AMI大鼠心室的收縮和舒張功能，改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，中、高劑量均有較好的療效。

圖1 黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of AstragalosideⅣon hemodynamic indicators in rats with acute myocardial infarction

2.3 黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平的影響

由圖2可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清AngII、ET-1、BNP均升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組血清AngII、ET-1、BNP均降低（P＜0.05），黃芪甲苷低劑量組變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果說(shuō)明，黃芪甲苷可通過(guò)降低血清AngII、ET-1和BNP水平，促進(jìn)血管收縮，進(jìn)而增加回心血量，減少心室負(fù)荷，抑制AMI后代償性心室重構(gòu)，高劑量效果最優(yōu)。

圖2 黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平的影響Fig.2 Effects of AstragalosideⅣon levels of serum AngⅡ,ET-1 and BNP in rats with acute myocardial infarction

2.4 黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌組織ROS含量的影響

由圖3可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織ROS含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組心肌組織ROS含量顯著降低（P＜0.05），但與黃芪甲苷低劑量組的ROS含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果說(shuō)明，中、高劑量的黃芪甲苷能降低AMI大鼠心肌組織ROS含量，從而減少因ROS過(guò)多引起的氧化應(yīng)激及其對(duì)下游靶標(biāo)的損傷。

圖3 黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌組織ROS含量的影響Fig.3 Effects of AstragalosideⅣon ROS content in myocardial tissue of rats with acute myocardial infarction

2.5 黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌組織NOX、TNF-α表達(dá)的影響

由圖4可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織NOX、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組心肌組織NOX、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05），但與黃芪甲苷低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明黃芪甲苷可抑制AMI大鼠心肌NOX、TNF-α表達(dá)。

圖4 黃芪甲甙對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌組織NOX、TNF-α基因和蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effects of AstragalosideⅣon gene and protein expression levels of NOX and TNF-α in myocardial tissue of rats with acute myocardial infarction

3 討論

AMI臨床表現(xiàn)為心前區(qū)或胸骨后的壓榨性疼痛，可伴有惡心、嘔吐、呼吸困難等癥狀［13］，嚴(yán)重影響患者的生存期和生活質(zhì)量。心室重構(gòu)是AMI重要病理特征，包括心室壁增厚、心室擴(kuò)張和膠原纖維增生，導(dǎo)致心功能障礙、耗氧量增加，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)l(fā)心源性死亡［14］。因此抑制心室重構(gòu)是治療AMI的關(guān)鍵步驟。目前對(duì)AMI引起的心室重構(gòu)作用機(jī)制尚不明確，通過(guò)建立AMI模型大鼠對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究具有重要的臨床意義。

黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、生津養(yǎng)血、行滯通痹等作用［15］；同時(shí)黃芪制劑對(duì)心臟有保護(hù)作用，包括促進(jìn)心臟微血管形成、改善心肌細(xì)胞肥大、抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥損傷、減輕氧化應(yīng)激、改善能量代謝紊亂等［16］，黃芪甲甙作為黃芪的重要活性成分也具有相似的作用［17］。本研究結(jié)果表明，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組AMI大鼠心功能指標(biāo)LVEF、LVFS隨治療時(shí)間的增加不斷改善，且改善程度均優(yōu)于模型組，同時(shí)LVMI和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVSP、LVEDP、±dp/dt均有顯著改善，表明黃芪甲甙可改善AMI大鼠心室收縮功能和左心室肥厚狀態(tài)，抑制AMI后心室重構(gòu)，可能與黃芪甲苷抑制炎癥反應(yīng)和改善心肌細(xì)胞肥大的作用相關(guān)。

AngⅡ、ET-1、BNP水平與心室重構(gòu)密切相關(guān)。AngII可加重心臟纖維化，誘導(dǎo)心室重構(gòu)，同時(shí)伴隨氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)［18］。ET-1是心血管最主要的血管收縮劑，參與內(nèi)皮功能障礙和炎癥的發(fā)生發(fā)展，以及血管重塑過(guò)程，心肌組織中ET水平上調(diào)會(huì)導(dǎo)致心肌纖維化以及心室收縮和舒張功能障礙，且內(nèi)皮素拮抗劑可改善心肌纖維化和心室重構(gòu)［19-20］。研究表明，連續(xù)3個(gè)月BNP水平下降率是左心室重構(gòu)的重要獨(dú)立預(yù)測(cè)因子［21］。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)中、高劑量黃芪甲甙干預(yù)后，AMI大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平均降低，佐證了黃芪甲甙對(duì)AMI后心室重構(gòu)的抑制作用。

NOX是ROS的主要來(lái)源之一，Zhang等［22］發(fā)現(xiàn)AngⅡ可以激活NOX，增加其蛋白質(zhì)表達(dá)和催化活性，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。ROS通過(guò)多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞損傷，包括促炎信號(hào)通路的激活、抗氧化劑和信號(hào)分子的消耗以及大分子的氧化［23］。TNF-α可能是心臟損傷、炎癥和細(xì)胞凋亡發(fā)病機(jī)制中的重要細(xì)胞因子，通過(guò)激活TNF受體介導(dǎo)的多種信號(hào)分子誘導(dǎo)多種炎癥基因表達(dá)［24］。研究表明，腦心通膠囊可通過(guò)肝X受體α抑制NOX/ROS/TNF-α信號(hào)傳導(dǎo)通路改善AMI后心室重構(gòu)［25］，與本研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明黃芪甲苷對(duì)AMI的治療作用可能與調(diào)控NOX/ROS/TNF-α信號(hào)通路相關(guān)。

綜上所述，黃芪甲甙對(duì)AMI大鼠心功能及血流動(dòng)力學(xué)有明顯改善效果，且可降低其血清AngⅡ、ET-1、BNP水平，抑制心室重構(gòu)，可能與下調(diào)NOX/ROS/TNF-α信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)，但具體作用機(jī)制還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。