玉米中ClassⅠ和ClassⅡNAS蛋白之間的BiFC互作研究

肖克，周曉今，陳茹梅，逄森*

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，北京100193；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

礦質(zhì)元素作為植物營養(yǎng)成分雖然所需量不多，但對(duì)植物的生長和發(fā)育必不可少。在多種植物必需礦質(zhì)元素中，需求量較大的鐵元素在光合作用、呼吸作用和葉綠素生物合成等反應(yīng)中起重要生理作用，也是鐵結(jié)合蛋白的重要輔助因子［1］。雖然土壤中并不缺鐵，但是鐵易被氧化，所以其在土壤中的溶解度較低，難以被植物吸收和利用［2］。因此植物進(jìn)化出兩種方式進(jìn)行鐵吸收。機(jī)制Ⅰ主要存在于非禾本科植物中：酸化土壤中的鐵元素由鐵還原酶（ferric-chelation reductase-oxidase，F(xiàn)RO）將Fe3+還原為Fe2+，再經(jīng)鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（iron-regulated transporter，IRT）吸收進(jìn)入植物體內(nèi)［3］。禾本科植物主要利用機(jī)制Ⅱ吸收鐵元素：依靠麥根酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MAs efflux transporter 1，TOM1）將麥根酸（mugineic acid，MA）分泌至土壤中用以螯合鐵元素，形成的Fe3+-MA螯合物被黃色條紋/黃色條紋樣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（yellow stripe/yellow stripe like，YS/YSL）運(yùn)輸至根細(xì)胞內(nèi)［4-6］。

鐵元素在植物體內(nèi)的運(yùn)輸需要螯合物輔助［7］。煙草胺（nicotianamine，NA）是一種內(nèi)源性金屬螯合劑，其具有促進(jìn)金屬離子在韌皮部和木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)的作用［8-9］。NA可防止鐵的沉降，并在鐵運(yùn)輸?shù)礁鱾€(gè)器官的過程中起到至關(guān)重要的作用［10］，同時(shí)NA通過螯合作用可以有效阻礙游離的Fe2+與過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生大量的羥基自由基，最大限度地減少鐵的毒性［11］。同時(shí)，NA也是合成MA的前體物質(zhì)［12］。此外，NA能夠有效地逆轉(zhuǎn)抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響，是人和其他動(dòng)物對(duì)食物中鐵吸收的最佳促進(jìn)劑之一［13-14］，NA還可以有效地介導(dǎo)哺乳動(dòng)物小腸對(duì)于鐵元素的攝?。?5］。因此，NA和Fe2+-NA對(duì)植物中鐵營養(yǎng)的吸收利用具有重要作用。

NA是最早在煙草中發(fā)現(xiàn)的一種非蛋白氨基酸［16］，其合成首先由L-甲硫氨酸與ATP形成腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM），隨后三分子SAM在煙草胺合成酶（nicotianamine synthase，NAS）催化作用下合成為NA［17］。NAS基因最早在大麥中被發(fā)現(xiàn)，其廣泛分布于高等植物中，且在禾本科植物中以多基因家族形式存在［18］。水稻、大麥和小麥基因組中分別鑒定到了3、9、21個(gè)NAS家 族 成員［18-20］，玉 米 中 發(fā) 現(xiàn)9個(gè)基 因 編 碼NAS。此外，禾本科植物的NAS在進(jìn)化上可分化為兩個(gè)亞家族——ClassⅠ和ClassⅡ。已有研究推測(cè)兩個(gè)亞家族NAS分別調(diào)節(jié)Fe的吸收和運(yùn)輸，但具體生理功能尚不清楚［21-23］。NAS蛋白的活性可直接影響植物體內(nèi)NA的合成，從而影響植物對(duì)鐵的攝取和體內(nèi)分布［24］。NAS基因已被認(rèn)為是提升作物微量營養(yǎng)素含量的重要靶點(diǎn)［9，25］。因此，進(jìn)一步了解NAS的調(diào)控機(jī)理對(duì)于植物鐵營養(yǎng)強(qiáng)化具有重要價(jià)值。

通過NAS家族成員的蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ClassⅡZmNAS具有特異的N端可變結(jié)構(gòu)域，但已有研究顯示，該N端可變結(jié)構(gòu)域并不參與調(diào)節(jié)ZmNAS的亞細(xì)胞內(nèi)定位［23］。因此探究ClassⅡ成員N端可變結(jié)構(gòu)域的功能具有重要的研究意義。目前尚未有關(guān)于NAS蛋白互作的報(bào)道，本研究聚焦于N端可變結(jié)構(gòu)域是否對(duì)蛋白互作產(chǎn)生影響，通過玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和BiFC技術(shù)研究兩個(gè)亞家族（ClassⅠ和ClassⅡ）成員間的相互作用，以期為闡明禾本科作物玉米NAS家族蛋白功能提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 玉米B73自交系種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供；玉米種子經(jīng)過表面消毒，于28℃溫室，在蛭石中萌發(fā)4 d，再將幼苗置于28℃黑暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并于三葉期分離葉片原生質(zhì)體。

1.1.2 試驗(yàn)試劑RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈的合成試劑盒、B載體試劑盒和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購于北京全式金生物公司；KOD高保真酶購于東洋紡公司；瓊脂糖膠DNA回收試劑盒購于上海博彩生物科技有限公司；大提質(zhì)粒試劑盒購于Promega公司。

轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)所需的試劑：①W5緩沖液：0.2 mol·L-1MES 2.0 mL，2.0 mol·L-1NaCl 15.4 mL，2.0 mol·L-1KCl 0.5 mL，1.0 mol·L-1CaCl225.0 mL，加ddH2O定容到200.0 mL。②MMg緩沖液：0.2 mol·L-1MES 2.0 mL，2.0 mo·lL-1MgCl20.75 mL，0.8 mol·L-1甘 露 醇50 mL，加ddH2O定 容 至100.0 mL。③酶解液：稱取1.46 g甘露醇，0.3 g纖維素酶R10和0.08 g離析酶R10，加0.2 mol·L-1MES 2.0 mL和2 mol·L-1KCl 0.2 mL，用ddH2O定容至20.0 mL，并調(diào)節(jié)pH至5.7。在55℃水浴中孵育10 min，然后冷卻至室溫。加入0.2 mL 1 mol·L-1CaCl2，20 mg的BSA，再用0.45 μm的濾器過濾后使用。

1.1.3 配制LB培養(yǎng)基 稱取10.0 g氯化鈉、10.0 g胰蛋白胨和5.0 g酵母提取物，若配制固體培養(yǎng)基需另外加入15.0 g瓊脂粉，隨后加蒸餾水溶解并定容至1.0 L，配制好后，高溫高壓滅菌（121℃，15 min），然后加入Amp/Kan抗生素（每100 mL培養(yǎng)基加入100 μL）。

1.1.4 載 體pRTL2-GFP、pRTL2-YFPN（pYFPN）和pRTL2-YFP（CpYFPC）載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。引物合成及測(cè)序工作由北京博邁德生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 根據(jù)已知的ZmNAS基因，并通過MaizeGDB（www.maizegdb.org）中找出ZmNAS1；1（GRMZM2G385200）、ZmNAS1；2（GRMZM 2G312481）、ZmNAS2；1（GRMZM2G030036）、Zm-NAS2；2（GRMZM2G124785）、ZmNAS3（GRMZM2G 478568）、ZmNAS4（GRMZM2G439195）、ZmNAS5（GRMZM2G050108）、ZmNAS6；1（GRMZM2G7044 88）、ZmNAS6；2（AC233955.1_FGT003）基因的全長CDS序列，利用DNAMAN7.0軟件進(jìn)行翻譯及進(jìn)行NAS家族各成員蛋白結(jié)構(gòu)域比對(duì)；通過SWISS-MODEL對(duì)NAS家族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2ZmNAS家族代表基因克隆 以三葉期玉米B73野生型植株為材料，進(jìn)行液氮速凍研磨，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，通過電泳和吸光度檢測(cè)RNA的濃度，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA合成反應(yīng)程序：42℃孵育30 min，85℃加熱5 s，降溫至4℃后取出，置于-20℃保存。以cDNA為模板，通過ZmNAS1、ZmNAS3和ZmNAS3?N基因的特異上游引物和下游引物（表1），擴(kuò)增得到目的基因的開放閱讀框序列。應(yīng)用電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增序列，切取含目的片段的瓊脂糖，利用DNA回收試劑盒回收開放閱讀框序列，并以其為模板，應(yīng)用表1中同源重組末端的引物PCR擴(kuò)增得到目的片段?；厥漳康臈l帶與B載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布在含有氨芐青霉素抗性（ampicillin resistance，Amp）的平板中，在合適的條件下培養(yǎng)，挑單克隆搖菌，PCR驗(yàn)證后，送往北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序［26］。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers used in PCR

1.2.3 BiFC載體的構(gòu)建 應(yīng)用XhoⅠ和XbaⅠ酶切pYFPN和pYFPC載體，電泳驗(yàn)證后并回收骨架載體片段，利用Infusion方式將載體骨架與含有同源重組末端的DNA序列重組連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，之后加入LB培養(yǎng)基（無抗）中，活化菌液，涂在LB培養(yǎng)基（Amp抗性）中，適宜條件下培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆培養(yǎng)，隨后酶切并測(cè)序驗(yàn)證。將構(gòu)建成功的pZmNAS1-YFPN、pZmNAS1-YFPC、pZmNAS3-YFPN、pZmNAS3-YFPC、pZmNAS3?N-YFPN和pZmNAS3?N-YFPC載體（圖1）質(zhì)粒濃度定容至1 000～1 200 ng·μL-1［27］。

圖1 載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Diagram of vector construction

1.2.4 玉米原生質(zhì)的制備將玉米黃化苗V3期的第二片真葉中部5～7 cm切成0.5～1.0 mm的細(xì)絲，放入酶解液中，抽真空30 min，置于黑暗條件下28℃搖床（30 r·min-1）中酶解反應(yīng)4 h以上，將酶解產(chǎn)物過濾（350目）至50 mL離心管中，加入W5緩沖液（等體積），輕柔混勻，低溫離心（300 r·min-1）2 min，棄上清，再加入3 mL W5緩沖液（4℃）輕柔混勻后，靜置于冰上30 min，棄上清，后加入MMg緩沖液重懸細(xì)胞，鏡檢觀察細(xì)胞狀態(tài)，置于冰上待用［27］。

1.2.5 玉米原生質(zhì)的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒分別組合加入2 mL的離心管中，加入10倍體積的剛制好的原生質(zhì)體，輕柔混勻；加入等體積的40% PEG-Ca2+溶液（現(xiàn)配制）繼續(xù)輕柔混勻，孵育30 min；加入2倍體積的W5緩沖液輕柔混勻，離心（300 r·min-1）2 min，棄上清；加入1 mL的W5緩沖液，黑暗孵育12～16 h［27］。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmNAS蛋白結(jié)構(gòu)分析

ZmNAS家 族 可 被 分 為ClassⅠ（NAS1-1、NAS1-2、NAS2-1、NAS2-2、NAS6-1和NAS6-2）和ClassⅡ（NAS3、NAS4和NAS5），如圖2所示，Zm-NAS家族蛋白序列之間同源性較高，其中ClassⅡ的ZmNAS包含1個(gè)特有的N端可變結(jié)構(gòu)域。因此，本研究篩選出可以代表ClassⅠ的ZmNAS1和ClassⅡ的ZmNAS3，探究ZmNAS家族ClassⅠ和ClassⅡ蛋白結(jié)構(gòu)的區(qū)別，以及ClassⅡZmNAS具有特異的N端結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍捉Y(jié)構(gòu)的影響。利用Swiss-Model對(duì)ZmNAS1、ZmNAS3和ZmNAS3?N（刪除ZmNAS3特有的N端可變結(jié)構(gòu)域）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了建模預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們的結(jié)構(gòu)高度相似。此外，根據(jù)其相互包裹形成類似底物催化口袋的空間結(jié)構(gòu)（圖3），推測(cè)其可能通過形成二聚體的結(jié)構(gòu)發(fā)揮酶活性的作用。

圖2 玉米NAS家族成員的蛋白序列比對(duì)Fig.2 Alignment of protein sequences of ZmNAS family members

圖3 ZmNAS蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.3 ZmNAS protein structure analysis

2.2 ZmNAS家族代表基因克隆

依據(jù)MaizeGDB玉米基因組數(shù)據(jù)庫中的Zm-NAS1和ZmNAS3基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長CDS和ZmNAS3?N的引物。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增條帶，結(jié)果如圖4所示，電泳ZmNAS1、ZmNAS3和ZmNAS3?N基因條帶的大小與預(yù)測(cè)的開放閱讀框序列長度相近。隨后將目的條帶切膠回收，并連接到B載體上進(jìn)行測(cè)序分析，ZmNAS1、ZmNAS3和ZmNAS3?N克隆正確且測(cè)序結(jié)果顯示其核苷酸序列與玉米B73參考序列一致。

圖4 ZmNAS1、ZmNAS3和ZmNAS3?N基因的克隆Fig.4 Genes clone of ZmNAS1、ZmNAS3 and ZmNAS3?N

2.3 BiFC融合載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

應(yīng) 用Infusion方 法，構(gòu) 建ZmNAS1-YFPN、ZmNAS1-YFPC、ZmNAS3-YFPN、ZmNAS3-YFPC、ZmNAS3?N-YFPN和ZmNAS3?N-YFPC的載體。應(yīng)用XhoⅠ和XbaⅠ酶切得到4 000 bp左右骨架條帶和984 bp（ZmNAS1）、1 080 bp（ZmNAS3）、984 bp（ZmNAS3?N）的條帶（圖5）。載體的測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建出了BiFC融合表達(dá)載體。

圖5 載體酶切驗(yàn)證Fig.5 Enzyme digestion verification of vectors

2.4 BiFC檢測(cè)蛋白互作

ZmNAS1、ZmNAS3和ZmNAS3?N分別與YFPN和YFPC融合表達(dá)的載體相互組合共轉(zhuǎn)化玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察YFP熒光信號(hào)，設(shè)置pYFPC、pZm-NAS1-YFPN共轉(zhuǎn)化和pYFPN、pZmNAS1-YFPC共轉(zhuǎn)化為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖6所示，陰性對(duì)照組未檢測(cè)到熒光信號(hào)，而pZmNAS1-YFPN和pZmNAS1-YFPC共轉(zhuǎn)化、pZmNAS3-YFPN和pZmNAS3-YFPC共轉(zhuǎn)化、pZmNAS1-YFPN和pZmNAS3-YFPC共轉(zhuǎn) 化、pZmNAS1-YFPC和pZmNAS3-YFPN共 轉(zhuǎn) 化、pZm-NAS3?N-YFPC和pZmNAS3-YFPN共 轉(zhuǎn) 化、以 及pZmNAS3-YFPC和pZmNAS3?N-YFPN共轉(zhuǎn)化均可在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到Y(jié)FP熒光信號(hào)。BiFC結(jié)果表明，ZmNAS1和ZmNAS3蛋白可形成異源二聚體，同時(shí)NAS1和NAS3各自也可以形成同源二聚體。此外，ZmNAS3?N只能與ZmNAS3蛋白互作，而不能與ZmNAS1互作，且不能形成同源二聚體。以上結(jié)果表明，ClassⅡ家族蛋白的N端結(jié)構(gòu)域?qū)τ诋愒炊垠w的形成較為關(guān)鍵。

圖6 ZmNAS1、ZmNAS3和ZmNAS3?N的互作分析Fig.6 Analysis to interactions between ZmNAS1,ZmNAS3 and ZmNAS3?N

3 討論

NA在植物中普遍存在，而且對(duì)于保持植物體內(nèi)金屬穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要的作用，缺乏NA合成會(huì)導(dǎo)致葉片黃化和植株育性降低等問題［9，28］。NA的生物合成途徑為L-甲硫氨酸首先被活化為SAM，SAM在NAS的作用下合成為NA［17］。NAS基因廣泛存在于各種作物中，包括玉米、水稻、小麥和大麥等，且由多基因家族編碼并存在功能冗余的現(xiàn)象［17，21，23］。禾本科植物的NAS在進(jìn)化上分化為ClassⅠ和ClassⅡ兩個(gè)亞家族［21］。研究表明，ClassⅠNAS基因優(yōu)先在根和莖組織中表達(dá)，ClassⅡNAS基因主要在葉片中表達(dá)，且ClassⅠ和ClassⅡZmNAS功能的劃分與其互補(bǔ)表達(dá)調(diào)控有關(guān)［18］。

目前對(duì)于ClassⅡ亞家族NAS蛋白的研究相對(duì)較少，本研究發(fā)現(xiàn)ClassⅡZmNAS蛋白具有特異的N端可變結(jié)構(gòu)域，且不參與調(diào)節(jié)NAS的細(xì)胞內(nèi)定位。因此本研究主要探究N端可變結(jié)構(gòu)域是否對(duì)蛋白互作產(chǎn)生影響，研究證實(shí)了ClassⅡZmNAS蛋白的N端可變結(jié)構(gòu)域參與ZmNAS蛋白之間的互作。已有研究發(fā)現(xiàn)，很多蛋白通過二聚體的形式發(fā)揮功能，如亮氨酸拉鏈（basic leucinezipper，bZIP）家族轉(zhuǎn)錄因子通過二聚化、磷酸化修飾或與其他蛋白之間的相互作用，改變其與DNA結(jié)合的特異性、親和力，并影響其對(duì)下游基因的激活［29］。擬南芥隱花色素（cryptochromes，CRY）的二聚化對(duì)其起始藍(lán)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要，光解酶同源區(qū)（photolyase homologous region，PHR）結(jié)構(gòu)域是隱花色素CRY發(fā)生同源二聚化的區(qū)域，且光激活的CRY是以二聚體發(fā)揮生理功能的［30］。E3泛素連接酶（plastid protein sensing RING E3 ligase 1，PPSR1）的表達(dá)和功能研究表明，番茄E3泛素連接酶PPSR1能夠以同源二聚體形式存在，進(jìn)而參與番茄果實(shí)中類胡蘿卜素的生物合成［31］?；谝陨涎芯勘尘巴茰y(cè)ZmNAS家族蛋白也可能以二聚體的形式發(fā)揮功能。

NAS家族蛋白在植物維持鐵穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用，探究蛋白之間的相互作用關(guān)系具有一定的研究價(jià)值［32］。本研究通過BiFC技術(shù)發(fā)現(xiàn)ClassⅠZmNAS1和ClassⅡZmNAS3蛋白可以形成同源和異源二聚體，但刪除ZmNAS3的N端可變結(jié)構(gòu)域后，ZmNAS3?N只能與ZmNAS3蛋白互作且無法自身互作，表明N端結(jié)構(gòu)域?qū)τ诋愒炊垠w的形成較為關(guān)鍵且完整的ZmNAS蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)于同源二聚體的形成同樣重要。本研究結(jié)果后續(xù)應(yīng)通過酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證［33］，通過Pulldown和Co-IP等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證NAS家族ClassⅠ和ClassⅡ之間的相互作用，為探索其互作位點(diǎn)提供了參考。同時(shí)，本研究為進(jìn)一步探究ClassⅠ和ClassⅡ的NAS之間是否存在生理互作，以及NAS之間的互作對(duì)于NA/MA合成和代謝會(huì)產(chǎn)生何種影響提供了前期的依據(jù)。

綜上所述，本研究對(duì)ZmNAS兩個(gè)亞家族（ClassⅠ和ClassⅡ）成員的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，提示兩個(gè)家族的ZmNAS之間可能形成同源或者異源二聚體。進(jìn)而，在玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中對(duì)兩個(gè)亞家族ZmNAS成員間的互作關(guān)系進(jìn)行了BiFC驗(yàn)證。結(jié)果表明ZmNAS1和ZmNAS3蛋白可以形成同源和異源二聚體，且該蛋白自身結(jié)構(gòu)完整性影響同源二聚體的形成。此外，ClassⅡ亞家族蛋白的N端可變結(jié)構(gòu)域?qū)τ诋愒炊垠w的形成較為關(guān)鍵。本研究結(jié)果為探究ClassⅡNAS蛋白的N端可變結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涔δ艿挠绊懯欠翊龠M(jìn)作物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)鐵元素的機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。