建昌幫附子在甘草附子湯中單酯型生物堿含量比較研究*

蘇 慧

(江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校工程中心,江西 撫州 344000)

附子，又名烏頭或附片，為毛茛科、烏頭屬植物多年生草本子根的加工品。附子屬溫里藥，為中藥“回陽救逆第一品”，臨床上廣泛用于陽虛寒凝證，但生附子有毒，因此臨床上通常采用加工炮制減毒后的附子[1]。甘草附子湯源自《傷寒雜病論》，又名四物附子湯，由炙甘草、黑順片、白術(shù)和桂枝4味中藥組成，是治療風(fēng)濕兼陽虛證的代表方劑之一[2]?！敖ú龓汀睂儆凇敖魉帋汀保嬈谥频墓ぞ?、輔料、工藝等獨(dú)具本幫傳統(tǒng)風(fēng)格，采用煨制、蒸制、炒制及烤制法將附子加工成煨附子、淡附子、陰附子和陽附子，適應(yīng)各種臨床需要，盛譽(yù)業(yè)界[3，4]。

附子中化學(xué)成分主要為生物堿類，現(xiàn)從烏頭屬生物堿中分離出來的已知化學(xué)結(jié)構(gòu)主要是二萜類生物堿，其中單雙酯型生物堿為當(dāng)前研究最多的一類生物堿[5]?！吨腥A人民共和國藥典》[6]以烏頭堿新、烏頭堿、次烏頭堿3個(gè)雙酯型生物堿總量評(píng)價(jià)附子毒性，以苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿3個(gè)單酯型生物堿總量評(píng)價(jià)其有效性?，F(xiàn)代研究多集中于甘草附子湯中化學(xué)成分及臨床應(yīng)用的研究，對(duì)不同附子炮制品規(guī)格在復(fù)方湯劑生物堿含量差異的研究未見報(bào)道，但附子不同炮制品規(guī)格與臨床療效密切相關(guān)，臨床上可合理炮制削減附子毒性來滿足臨床需求。

實(shí)驗(yàn)選取建昌幫附子(煨附子、淡附子、陰附子、陽附子)及臨床上使用最多的黑順片為研究對(duì)象，參照《傷寒論》的煎煮方法，分別制備甘草附子湯，以單酯型生物堿總量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)建昌幫附子及黑順片在甘草附子湯中單酯型生物堿含量進(jìn)行了比較，從其有效成分含量的角度研究附子不同炮制品規(guī)格對(duì)甘草附子湯的影響，為甘草附子湯的臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260 Ⅱ型高效液相色譜儀(UV檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司)，PWN124型萬分之一分析天平(奧克斯儀器有限公司)，Smart-N15UV型超純水機(jī)[美國密理博(Millipore)有限公司]，Strike300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器有限公司)。

1.2 試劑 除乙腈為色譜純?cè)噭?TEDIA)，其余試劑均為分析純；對(duì)照品：苯甲酰新烏頭堿(MUST21022704)、苯甲酰次烏頭堿(MUST21031111)、苯甲酰烏頭堿(MUST22042014)純度≥98%，購自曼斯特(成都)生物科技有限公司；黑順片購于四川江油飲片廠，炙甘草購于江西德惠中藥飲片有限公司，桂枝購于江西彭氏國藥堂飲片有限公司，白術(shù)購于江西同善堂中藥飲片有限公司；建昌幫煨附子、淡附子、陰附子、陽附子由江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥炮制團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 成品外觀性狀比較 抽取建昌幫附子與黑順片，于自然光下觀察其成品外觀性狀，結(jié)果顯示，煨附子：呈灰棕色半透明，不規(guī)則卵圓形薄中片；陰附子：呈棕黃色半透明，不規(guī)則卵圓形薄片；陽附子：呈白黃色不規(guī)則卵圓形厚片，表面不平整，斷面鼓起；淡附子：呈灰白色不規(guī)則卵圓形極薄片；黑順片：外皮黑褐色。見圖1。

A煨附子；B陰附子；C陽附子；D淡附子；E黑順片圖1 建昌幫附子和黑順片外觀性狀圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苯甲酰新烏頭堿(Benzoylmesaconine，BM)、苯甲酰次烏頭堿(Benzoylhypaconine，BH)對(duì)照品1 mg，分別用0.05%鹽酸-甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單一成分的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 甘草附子湯煎劑的制備參考《傷寒論》，分別稱取5份(甘草6 g，桂枝12 g，白術(shù)6 g)，其中再分別加入6 g樣品，依次為煨附子、陰附子、陽附子、淡附子、黑順片，加10倍蒸餾水浸泡30 min，微沸提取2次，提取時(shí)間分別為60 min和40 min，合并提取液后，雙層紗布過濾，將過濾液轉(zhuǎn)移至容量瓶中并定容至250 mL，精密量取100 mL旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)眉状? mL、氨水8 mL、三氯甲烷40 mL混合液溶解，加熱回流2 h，放冷濾過。濾液60 ℃水浴蒸干，移至10 mL容量瓶中用0.05%鹽酸-甲醇溶解，進(jìn)樣前提取液用微孔濾膜過濾。

2.4 陰性供試品溶液的制備 稱取甘草6 g，桂枝12 g，白術(shù)6 g，按照2.3項(xiàng)下制備，即得陰性供試品溶液。

2.5 高效液相色譜法工作條件 檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm；Agilent C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：20 mmoL/L乙酸銨，流動(dòng)相B：乙腈∶甲醇(1∶1)；洗脫程序：0～10 min，95%～80%A；10～20 min，80%～70%A；20～35 min，70%～55%A。柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.6 色譜分析 吸取混合BM、BH的對(duì)照品溶液、甘草附子湯全方煎液(煨附子、陰附子、陽附子、淡附子、黑順片)、陰性供試品溶液，色譜分析結(jié)果見圖2。

A陰性供試品；B煨附子；C陰附子；D陽附子；E黑順片；F淡附片；G 1:BM對(duì)照品、2:BH對(duì)照品圖2 甘草附子湯高效液相色譜圖

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1 線性關(guān)系 用0.05%鹽酸-甲醇稀釋，得一系列濃度BM、BH對(duì)照品溶液，根據(jù)峰面積積分和對(duì)應(yīng)濃度的XY軸數(shù)據(jù)，得BM在2.5～110.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=7.2343X+3.9492，r=0.9999；BH在2.0～15.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程；Y=15.187X+1.1457，r=0.9998。數(shù)據(jù)顯示，BM、BH對(duì)應(yīng)濃度和峰面積積分呈良好的線性關(guān)系。

2.7.2 精密度 吸取10 μL BM、BH對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)得BM峰面積RSD為0.79%，出峰時(shí)間RSD為0.04%；BH峰面積RSD為0.36%，出峰時(shí)間RSD為0.82%。結(jié)果表明，方法精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性 制備陰附子全方煎液6份，結(jié)果測(cè)得BM的分離時(shí)間RSD為0.07%，峰面積RSD為1.19%；BH的分離時(shí)間RSD為0.04%，峰面積RSD為2.77%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性 取陰附子全方煎液，室溫條件下于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果測(cè)得BM的分離時(shí)間RSD為0.06%，峰面積RSD為2.31%；BH的分離時(shí)間RSD為0.05%，峰面積RSD為2.58%。表明陰附子全方煎液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的陰附子供試品液，分別加入適量的BM、BH對(duì)照品溶液，平行操作3次，進(jìn)行加樣后的提取和回收。各組分的回收率見表1，BM的加樣回收率在99.41%～103.18%，BH的加樣回收率在102.53%～102.94%，說明該方法較為可靠。

表1 陰附子供試品液中BM、BH加樣回收數(shù)據(jù)

2.7.6 樣品含量測(cè)定 分別精密稱取建昌幫附子(煨附子、陽附子、淡附子、陰附子)和黑順片，各平行制備甘草附子湯全方煎液3份，測(cè)定煎煮液中BM、BH含量，見表2。

表2 甘草附子湯中單酯型生物堿含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

大多數(shù)生物堿是以鹽的形式存在于中藥中，生物堿鹽溶于水且不溶于有機(jī)試劑，考慮甘草附子湯蒸發(fā)干后需用有機(jī)試劑溶解，所以實(shí)驗(yàn)加熱回流中加入氨水使其轉(zhuǎn)為游離態(tài)生物堿，方便測(cè)定甘草附子湯中單酯型生物堿。鹽酸可以抑制單酯型生物堿水解，所以BM、BH對(duì)照品溶液溶劑選擇加入0.05%鹽酸。

分析甘草附子湯單酯型生物堿時(shí)，分別考察了有機(jī)相為甲醇、乙腈及二者混合3種流動(dòng)相，結(jié)果顯示，乙腈∶甲醇(1∶1)分離效果較好。因甘草附子湯單酯型生物堿為弱堿性樣品，考慮在水相中加入乙酸銨，增加單酯型生物堿在柱子中分析的保留時(shí)間。結(jié)果顯示，水相加入20 mmoL/L乙酸銨后，譜圖分離效果明顯改善，且峰分布均勻，故選擇乙腈∶甲醇(1∶1)-20 mmoL/L乙酸銨為流動(dòng)相。

《中華人民共和國藥典》采用3個(gè)單酯型生物堿總量評(píng)價(jià)其附子有效性，雙酯型生物堿不耐高溫，在附子湯中雙酯型生物堿可轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿。因此實(shí)驗(yàn)以單酯型生物堿總量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)建昌幫附子及黑順片在甘草附子湯中單酯型生物堿含量進(jìn)行了比較研究，但苯甲酰烏頭堿在檢測(cè)中含量較低，未被檢測(cè)到，所以并未對(duì)苯甲酰烏頭堿進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示，不同附子炮制方法會(huì)影響其在甘草附子湯中的單酯型生物堿成分含量，還會(huì)影響附子成品外觀和顏色，在5種炮制品甘草附子湯全方煎液中，采用煨制法制備的煨附子全方煎液?jiǎn)熙バ蜕飰A成分含量最高，采用膽水浸泡后硫熏制備的黑順片全方煎液?jiǎn)熙バ蜕飰A成分含量最低，符合建昌幫藥幫炮制附子的目的，表明建昌幫附子替代甘草附子湯中黑順片的可行性。