福建光皮樹優(yōu)樹EST-SSR標(biāo)記開發(fā)與遺傳多樣性

葉代全

(福建省洋口國有林場(chǎng)，福建 順昌 353211)

光皮樹(Cornuswilsoniana)又名光皮梾木，是山茱萸科(Cornaceae)梾木屬植物，是我國特有的多用途木本油料樹種，分布于中國長(zhǎng)江流域至西南各地的石灰?guī)r山區(qū)[1-3]。光皮樹果油不僅可以作為高級(jí)食用油，而且具有顯著的降膽固醇、減肥等藥用和保健價(jià)值[1，4-10]。2013年12月，國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)正式批準(zhǔn)光皮樹果實(shí)油為我國的新食品原料。光皮樹在城市綠化、丘陵和荒山營造生態(tài)經(jīng)濟(jì)林以及石漠化地區(qū)的生態(tài)恢復(fù)起到重要作用[3，11-12]。

本研究于2013年11月對(duì)閩西北地區(qū)(主要在明溪縣、將樂縣和寧化縣境內(nèi))光皮樹的分布情況進(jìn)行調(diào)查，收集閩西北地區(qū)的光皮樹種質(zhì)資源(優(yōu)樹)24份，采集11個(gè)優(yōu)樹的種子并進(jìn)行子代測(cè)定[1]。由于福建處于中國光皮樹自然分布區(qū)的邊緣，顯然從種質(zhì)資源保護(hù)的角度這些優(yōu)樹具有重要價(jià)值。然而這些優(yōu)樹的遺傳多樣性水平、福建光皮樹種群與國內(nèi)其它地區(qū)光皮樹種群之間的遺傳距離等未見報(bào)道。

分子標(biāo)記是在 DNA水平上反應(yīng)不同個(gè)體或種群間的遺傳多樣性。相比其它的遺傳標(biāo)記，DNA分子標(biāo)記不易受環(huán)境影響，可靠性更高，可以快速、準(zhǔn)確地對(duì)植物遺傳多樣性進(jìn)行研究。EST-SSR是基于表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag)開發(fā)的SSR分子標(biāo)記[13]，與基因組SSR相比，EST-SSR可以在物種之間轉(zhuǎn)移。目前，EST-SSR已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性評(píng)價(jià)、種質(zhì)鑒定研究等。本研究采用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，開發(fā)光皮樹EST-SSR分子標(biāo)記，并利用這些標(biāo)記對(duì)福建省11個(gè)優(yōu)樹種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性相關(guān)研究，以期為光皮樹的種質(zhì)資源收集保存及遺傳育種提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)地概況

光皮樹材料來自福建省洋口國有林場(chǎng)的光皮樹優(yōu)樹子代測(cè)定林，共11個(gè)優(yōu)樹子代。其中9個(gè)來自明溪(MX)，1個(gè)來自寧化(NH)，1個(gè)來自將樂(JL)。

試驗(yàn)地位于福建省洋口國有林場(chǎng)元峰工區(qū)3林班3大班2小班，地理位置為東經(jīng)117°41′、北緯27°4′，南坡，坡度24°，海拔329 m。小班面積為10.2 hm2，其中試驗(yàn)地面積為1.3 hm2。造林地前茬屬杉木林地，土壤為紅壤，立地等級(jí)Ⅱ級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本采集、處理與DNA提取 2020年4月，在福建省洋口國有林場(chǎng)的光皮樹優(yōu)樹子代測(cè)定林采集11個(gè)優(yōu)樹子代新鮮葉片，每個(gè)樣本標(biāo)號(hào)后裝入自封袋中，放入裝有干冰的泡沫盒帶回實(shí)驗(yàn)室，將樣品置于-80 ℃的超低溫冰箱中備用。各樣本DNA提取采用QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit(50)植物DNA提取試劑盒；采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA 檢測(cè)，帶型清楚整齊、無拖尾等現(xiàn)象表示提取結(jié)果較佳；結(jié)合紫外分光光度計(jì)、Qubit熒光計(jì)檢測(cè)DNA純度與濃度。

1.2.2 光皮樹EST-SSR位點(diǎn)檢索 對(duì)項(xiàng)目組前期開展的光皮樹不同組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，采用MISA軟件檢索重復(fù)單元在3～5 bp的微衛(wèi)星位點(diǎn)，重復(fù)次數(shù)大于5次。

1.2.3 光皮樹EST-SSR引物設(shè)計(jì) 采用PRIMER3軟件，對(duì)上述檢索結(jié)果依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)段在100～300 bp，最小TM值為55 ℃和最優(yōu)TM值為57 ℃的設(shè)計(jì)原則，共開發(fā)了200對(duì)EST-SSR引物。

1.2.4 光皮樹EST-SSR引物合成與多態(tài)性引物篩選 采用加尾法進(jìn)行熒光引物合成，再隨機(jī)選取8份光皮樹DNA，對(duì)200對(duì)引物經(jīng)過初篩和復(fù)篩，共選出29對(duì)多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的有效引物；采用29對(duì)引物(表1)對(duì)全部11個(gè)樣本DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 用于光皮樹種質(zhì)資源分析的29對(duì)EST-SSR 引物序列信息

表1(續(xù))

1.2.5 光皮樹EST-SSR PCR擴(kuò)增、檢測(cè) 光皮樹EST-SSR PCR擴(kuò)增反應(yīng)在ABI PCR擴(kuò)增反應(yīng)儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃修復(fù)延伸5 min；35次循環(huán)。

圖1 光皮樹樣本EST-SSR引物PCR擴(kuò)增毛細(xì)管電泳圖

PCR產(chǎn)物使用ABI 3730 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)(圖1)，結(jié)合分子內(nèi)標(biāo)來分析片段大小，測(cè)序儀檢測(cè)結(jié)果采用Gene mapper 3.0軟件分析。

1.2.6 光皮樹EST-SSR數(shù)據(jù)及分析 根據(jù)熒光檢測(cè)的峰值得到片段大小信息，按樣本和引物制備EST-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物大小矩陣，用于遺傳多樣性分析。應(yīng)用GenAlEx 6.51b2軟件分析得到各微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因頻率、特有多態(tài)位點(diǎn)、Shannon 信息指數(shù)和基因多樣性指數(shù)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 福建省光皮樹優(yōu)樹EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性

采用經(jīng)2輪篩選的29對(duì)光皮樹EST-SSR多態(tài)引物對(duì)福建省11個(gè)光皮樹優(yōu)樹材料進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出90個(gè)EST-SSR位點(diǎn)，平均多態(tài)性位點(diǎn)占55.17%。29對(duì)引物的有效多態(tài)位點(diǎn)數(shù)變幅為0.333(M1)～3.195(M3)。29對(duì)引物的Shannon 信息指數(shù)變幅為0.0000(M1，M13)～1.068(M3)，平均值為0.426。說明篩選出的EST-SSR引物在11個(gè)光皮樹優(yōu)樹種質(zhì)資源材料間存遮豐富的遺傳多樣性(表2)。從優(yōu)樹采集地點(diǎn)上看，來自明溪的光皮樹優(yōu)樹多態(tài)性位點(diǎn)比例為93.10%，寧化為27.59%，將樂為44.86%。

表2 光皮樹29對(duì)EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

2.2 福建省光皮樹優(yōu)樹EST-SSR遺傳多樣性

對(duì)來自福建省3個(gè)地點(diǎn)的11株優(yōu)樹的EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行F統(tǒng)計(jì)量及有效種群大小參數(shù)Nm估算，結(jié)果見表3。從Fst可以看出，29個(gè)EST-SSR標(biāo)記的遺傳分化指數(shù)平均值為0.498，說明目前收集的福建省11株優(yōu)樹群體具有較好的遺傳多樣性。群體特有等位基因數(shù)量分析結(jié)果表明：11個(gè)優(yōu)樹共發(fā)現(xiàn)51個(gè)特有等位基因，占56.67%。其中，來自明溪的有45個(gè)，寧化的有1個(gè)，將樂的有5個(gè)。

表3 光皮樹各位點(diǎn)F統(tǒng)計(jì)量和Nm的估計(jì)值

2.3 光皮樹優(yōu)樹EST-SSR主坐標(biāo)分析

從全國8個(gè)光皮樹種群EST-SSR分子標(biāo)記主坐標(biāo)PCoA分析結(jié)果可知，前3個(gè)主成分解釋變異的累積百分率分別為42.52%、66.39%、83.09%。二維PCoA分析(圖2)明顯將各群體劃分為3大類(湖南、湖北、貴州、江西、重慶和廣東為一類，福建和廣西各自為一類)。其中廣西的分布與其它群體相距最遠(yuǎn)，福建次之，的確位于全國光皮樹分布區(qū)的邊緣。PCoA分析結(jié)果大致表現(xiàn)出光皮樹種質(zhì)資源在分布上的地域規(guī)律性。

2.4 光皮樹優(yōu)樹EST-SSR特有等位基因分析

在來自重慶、江西、湖南、湖北、貴州、廣西、廣東和福建等全國8個(gè)光皮樹種群綜合分析中，全部275個(gè)優(yōu)樹群體中共獲得124個(gè)特有等位基因。其中，來自福建的有11個(gè)，占8.87%；而且來自福建省的11個(gè)優(yōu)樹個(gè)體每個(gè)個(gè)體均含有特有等位基因(表4)。

GZ為貴州；HB為湖北；HN為湖南；GD為廣東；JX為江西；GX為廣西；FJ為福建；CQ為重慶 圖2 光皮樹群體的PCoA分析

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究利用光皮樹轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)了光皮樹EST-SSR分子標(biāo)記，并篩選出了29對(duì)多態(tài)引物，來自福建省11個(gè)優(yōu)樹子代共擴(kuò)增出90個(gè)EST-SSR位點(diǎn)，平均多態(tài)性位點(diǎn)占55.17%；來自明溪的光皮樹優(yōu)樹多態(tài)性位點(diǎn)比例為93.10%，寧化為27.59%，將樂為44.86%。福建省11個(gè)光皮樹優(yōu)樹個(gè)體間遺傳分化指數(shù)平均值為0.498，11株優(yōu)樹中共發(fā)現(xiàn)51個(gè)特有等位基因，占56.67%。全國8個(gè)光皮樹種群275株優(yōu)樹中共獲得124個(gè)特有等位基因，其中來自福建的有11個(gè)，占8.87%；且11株優(yōu)樹每株均含有特有等位基因。

3.2 討論

油脂既是人們生活必需的消費(fèi)品，又是食品、醫(yī)藥、皮革、紡織、化妝和油漆等工業(yè)的重要原料。維護(hù)糧油安全一直是世界各國高度關(guān)注的重大戰(zhàn)略。我國在大豆和油菜籽方面一直是凈進(jìn)口國，進(jìn)口量也呈持續(xù)增加態(tài)勢(shì)。我國油料凈進(jìn)口量由2000年的1260萬t增加到2017年的1億t，2020年油料凈進(jìn)口量為1.04億t，較上年增加12.8%。大豆凈進(jìn)口量占我國油料凈進(jìn)口總量的比例一直在90%以上，2020年達(dá)到96.5%，凈進(jìn)口總量達(dá)到1億t。

目前，我國食用植物油構(gòu)成以大豆油、棕櫚油和菜子油為主，以茶油為主的木本植物油只占年總量的1.8%左右。聯(lián)合國糧農(nóng)組織已將木本油料列為重點(diǎn)推廣的健康型高級(jí)食用油。發(fā)展木本油料產(chǎn)業(yè)，有利于維護(hù)國家糧油和能源安全。維護(hù)糧油安全一直是世界各國高度關(guān)注的重大戰(zhàn)略。長(zhǎng)期以來，黨中央、國務(wù)院始終把糧油生產(chǎn)放在突出位置，采取一系列有力措施，確保糧食連年增產(chǎn)，創(chuàng)造了用占世界9%的耕地資源養(yǎng)活占世界21%人口的奇跡，但是，保障國家糧油安全依然面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

表4 福建省光皮樹優(yōu)樹特有等位基因及頻率

在世界面臨能源危機(jī)的今天，可再生的生物質(zhì)能源越來越受到人們的重視，成為世界能源戰(zhàn)略調(diào)整重要的發(fā)展方向。木本油料是優(yōu)質(zhì)食用植物油及可再生的生物質(zhì)能源，加快木本油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展，有利于保障國家糧油市場(chǎng)供應(yīng)，確保國家油料和能源安全。光皮樹是我國特有的木本油料植物，除作為油料植物栽培，還在園林綠化得到廣泛應(yīng)用，尤其是能夠在石灰?guī)r山地生長(zhǎng)，近年來得到這些地區(qū)領(lǐng)導(dǎo)和企業(yè)家的密切關(guān)注，作為生態(tài)林來建設(shè)的同時(shí)，能夠產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益，目前正受到重視。在適宜地區(qū)進(jìn)行光皮樹的推廣種植將是未來我國木本油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中的必然趨勢(shì)。

福建省雖然是我國光皮樹分布的邊緣產(chǎn)區(qū)，但從前期開展的光皮樹種質(zhì)資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，福建省仍存在一定數(shù)量的古樹，根據(jù)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民口述估計(jì)，均約在100 a 以上，大多位于風(fēng)景名勝區(qū)[3]。因此，在歷史上福建省很有可能存在原始光皮樹種群，因本次獲得的福建省光皮樹優(yōu)樹數(shù)量有限，不同群體的數(shù)量差異較大，很多遺傳參數(shù)無法估算。但從本項(xiàng)研究的結(jié)果還是能夠看出，福建省的光皮樹優(yōu)樹的遺傳多樣性較高，尤其是獲得較高比例的特有等位基因，超過一半，占56.67%。來自將樂風(fēng)景區(qū)的1株優(yōu)樹上含有5個(gè)特有等位基因，說明這些種質(zhì)資源非常值得保護(hù)和收集。從建設(shè)全國光皮樹種質(zhì)資源庫的角度來看，來自福建省的光皮樹種質(zhì)資源是不可缺少的重要部分。今后應(yīng)加強(qiáng)福建省光皮樹種質(zhì)資源的收集、保護(hù)和開發(fā)利用等方面的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。