金線蓮莖腐病致病菌的分離及其拮抗菌的篩選

路梅， 劉建峰， 鄭熊飛， 劉永立， 胡海濤*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004； 2.武義縣俞源鄉(xiāng)人民政府，浙江 金華 321200；3.浙江大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院，浙江 杭州 310058)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)系蘭科開唇蘭屬名貴草本藥材，又名金線蘭、金絲草、金不換等。金線蓮具有很高的藥用價(jià)值，在民間素有“藥王”“烏人參”“金草”“神藥”等美稱[1]。金線蓮種子自然萌發(fā)率很低，對(duì)生長環(huán)境要求高，加之人類過度采挖，致使野生資源瀕臨滅絕，導(dǎo)致金線蓮藥源供需矛盾非常突出[2]。人工栽培是解決金線蓮供需緊張的唯一途徑，但是金線蓮人工栽培過程中易感染病蟲害，影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。金線蓮莖腐病是金線蓮人工栽培中一種主要病害，該病原菌可以從金線蓮的根莖、根毛和表皮入侵到其莖基部，對(duì)不同生長時(shí)期的金線蓮皆可造成不同程度的病害，發(fā)病時(shí)植株莖部先出現(xiàn)黃褐色水漬狀的病斑，擴(kuò)大到能繞著莖部一圈，發(fā)病部分腐爛成線狀[3]。

金線蓮莖腐病對(duì)金線蓮危害極大，且發(fā)生普遍，嚴(yán)重制約了金線蓮產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前，金線蓮莖腐病主要采用化學(xué)農(nóng)藥防控，但該病原菌在金線蓮不同生長期皆可造成病害，噴施農(nóng)藥時(shí)間點(diǎn)很難把控，防治效果不理想，而且也易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留和中藥的食用安全[4-5]。有益微生物介導(dǎo)的生物防治具有安全、持久、有效和對(duì)人畜無害等特點(diǎn)，已成為植物病害防治的重要方向[6-7]。篩選有益菌防治植物病害報(bào)道已有很多[8-10]，而關(guān)于金線蓮莖腐病病原拮抗菌篩選鑒定的研究鮮見報(bào)道。本研究采用平板對(duì)峙法對(duì)3種商業(yè)化的生防菌和1株從百合鱗片中分離得到的非致病性尖孢鐮刀菌進(jìn)行篩選，以期獲得具有高效拮抗金線蓮莖腐病病原菌的生防菌株，為金線蓮莖腐病的生物防治提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

金線蓮正常植株為本實(shí)驗(yàn)室快繁栽培的尖葉金線蓮品種，患莖腐病植株取自金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)院種植基地發(fā)病的尖葉金線蓮。拮抗實(shí)驗(yàn)的供試菌株為從哈茨木霉、放線菌、綠色木霉等商品化的生防菌中分離純化獲得的菌株，所有真菌菌種均接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)試管斜面上于4 ℃冰箱保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂15～20 g·L-1。

1.2 金線蓮莖腐病致病菌的分離與純化

本實(shí)驗(yàn)采用組織分離法進(jìn)行金線蓮莖腐病致病菌的分離。取金線蓮莖腐病患病植株，先用清水洗凈表面雜質(zhì)，再放入75%乙醇溶液對(duì)組織表面消毒1 min，然后用0.1% HgCl2消毒5 min，最后無菌水清洗3遍，用無菌濾紙吸干表面水分。切取莖部的病健交界處組織，置于PDA上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌落時(shí)，用無菌接種環(huán)挑取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)新于新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，獲得初步純化培養(yǎng)的菌落。將純培養(yǎng)后的菌株，接種于PDA試管斜面培養(yǎng)好后，在4 ℃冰箱中保存。

1.3 金線蓮莖腐病致病菌的形態(tài)學(xué)鑒定及致病性檢測

將純化的致病菌接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后，觀察菌落形態(tài)以及用無菌接種環(huán)挑取菌落鏡檢，觀察菌絲、孢子形態(tài)。

致病性的檢測采用針刺接種法。選取健康金線蓮的同一莖位莖段，用微量加樣槍的針頭刺破表皮，于針刺點(diǎn)上接種直徑為2 mm的疑似病原菌的菌絲塊，同時(shí)接種同樣直徑的空白培養(yǎng)基為對(duì)照。每個(gè)處理各接種20株植株，接種處理完后共同置于28 ℃環(huán)境中，控制好溫濕度，保證發(fā)病條件，3 d后觀察且記錄發(fā)病情況。

1.4 金線蓮莖腐病致病菌的分子鑒定

采用真菌全基因組DNA提取試劑盒提取分離致病菌的DNA，以真菌ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系41 μL，其組分如下：4 μL模板DNA，20 μL 10×KOD Buffer，8 μL dNTP，1 μL KOD聚合酶，引物ITS1和ITS4各4 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃，4 min預(yù)變性；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，35次循環(huán)；68 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增的產(chǎn)物，進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物送到杭州尚亞生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行基因測序。獲得基因序列后，對(duì)菌株的rDNA-ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已知序列進(jìn)行對(duì)比，并進(jìn)行同源性分析。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)觀察以及致病性檢測，最后確定致病菌的種類。

1.5 金線蓮莖腐病致病菌拮抗菌的篩選

采用對(duì)峙實(shí)驗(yàn)法篩選對(duì)金線蓮莖腐病的致病菌有抑制作用的拮抗菌株，即在距離平板中央30 mm處接種致病菌菌絲塊，同樣在距離平板中央30 mm的致病菌對(duì)側(cè)處接種供試菌株(哈茨木霉、放線菌和綠色木霉，對(duì)照組接種無菌的PDA培養(yǎng)基)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置3個(gè)平行組，觀察是否有抑菌作用以及強(qiáng)弱。在PDA平板上分別測量空白對(duì)照組的致病菌菌落直徑和實(shí)驗(yàn)組的致病菌菌落直徑。測量到的菌落直徑大小，參照以下公式計(jì)算抑菌率。抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-實(shí)驗(yàn)菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀的調(diào)查

調(diào)查發(fā)現(xiàn)金線蓮莖腐病是一種易在夏季高溫高濕的環(huán)境中發(fā)生的金線蓮病害。金線蓮莖腐病癥狀為莖稈基部或中部呈水漬狀的病斑，后變黃干枯縊縮成褐腐爛線狀(圖1箭頭)，基部葉片變黃化、萎蔫下垂、變褐等癥狀，嚴(yán)重的開始脫落、皺縮，最后整株黃化枯萎。此病是土壤傳染性的病害，其程度和土壤中可侵染的病原菌量密切相關(guān)，致病菌也可通過肥料、澆水等途徑傳播。

圖1 金線蓮患病植株和健康植株

2.2 金線蓮莖腐病致病菌的鑒定

2.2.1 致病菌形態(tài)學(xué)觀察

在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其菌落外貌，致病菌在平板上長出很多棉絮狀的菌絲，且能在培養(yǎng)基中分泌出紫色的物質(zhì)(圖2中A)。鏡檢顯示，菌絲具有隔膜及分枝；小型分生孢子數(shù)量較多，呈卵形、長圓形或腎形，無色透明，大小為(4.5～10.6)μm×(2.2～3.3)μm；大型分生孢子數(shù)量較少，呈鐮刀狀(圖2中C)，大小為(20.5～42.3)μm×(3.0～4.8)μm，多具3個(gè)隔膜，頂細(xì)胞漸尖或呈鈍型；厚垣孢子部分由大孢子部分細(xì)胞膨大形成，部分在菌絲側(cè)枝長出，壁光滑或有突起，多呈球形，絕大多數(shù)無色，少數(shù)為褐色，初步鑒定實(shí)驗(yàn)分離出的內(nèi)生菌符合尖孢鐮刀菌的特征。

A—致病菌的菌落特征；B—致病菌的菌絲；C—致病菌的鐮刀狀分生孢子和厚垣孢子。

2.2.2 致病菌致病性檢測

在人工回歸接種致病菌第5 d后，金線蓮健康的植株開始發(fā)病，表現(xiàn)出明顯的莖腐病癥狀。取致病菌侵染的金線蓮植株進(jìn)行致病菌的再分離，得到與接種菌株具有相同形態(tài)學(xué)特征的致病菌(圖3)。

圖3 致病性檢測

2.2.3 致病菌分子學(xué)鑒定

用真菌共用引物進(jìn)行莖腐病致病菌的rDNA-ITS片段PCR，擴(kuò)增出的特異性單一條帶在523 bp左右(圖4)，產(chǎn)物測序后獲得該致病菌的基因序列。用GenBank已知的DNA序列與致病菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行同源性比較，數(shù)據(jù)表明，與致病菌同源性較高的菌株是尖孢鐮刀菌(F.oxysporumSchl.)，同源性高達(dá)98%。據(jù)此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定引起金線蓮莖腐病的致病菌為尖孢鐮刀菌。

圖4 金線蓮莖腐病致病菌的rDNA-ITS序列

2.3 拮抗菌的篩選

通過對(duì)峙實(shí)驗(yàn)法篩選到3種有良好抑菌作用的拮抗菌，分別是哈茨木霉、綠色木霉、放線菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖所示(圖5～7)，可以看出3種拮抗菌對(duì)金線蓮莖腐病致病菌尖孢鐮刀菌的萌發(fā)和生長具有抑制作用，且3種拮抗菌的生長速率顯著快于致病菌。實(shí)驗(yàn)5 d后，哈茨木霉的抑菌率最高，為66.7%；綠色木霉次之，為63.9%；放線菌的抑菌率為62.5%(表1)。

表1 3種拮抗菌對(duì)金線蓮莖腐病致病菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A、B—哈茨木霉與致病菌的對(duì)峙實(shí)驗(yàn)菌落形態(tài)；C—對(duì)照，未接種哈茨木霉菌。

3 討論

尖孢鐮刀菌是一種世界性的毀滅性病原真菌，可侵染100多種具有重要價(jià)值的作物，引發(fā)作物枯萎導(dǎo)致根腐病[11-12]。由鐮刀菌枯萎病引起的土傳病害正威脅我國香蕉[13]、西瓜[14]、鐵皮石斛[15]、百合[16]等多種重要經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)。本研究從患莖腐病的金線蓮莖段中分離得到一株疑似致病菌菌株，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和致病性檢測等方法進(jìn)行了鑒定。依據(jù)鐮刀菌分類標(biāo)準(zhǔn)，確定該金線蓮莖腐病的致病菌為尖孢鐮刀菌(F.oxysporumSchl.)，與趙云青等[3]的結(jié)果一致。金線蓮整個(gè)生長周期均有可能感染莖腐病，且該病病勢迅猛，極易在短期內(nèi)出現(xiàn)大面積倒伏，嚴(yán)重制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展，生產(chǎn)上防治金線蓮莖腐病主要用百菌通、多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，而化學(xué)防治必定會(huì)帶來諸多的問題，例如藥劑殘留危害人類的健康。因此，尋找到一種綠色環(huán)保的防治方法尤為重要，是符合當(dāng)前人們追求健康生活的理念，而生物防治無疑是最好的選擇。

A、B—綠色木霉菌與致病菌的對(duì)峙實(shí)驗(yàn)菌落形態(tài)；C—對(duì)照，未接種綠色木霉菌。

A、B—放線菌與致病菌的對(duì)峙實(shí)驗(yàn)菌落形態(tài)；C—對(duì)照，未接種放線菌。

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，哈茨木霉、綠色木霉、放線菌都對(duì)金線蓮莖腐病致病菌都有良好的抑制效果。3種拮抗菌表現(xiàn)出的抑制作用可能與拮抗菌爭奪致病菌營養(yǎng)物質(zhì)或分泌拮抗物質(zhì)等因素有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步深入研究。生防菌在寄主中穩(wěn)定定殖是其發(fā)揮防病作用的重要前提，也是決定其防病效果的關(guān)鍵因素。由于本文采用的是平板對(duì)峙培養(yǎng)法，生防菌在離體條件下的拮抗實(shí)驗(yàn)和自然情況下的抑制作用未必存在必然的關(guān)系，往往實(shí)驗(yàn)室中拮抗菌有明顯的抑制效果，但接種到植株的根際土壤后卻沒有生防作用。本研究是在實(shí)驗(yàn)室中開展的，缺乏必要的實(shí)際生產(chǎn)防效實(shí)驗(yàn)。若經(jīng)過進(jìn)一步的實(shí)際生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，3種拮抗菌將有望成為防治金線蓮莖腐病第一選擇的綠色藥劑。這樣不僅可以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量和使用頻率，進(jìn)一步減低農(nóng)殘，還可以減少種植戶的生產(chǎn)成本，在金線蓮的實(shí)際生產(chǎn)中有巨大的市場前景價(jià)值。