阿法骨化醇聯(lián)合潑尼松治療成人初發(fā)確診的原發(fā)免疫性血小板減少癥40例臨床觀察

李琦，康虹陽，范凌，張靈，劉潔，佟長青，張斌

1 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液病科，河北 張家口 075000；2 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科

原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）是一種常見的、以無明確誘因的孤立性外周血小板計(jì)數(shù)（PLT）下降為主要特點(diǎn)的出血性疾病，成人年發(fā)病率為（2～10）/10萬［1］。該獲得性自身免疫性出血性疾病患者的臨床表現(xiàn)變化較大，從無出血表現(xiàn)（即無癥狀血小板減少）到有出血表現(xiàn)（如皮膚黏膜出血、內(nèi)臟出血），乃至致命性顱內(nèi)出血均可發(fā)生，部分患者有明顯的焦慮、乏力表現(xiàn)［2］。目前糖皮質(zhì)激素是治療ITP的一線藥物，其能有效抑制血小板抗體生成，減少血小板破壞，增加血小板水平，起效快、癥狀緩解迅速，近期療效尚可，但停藥或減量后易復(fù)發(fā)，部分遷延難愈，遠(yuǎn)期整體療效欠佳［3］。既往研究［4］顯示，維生素D缺乏與成人ITP的發(fā)病相關(guān)，外周血淋巴細(xì)胞維生素D受體（VDR）異常表達(dá)可能參與了該自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，而外源性補(bǔ)充活性維生素D及其類似物可能成為成人ITP治療的新方向。阿法骨化醇作為人工合成的活性維生素D類似物，是外源性補(bǔ)充維生素D的常用藥。本研究以2018年1月—2021年1月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的成人初發(fā)確診ITP患者為研究對象，采用阿法骨化醇聯(lián)合潑尼松進(jìn)行治療，通過觀察其臨床療效，旨在探尋成人初發(fā)確診ITP更為安全有效且可行的治療方案?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2018年1月—2021年1月在本院就診的成人初發(fā)確診的ITP患者80例，均符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2016年版）》［6］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分成觀察組與對照組各40例，觀察組男15例、女25例，年 齡23～79（40.72±8.46）歲；PLT 10～28（18.8±4.2）×109/L；體 質(zhì) 量48.6～81.5（65.4±11.7）kg。對照 組 男13例、女27例，年 齡21～77（40.16±7.93）歲，PLT 11～27（19.4±4.5）×109/L；體質(zhì)量47.5～82.3（66.3±12.2）kg。兩組基線資料對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)臨床癥狀、血小板檢測等確診；初發(fā)確診，初次接受治療；年齡18～70歲，性別不限；10×109/L≤PLT＜30×109/L，非重癥ITP；無阿法骨化醇和潑尼松使用禁忌證；近3個(gè)月內(nèi)無免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等相關(guān)治療史；自愿簽訂知情同意書；無神經(jīng)、行為障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并病毒［如乙型肝炎病毒（HBV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）等］感染者；哺乳或哺乳期婦女；繼發(fā)免疫性血小板減少癥；血小板減少由其他因素（如各種惡性血液病、骨髓增生異常綜合征、腫瘤骨髓浸潤等）所致者；肝腎等重要臟器功能不全者；伴有凝血功能障礙性疾??；既往有脾切除手術(shù)史。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（k194717）。

1.2 阿法骨化醇及潑尼松的應(yīng)用方法對照組：口服醋酸潑尼松片（吉林長白山藥業(yè)，規(guī)格5 mg/片，產(chǎn)品批號20171005、20190413、20200507）治療，以1 mg/（kg·d）為起始劑量（最大日劑量80 mg），分3次服用，起效后應(yīng)盡快減量至最小維持量（＜15 mg/d），并于6～8周內(nèi)停用。在對照組基礎(chǔ)上，觀察組：口服阿法骨化醇軟膠囊（南通華山藥業(yè)，規(guī)格0.5 μg/粒，產(chǎn) 品 批 號20170904、20181203、20200106）治 療，0.5 μg/次，1次/d。連續(xù)治療6周后評價(jià)兩組療效。

1.3觀察指標(biāo)及檢測方法①臨床療效：參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行療效評估。治療后PLT≥100×109/L且無出血表現(xiàn)者為“完全反應(yīng)（CR）”。治療后PLT≥30×109/L（或增加幅度≥2倍基礎(chǔ)PLT），且無出血表現(xiàn)者為“有效（R）”。治療后PLT＜30×109/L，或治療后PLT增加幅度＜2倍基礎(chǔ)PLT，或有出血者為“無效（NR）”?？傆行剩剑–R+R）/總例數(shù)×100%。②外周血PLT：治療前及治療2、4、6周時(shí)抽取受試者外周靜脈血，取1 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管內(nèi)，應(yīng)用江蘇英諾華公司產(chǎn)的HB-7501型血細(xì)胞分析儀行血常規(guī)檢查，觀察PLT變化情況。③外周血淋巴細(xì)胞VDR：治療前和治療6周時(shí)取2 mL外周靜脈血置于肝素鈉抗凝管內(nèi)，使用淋巴細(xì)胞提取法和裂解法及酶聯(lián)免疫法（試劑盒均購自上海邦景實(shí)業(yè)）檢測外周血淋巴細(xì)胞中VDR表達(dá)水平，儀器為北京普朗公司產(chǎn)的DNM-9602G型酶標(biāo)儀。④外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、輔助性T細(xì)胞（Th）17比例：治療前和治療6周時(shí)采用美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)的DxFLEX型流式細(xì)胞儀檢測外周血Treg、Th17比例，并計(jì)算Treg與Th17比值（Treg/Th17），實(shí)驗(yàn)所需抗體均購自武漢艾美捷科技。⑤血清1，25-雙羥維生素D3［1，25（OH）2D3］、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和干擾素-γ（IFN-γ）水平：治療前和治療6周時(shí)取5 mL外周靜脈血離心分離血清，選用酶標(biāo)儀（廠家和型號同上）及酶聯(lián)免疫法（試劑盒均由武漢菲恩生物提供）測定血清1，25（OH）2D3、HMGB1和IFN-γ，操作步驟均按說明書。⑥治療期間統(tǒng)計(jì)兩組不良反應(yīng)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用成對樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床療效比較觀察組CR 26例、R 12例、NR 2例，總有效率95.00%，對照組CR 18例、R 12例、NR 10例，總有效率75.00%，觀察組臨床療效總有效率比對照組高（P＜0.05）。

2.2 兩組治療前后不同時(shí)點(diǎn)外周血PLT比較兩組治療2、4、6周時(shí)外周血PLT升高，且均高于治療前（P均＜0.05），以觀察組為著P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組治療前后不同時(shí)點(diǎn)外周血PLT比較（×109/L，±s）

表1 兩組治療前后不同時(shí)點(diǎn)外周血PLT比較（×109/L，±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0.05；與對照組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05。

組別觀察組對照組n 40 40 PLT治療前19.65±4.97 20.24±5.27治療2周58.21±7.13*#42.47±6.22*治療4周78.34±8.78*#62.73±7.05*治療6周93.42±11.23*#78.23±9.75*

2.3 兩組治療前后血清1，25（OH）2D3和外周血淋巴細(xì)胞VDR水平比較兩組治療后血清1，25（OH）2D3水平均較治療前升高（P＜0.05），外周血淋巴細(xì)胞VDR水平均較治療前降低（P＜0.05），以觀察組為著（P＜0.05），詳見表2。

表2 兩組治療前后血清1，25（OH）2D3和外周血淋巴細(xì)胞VDR水平比較（±s）

表2 兩組治療前后血清1，25（OH）2D3和外周血淋巴細(xì)胞VDR水平比較（±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0.05；與對照組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05。

組別觀察組治療前治療后對照組治療前治療后n 40 40 1，25（OH）2D3（μg/L）61.23±12.34 82.74±14.05*#60.86±11.97 70.23±12.43*VDR（nmol/L）221.34±61.23 152.34±47.55*#218.95±57.34 184.32±50.48*

2.4 兩組治療前后外周血Treg、Th17比例比較觀察組治療后外周血Treg比例較治療前升高（P＜0.05），對照組治療前后比較，P＞0.05。兩組治療后外周血Th17比例均較治療前下降（P＜0.05），Treg/Th17均較治療前升高（P＜0.05），且以觀察組更顯著（P均＜0.05），詳見表3。

表3 兩組治療前后外周血Treg、Th17、Treg/Th17比較（±s）

表3 兩組治療前后外周血Treg、Th17、Treg/Th17比較（±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0.05；與對照組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05。

組別觀察組治療前治療后對照組治療前治療后n 40 40 Treg（%）2.42±0.91 3.56±1.07*#2.45±0.84 2.67±0.95 Th17（%）3.84±0.84 2.24±0.62*#3.87±0.92 2.72±0.70*Treg/Th17 0.63±0.14 1.59±0.35*#0.64±0.12 0.98±0.28*

2.5 兩組治療前后血清HMGB1、IFN-γ水平比較兩組治療后血清HMGB1、IFN-γ水平均較治療前降低（P均＜0.05），且均以觀察組的下降顯著（P均＜0.05）。見表4。

表4 兩組治療前后血清HMGB1、IFN-γ水平比較（±s）

表4 兩組治療前后血清HMGB1、IFN-γ水平比較（±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0.05；與對照組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05。

組別觀察組治療前治療后對照組治療前治療后n 40 40 HMGB1（ng/mL）68.87±11.34 48.53±6.31*#67.25±10.92 55.82±8.34*IFN-γ（pg/mL）28.23±4.25 17.23±3.12*#27.94±3.96 23.04±3.25*

2.6 兩組不良反應(yīng)比較觀察組類庫欣綜合征癥狀1例，血糖升高1例，胃腸道不適2例，不良反應(yīng)總發(fā)生率10.00%，對照組類庫欣綜合征癥狀2例，血糖升高2例，上呼吸道感染1例，胃腸道不適4例，皮疹/瘙癢1例，不良反應(yīng)總發(fā)生率25.00%，兩組不良反應(yīng)總發(fā)生率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

研究［7］表明，維生素D可通過多種途徑對人體免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，維生素D缺乏參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性紫癜、1型糖尿病等多種自身免疫性疾病的病理生理過程。維生素D在人體中主要以25-羥維生素D3［25（OH）D3］的形式存在，25（OH）D3在1α-羥化酶的催化作用下生成的1，25（OH）2D3是最重要的維生素D活性代謝產(chǎn)物。人體內(nèi)與免疫功能有關(guān)的細(xì)胞大多含有VDR，而維生素D的免疫調(diào)節(jié)作用是通過1，25（OH）2D3與VDR結(jié)合發(fā)揮的。劉金梅等［8］研究顯示，ITP患者的血清25（OH）D3及1，25（OH）2D3水平均顯著低于健康人群，VDR信使核糖核酸（mRNA）呈高表達(dá)狀態(tài)，且25（OH）D3、1，25（OH）2D3與VDR mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。其原因考慮是ITP患者機(jī)體內(nèi)存在細(xì)胞免疫功能紊亂，B細(xì)胞功能亢進(jìn)造成維生素D活性代謝物減少，VDR表達(dá)增多，反過來又會(huì)加重B細(xì)胞功能亢進(jìn)，增加B細(xì)胞數(shù)量，形成惡性循環(huán)。因此，通過外源性補(bǔ)充維生素D及其活性類似物可能對于ITP患者具有一定的治療作用。阿法骨化醇是維生素D活性代謝物之一，不能直接與VDR結(jié)合，本身無活性，但在服用后經(jīng)腸道吸收入血，經(jīng)肝臟微粒體CYP2R1（維生素D羥化酶）作用使側(cè)鏈25位羥基化后形成具有活性的1，25（OH）2D3，與VDR結(jié)合發(fā)揮作用［9］。本研究中，觀察組患者在潑尼松治療基礎(chǔ)上聯(lián)合阿法骨化醇治療后血清1，25（OH）2D3水平較治療前顯著升高，外周血淋巴細(xì)胞VDR水平較治療前顯著降低，且這兩項(xiàng)指標(biāo)的改善程度均顯著大于對照組。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［10］表明，通過靜脈注射1，25（OH）2D3能進(jìn)一步提高ITP模型小鼠的PLT，降低出血傾向，促進(jìn)骨髓血小板生成。

ITP的病因病機(jī)十分復(fù)雜，除了體液免疫異常外，細(xì)胞免疫異常也可造成自身免疫紊亂，誘導(dǎo)ITP的發(fā)生，其中CD4+T細(xì)胞為主要參與細(xì)胞。CD4+T淋巴細(xì)胞亞型漂移，包括Th1/Th2、Treg/Th17免疫失衡在ITP的發(fā)病及病情進(jìn)展中起著重要作用。研究［11］表明，ITP患者的外周血Treg細(xì)胞比例較正常人更低，Th17細(xì)胞比例更高，處于Treg/Th17免疫失衡狀態(tài)。Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞新亞型，能特異性分泌白細(xì)胞介素（IL）-17，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等生成腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6等大量炎性因子，誘發(fā)或加重炎癥反應(yīng)。IL-17還可與其他細(xì)胞因子相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞浸潤與組織破壞，參與腫瘤、感染、自身免疫疾病的病理生理過程。Treg細(xì)胞是抑制性T細(xì)胞的一種功能亞群，可通過抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)、抑制T細(xì)胞活化、促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子的分泌等，維持免疫系統(tǒng)對自身免疫的耐受。Treg/Th17免疫平衡紊亂在ITP等多種自身免疫性疾病的發(fā)病中起著重要作用［12］。CD4+CD25+是Treg細(xì) 胞 的 主 要 表 型，而1，25（OH）2D3對于T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用靶點(diǎn)即是CD4+T細(xì)胞。報(bào)道［13］顯示，通過補(bǔ)充阿法骨化醇能有效下調(diào)外周血Th17細(xì)胞比例，上調(diào)外周血Treg細(xì)胞比例，調(diào)節(jié)過敏性紫癜患兒外周血Treg/Th17免疫平衡。本研究結(jié)果顯示，觀察組治療后外周血Th17比例較治療前顯著降低，外周血Treg比例以及Treg/Th17均較治療前顯著升高，且改善程度均顯著大于對照組。提示，在潑尼松治療基礎(chǔ)上聯(lián)合阿法骨化醇治療能有效糾正外周血Treg/Th17免疫平衡紊亂，改善成人初發(fā)確診ITP患者的細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)病情恢復(fù)。

HMGB1是一種高度保守的脫氧核糖核酸（DNA）結(jié)合核蛋白，廣泛存在于各種真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定時(shí)，其處于細(xì)胞核內(nèi)，但當(dāng)存在外界刺激時(shí)，可致細(xì)胞核內(nèi)HMGB1賴氨酸乙?；?，促使HMGB1釋放至細(xì)胞核外。HMGB1早期被證實(shí)是一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，致炎活性強(qiáng)，參與了膿毒癥等多種炎癥性疾病的病理生理過程，且其血清表達(dá)水平與膿毒癥、休克、創(chuàng)傷等疾病的病情進(jìn)展密切相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)，HMGB1還可介導(dǎo)各種自身免疫性疾病的發(fā)病及病情進(jìn)展過程，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的血清以及關(guān)節(jié)滑膜中呈異常高表達(dá)狀態(tài)，部分伴隨TNF-α、IL-17等促炎因子水平升高，并可影響Treg/Th17免疫平衡，促使疾病進(jìn)展［14］。楊晶等［15］研究顯示，ITP患者外周血HMGB1表達(dá)與Th17細(xì)胞以及IL-17水平呈正相關(guān)，與Treg細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，血清HMGB1高表達(dá)可能抑制了Treg細(xì)胞的抗炎能力，致使疾病進(jìn)展，由HMGB1高表達(dá)誘導(dǎo)的Treg/Th17免疫失衡可能是引發(fā)ITP的重要機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，兩組治療后血清HMGB1水平均較治療前顯著降低，但以觀察組的改善更顯著，且觀察組調(diào)控外周血Treg/Th17免疫平衡的效果亦更顯著。提示，阿法骨化醇聯(lián)合潑尼松治療能進(jìn)一步下調(diào)成人初發(fā)確診ITP患者血中HMBG1的表達(dá)水平，促進(jìn)炎癥緩解，并糾正Treg/Th17免疫失衡。IFN-γ是一種具有廣泛免疫調(diào)節(jié)作用的淋巴因子，主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生。Th1/Th2細(xì)胞失衡在自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展中同樣起著重要作用，Th細(xì)胞分化失衡是造成ITP免疫紊亂的另一重要原因。田勇等［16］研究得出，ITP患者血清IFN-γ水平較健康人群顯著升高，IFN-γ可能參與了ITP的發(fā)病及病情進(jìn)展過程。本研究通過檢測兩組患者治療前后的血清IFN-γ水平得出，兩組治療后血清IFN-γ水平均降低，且觀察組治療后血清IFN-γ水平低于同期對照組。提示，阿法骨化醇聯(lián)合潑尼松治療能進(jìn)一步抑制成人初發(fā)確診ITP患者血中IFN-γ的表達(dá)，從而有利于調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，促進(jìn)ITP病情緩解。本研究中，觀察組治療總有效率為95.00%，顯著高于對照組。即在潑尼松治療基礎(chǔ)上聯(lián)合給予阿法骨化醇治療能顯著提高ITP的治療效果。同時(shí)觀察組不良反應(yīng)率為10.00%，低于對照組的25.00%。提示，該聯(lián)合治療方案有助于減少成人初發(fā)確診ITP患者不良作用的發(fā)生；究其原因可能與阿法骨化醇的使用對迅速穩(wěn)定患者病情有積極作用，能使患者盡快將激素減量至最小維持量，盡可能減少激素用量，進(jìn)而降低不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但兩組不良反應(yīng)率對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能與本研究樣本量較少有關(guān)。

綜上所述，與單用潑尼松治療相比，阿法骨化醇聯(lián)合潑尼松治療成人初發(fā)確診ITP能進(jìn)一步提高臨床療效，其作用可能與該聯(lián)合治療方案能顯著提高血清1，25（OH）2D3水平，下調(diào)外周血淋巴細(xì)胞VDR表達(dá)以及降低血清HMGB1、IFN-γ水平，調(diào)節(jié)外周血Treg/Th17免疫平衡有關(guān)。但本研究結(jié)論期待大樣本、多中心的前瞻性隨機(jī)對照研究進(jìn)一步驗(yàn)證和補(bǔ)充。