江西省青錢柳自然居群的群體遺傳結(jié)構(gòu)與基因流研究

劉亞林，葉林江，寇一翾，范鄧妹，張志勇，程珊梅*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，江西 南昌 330045；2.景德鎮(zhèn)學院 生物與環(huán)境工程學院，江西 景德鎮(zhèn) 333400）

【研究意義】青錢柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk.]隸屬于胡桃科青岡屬（Cyclocarya），是中國特有的單種屬植物[1]，廣泛分布于江西、浙江、江蘇等省[2]。青錢柳為風媒傳粉，樹干通直；果具圓形翅，形似串串銅錢，有很高的庭院觀賞價值；其葉味甘，具有顯著的降血糖功效[3]。它是一種集藥用、保健、用材和觀賞等價值于一身的多用途樹種，在國內(nèi)多地被推廣種植[4-5]。青錢柳具有與地理環(huán)境密切相關(guān)的遺傳多樣性和遺傳分化[6-7]，同時江西省被認為是青錢柳的冰期避難所之一[8]，江西省青錢柳自然居群分布廣泛，有較高的遺傳多樣性。江西省三面環(huán)山，北部的鄱陽湖盆地，中部的丘陵低山和平原，使其整體呈現(xiàn)出一個開口朝北的“簸箕”狀，地理位置較為獨立，是一個研究小尺度基因流的理想生態(tài)單元。【前人研究進展】近年來對青錢柳遺傳背景的研究較少，且主要集中在探究其大尺度范圍遺傳分化、不同種源的遺傳多樣性和遺傳馴化方面。周一旸等[9]利用SRAP 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)青錢柳各種源種群間變異大，同時種源內(nèi)也高度分化。Kou 等[8]綜合葉綠體和核基因兩種遺傳標記，得出青錢柳有很長的進化歷史，具有武夷山脈和云貴高原東側(cè)兩個冰期避難所。陳秀娟等[10]利用ISSR 分子標記，對青錢柳種質(zhì)資源進行親緣關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)青錢柳種質(zhì)在長期的適應和進化過程中形成了廣泛的遺傳變異，個體間遺傳差異大。Li等[11]利用ISSR 和SSR 分子標記發(fā)現(xiàn)青錢柳群體間遺傳分化較低，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)。

【本研究切入點】綜合前人研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳有高度的種內(nèi)分化，這與地理環(huán)境密切相關(guān)。但前人研究主要是在全國范圍探討其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，并未關(guān)注到獨特的小區(qū)域中的遺傳分化，尤其是小尺度的基因流。而江西省周圍山脈是與鄰省的自然地理界線，能夠隔絕大量外界基因流的干擾，是研究這些問題的一個理想的獨立生態(tài)單元。分子標記受生理條件和環(huán)境因素的影響較小，近年來開發(fā)出許多評估遺傳多樣性和進化關(guān)系的分子標記，如RFLP、AFLP、ISSR 和SSR 等標記[12]。SSR 標記具有共顯性、效率高、可重復等突出優(yōu)點，是鑒定種源多樣性的理想分子標記[13]。Fan 等[14]為青錢柳開發(fā)了28 對SSR 引物，本研究以此為基礎(chǔ)開展試驗?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究江西省青錢柳居群的遺傳分化和基因流方向，能夠獲得大量有關(guān)青錢柳居群遺傳多樣性和自然演替的信息。由此能夠闡明獨立生態(tài)單元中青錢柳的基因流和遺傳分化趨勢，地理環(huán)境和氣候變化對種群內(nèi)和種群間多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的影響[15]，進而選出適應江西省氣候的廣適性青錢柳種源，為其今后的育種和藥用提供資源支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和總DNA提取

研究樣品采集于江西省境內(nèi)26個青錢柳的自然居群（表1），共283份樣品。每個居群均在1 km×1 km的范圍內(nèi)采集，每棵植株均采取健康幼嫩葉片并立即用硅膠干燥，同時記錄詳細采集信息，帶回實驗室-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 江西省青錢柳自然居群樣品信息[17]Tab.1 The sample information of Cyclocarya paliurus in Jiangxi Province

采用改良CTAB 方法，從已經(jīng)被硅膠干燥的葉片組織中提取總DNA[16]。在10 g/L 瓊脂糖凝膠中，通過與已知標準lambda DNA 進行比較來評估分離DNA 的濃度。然后，將分離的基因組DNA 稀釋并保存在4 ℃下進行PCR擴增。

1.2 微衛(wèi)星引物和PCR擴增

挑選來自不同居群的24份DNA樣品，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，從已開發(fā)的青錢柳微衛(wèi)星引物中篩選出8 對清晰的多態(tài)引物（表2）。利用篩選出來的8 對引物對青錢柳26 個居群的283 個個體進行PCR。在每個正向引物序列的5'端附加一個M13（5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3'）引物，用熒光標簽標記（FAM/TAM，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）。PCR 產(chǎn)物通過毛細管電泳分離，使用ABI 3730 XL自動測序儀（美國應用生物系統(tǒng)公司），以LIZ-500為內(nèi)標。使用Gene Mapper v.4.0軟件（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）分析色譜圖。后續(xù)分析時為了避免誤差，將刪除樣品數(shù)少于3的居群。

表2 青錢柳8對微衛(wèi)星引物[14]Tab.2 Characteristics of eight microsatellite primers in the Cyclocarya paliurus

1.3 數(shù)據(jù)分析

GeneMarker v2.2.0 軟件[18]根據(jù)每個熒光標記、序列長度定義等位基因，讀取并記錄每個等位基因的大小。利用GENEPOP v.3.4 軟件[19]進行Hardy-Weinberg 平衡和連鎖不平衡（LD）檢測，并對其顯著性水平進行Bonferroni 校正[20]。使用GenAlEx v6.5[21]計算了各位點的Shannon 多樣性指數(shù)（I）、觀測雜合度（HO）、期望雜合度（HE）和基因流（Nm），以及居群平均等位基因數(shù)（NA）和有效等位基因數(shù)（NE）。用Cervus v3.0.7 計算各位點多態(tài)信息含量（PIC）[22]。Arlequin v3.11 軟件[23]進行F-統(tǒng)計[24]以計算各居群近交系數(shù)（FIS）、遺傳分化系數(shù)（FST）值。

STRUCTURE 2.3.4 軟件[25]分析試驗材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)，使用100 000 個循環(huán)，10 000 個MCMC 重復，應用混合祖先模型，K值范圍為1到10，每個值迭代10次。利用網(wǎng)站程序structure Harvester，根據(jù)ΔK值確定最佳種群結(jié)構(gòu)和亞群數(shù)（http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/）。通過POPGENE v1.32軟件[26]，基于Nei’距離構(gòu)建UPGMA樹?；赟TRUCTURE和UPGMA樹分組結(jié)果，對所有進行分組，使用GenAlEx v6.5進行主成分分析（PCoA）。

為了比較現(xiàn)代和歷史時期的遷移率，使用了BAYESASS 3.4.0[27]和Migrate v3.6.8[28]軟件。這兩個程序都會生成參數(shù)，從中可以推斷出基因流遷移率的可比測量值（m：每代由遺傳移民組成的人口比例）。但每一個程序都會在不同的時間尺度上估計該參數(shù)：BAYESASS 使用貝葉斯方法和MCMC 抽樣來生成m值，Migrate通過貝葉斯法推測突變比例遷移率（m）。Migrate v3.6.8使用合并法來估計成對種群之間的相對有效種群大?。é龋?。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

對江西青錢柳的居群-位點組合（176個）進行哈迪溫伯格平衡（HWE）檢測，以及在各自的居群水平對每個微衛(wèi)星位點對（28個位點對）進行連鎖不平衡（LD）分析。結(jié)果經(jīng)校正后[20]，13個居群-位點組合偏離HWE平衡（P＜0.05），1個位點對存在連鎖不平衡現(xiàn)象。

8 個微衛(wèi)星位點在江西省青錢柳自然居群277 個個體中共檢測到81 個等位基因，每個位點的等位基因數(shù)為7～15 個，平均為10.125；平均觀測雜合度（HO）為0.610；平均期望雜合度（HE）為0.597；平均Shannon 多樣性指數(shù)（I）為1.178；平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.664（表3）。

表3 青錢柳在8個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性Tab.3 Summary of genetic statistics and gene flow of eight loci in the Cyclocarya paliurus

各居群的平均等位基因數(shù)（NA）從2.375（居群GX）至6.500（居群LC），平均值為4.875。觀測雜合度（HO）和期望雜合度（HE）居群間差異不大，變化范圍分別為0.467（居群XS）～0.750（居群JA）和0.441（居群GX）～0.664（居群YH 和LC），見表4。以上數(shù)據(jù)表明，江西省青錢柳自然居群遺傳多樣性水平中等偏高，各居群遺傳多樣性差異不大。

表4 青錢柳22個居群在8個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性Tab.4 Genetic diversity of Cyclocarya paliurus from 22 populations using eight SSR primers

2.2 江西省青錢柳自然居群遺傳結(jié)構(gòu)

各居群的遺傳分化系數(shù)（FST）差異很小，變化范圍是0.093～0.102，平均值為0.097（表4）。根據(jù)對種群分化系數(shù)的劃分[17]，江西省青錢柳自然居群間為中度分化。江西省青錢柳居群內(nèi)近交系數(shù)（FIS）除居群XS（0.207）和JX（0.110）為顯著，居群SQS（0.163）為極顯著和居群LC（0.184）為極其顯著，其他居群近交不顯著，平均近交系數(shù)為0.029（表4）。

對江西省青錢柳的22 個自然居群進行Structure 聚類分析，根據(jù)ΔK的評判結(jié)果，確認K=3 為最佳分組數(shù)（圖1）。雖然江西省境內(nèi)的青錢柳居群的遺傳組分為3組，但它們在大部分居群間存在基因滲入現(xiàn)象，組分間未完全分開。不同組分在地理分布上有一定的規(guī)律，紅色類型的遺傳組分較多分布在江西的西北部，黃色的遺傳組分主要分布在江西中部，而綠色的遺傳組分主要分布在江西的東南部（圖1a）。Nei’距離的UPGMA 樹聚類結(jié)果與青錢柳居群的地理分布位置有一定關(guān)系（圖2a），與Structure 聚類結(jié)果也有一定相似。

圖1 基于8對微衛(wèi)星引物的江西青錢柳自然居群Structure分析Fig.1 Natural population structure analysis of C.paliurus in Jiangxi Province based on 8 pairs of microsatellite primers

基于Structure 和UPGMA 樹聚類分析結(jié)果（圖1，圖2a），將22 個居群分為3 組，分別為居群內(nèi)主要為紅色遺傳組分的為N1（包括9個群體，分別為FX、TG、WYs、XS、FY、CY、SQS、LS、YF）、主要為黃色遺傳組分的為N2（包括7 個群體，分別為GuiX、HJ、JA、SC、AF、JX、SY）、主要為綠色遺傳組分的為N3（包括6 個群體，分別為YH、GX、WYd、LC、JGS、GF）。將這3組進行主成分分析（PCoA），它們在坐標上有聚類傾向（圖2b），與Structure不同遺傳組分的分組和分布格局相符合。

圖2 基于8對微衛(wèi)星引物遺傳距離數(shù)據(jù)構(gòu)建的江西青錢柳自然居群聚類分析Fig.2 Cluster analysis of natural populations of C.paliurus in Jiangxi Province based on genetic distance data of 8 pairs of microsatellite primers

2.3 居群間基因流

江西青錢柳自然居群之間的基因流，除位點CYC055（0.980）外，其他位點檢測出的基因流（Nm）都大于1，并且平均基因流為1.733（表3），說明居群間的現(xiàn)代基因流較大，每代有一個以上的移民。同時，通過Migrate 軟件估算，發(fā)現(xiàn)3 個組之間的歷史基因流遷移率和現(xiàn)代基因流遷移率都較大，變化范圍分別為0.002 7～0.020 5和0.004 5～0.062 8（圖3）。

圖3 江西青錢柳3個組之間的歷史基因流遷移率（紅色箭頭）和現(xiàn)代基因流遷移率（黑色箭頭）Fig.3 Historical gene flow mobility（red arrow）and modern gene flow mobility（black arrow）between the three groups of C.paliurus in Jiangxi Province

現(xiàn)代基因流遷移率與歷史基因流遷移率相比較大，且3 個組分之間存在不對稱的雙向基因流（圖3）。N1 組的現(xiàn)代基因流遷移率向其他兩組遷出量遠比遷入量小得多。而N2 組的歷史基因流遷移率由其他兩組向N2 組遷入較強，現(xiàn)代基因流遷移率向其他兩組遷出較強。N3組的歷史基因流遷移率向其他兩組遷出較強，但現(xiàn)代基因流遷移率中兩兩組分之間N2 向N3 遷入較強，N3 向N1 遷入較強。N1、N2 和N3 組的有效種群大?。é龋┓謩e為1.32、1.68 和2.07（圖3）。

以上數(shù)據(jù)表明，江西省青錢柳歷史和現(xiàn)代基因交流頻繁，并且現(xiàn)代更顯著。從歷史和現(xiàn)代的基因流可以看出，N1 組種群在歷史上是擴張的，而在現(xiàn)代是收縮的；N2 組居群在歷史上是收縮的，現(xiàn)代是擴張的；N3組居群雖然有效種群最大，但它受到N2組較強的基因滲入，進而開始滲入N1組。

3 結(jié)論與討論

3.1 整體上較高水平的遺傳多樣性

基于SSR 分子標記，本研究在江西省青錢柳自然群體中檢測到高水平的多態(tài)性（HE=0.597、I=1.178）（表3），與李曉春等[11]利用SSR 標記得出的青錢柳遺傳多樣性（HE=0.404、I=0.626）相比較高，其原因與研究采用的標記數(shù)量、采樣范圍和材料個體數(shù)量有關(guān)。但陳秀娟等[10]利用ISSR 和周一旸等[9]利用SRAP 標記都得出了青錢柳種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性的結(jié)論，與本研究結(jié)果相符。青錢柳的異二歧開花習性（青錢柳的自然群體中有兩種交配類型）[29]，可能是導致自然居群遺傳多樣性水平較高的原因之一。整體上江西青錢柳自然居群間遺傳多樣性水平差異不大，但居群GX 遺傳多樣性相比較?。℉E=0.441）（表4），推測這與GX居群采樣數(shù)較少有關(guān)。

3.2 江西省青錢柳自然居群的遺傳結(jié)構(gòu)與基因流

平均Nm 大于1，大部分居群近交不明顯，原因可能是青錢柳花粉和種子的傳播能力較強，并且江西省中部較多的盆地和平原為不同居群的基因交流提供了條件。但少數(shù)存在輕微的近交，如居群LC、SQS和XS，推測可能由于野生青錢柳多處于深山或保護區(qū)內(nèi)，居群被郁閉的森林環(huán)境和山脈遮擋，導致花粉和種子傳播受到影響。

Structure、UPGMA 樹和主成分分析（PCoA）聚類分析結(jié)果表明江西省青錢柳自然居群的遺傳組分為3 組，N1、N2 和N3，有一定的地理分布規(guī)律，大部分居群間存在基因滲入。Migrate 軟件分析得出現(xiàn)代基因流遷移率與歷史基因流遷移率相比較大，且3個組分之間存在不對稱的雙向基因流。并且從歷史和現(xiàn)代的基因流遷移率可以看出，N1組種群在歷史上是擴張的，而在現(xiàn)代是收縮的；N2組居群在歷史上是收縮的，現(xiàn)代是擴張的；N3 組居群雖然有效種群最大，但它受到N2 組較強的基因滲入，進而開始滲入N1組。結(jié)合江西省內(nèi)青錢柳居群的遺傳結(jié)構(gòu)和基因流結(jié)果，筆者推測江西省青錢柳自然居群存在中部和南部種群向北部基因滲入遷移的趨勢，同時中部種群利用地理優(yōu)勢迅速向四周擴散。

江西省青錢柳自然居群遺傳組分為3 組，歷史和現(xiàn)代基因流共同作用，導致形成當代較高水平的遺傳多樣性。江西省中部主要為盆地和平原，為居群間的基因交流減少了阻礙，導致居群間分化不明顯，遺傳結(jié)構(gòu)不清晰，但也使得該物種在這個獨特的生態(tài)單元中表現(xiàn)出高水平的遺傳多樣性（尤其是西北部）?；蛟S從環(huán)境適應性的角度來看，江西省南部居群具有優(yōu)勢，然而中部居群憑借基因流向四周迅速擴散的成效已經(jīng)十分明顯。

3.3 江西省青錢柳種質(zhì)資源的保護與開發(fā)

大量研究發(fā)現(xiàn)青錢柳藥用價值與種源密切相關(guān)[7]，保護自然種質(zhì)資源有利于其藥用價值的進一步研究。近年來基于青錢柳資源利用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，使得培育的人工林范圍不斷擴大，該樹種擺脫了瀕危的處境。但青錢柳自然居群是物種遺傳多樣性的基礎(chǔ)，是其種質(zhì)資源的源頭。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)該樹種多以單株形式分布，大部分群體內(nèi)個體數(shù)較少，種質(zhì)資源的保護開發(fā)迫在眉睫。并且由于其木材價值較高，近年來自然群體中成年大樹遭受了嚴重的砍伐，導致部分居群內(nèi)個體數(shù)量減少。同時青錢柳是一個喜陽樹種，但部分個體分布在郁閉的深林，嚴重制約了該物種的自然更新。

根據(jù)該物種在江西省的遺傳背景，結(jié)合其面臨的嚴峻形勢，提出了以下科學保護建議。青錢柳江西省各居群具有較多遺傳分化，對大部分種群實施就地保護可以使其維持進化潛力[6,30]。同時對不同人群，尤其是青少年，普及珍稀動植物保護知識的工作可有效保護現(xiàn)存居群個體。針對深林和單個形式分布的個體，可以采取開辟林窗和人工傳粉等方法解決該物種自然更新困難的問題，擴大種群個體數(shù)量[31]。而對于開發(fā)種質(zhì)資源，可選取遺傳多樣性水平高的種群材料，如居群YH 和LC；東南部居群（尤其是居群GF）在環(huán)境適應性上具有優(yōu)勢，可開發(fā)為廣適性種源。

致謝：江西省教育廳科學技術(shù)研究一般項目（GJJ170248）同時對本研究給予了資助，謹致謝意！