南城淮山脫毒苗培養(yǎng)及扦插繁種研究

王葡萄，孫靜宇，單 楠，朱強龍，肖 遙，張宏玉，陳 欣，胡 銳，黃英金*，周慶紅*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省薯芋生物學(xué)重點實驗室，江西 南昌 330045）

【研究意義】山藥（DioscoreaL.）為薯蕷科薯蕷屬攀緣草本植物，其地下塊莖營養(yǎng)豐富、藥用價值高，是糧、菜、藥兼用的特色經(jīng)濟作物[1]。江西是我國道地山藥的主產(chǎn)區(qū)之一，出產(chǎn)的山藥品質(zhì)上乘，南城淮山是江西省傳統(tǒng)名優(yōu)地方山藥品種，2011年獲全國農(nóng)產(chǎn)品地理標志，其產(chǎn)地南城縣也是中國三大淮山生產(chǎn)地之一[2]。南城淮山光條和淮山飲片是“建昌幫”中藥體系中的當家藥材，產(chǎn)品遠銷東南亞及港臺地區(qū)[3]。然而，由于南城淮山長期以地下塊莖做種，植株病毒累積，造成山藥種性不斷退化、產(chǎn)量和品質(zhì)逐年下降，塊莖商品率低，嚴重影響了種植戶的積極性[4]。另外南城淮山以可食用部位繁種，成本高，投入大，從而制約了南城淮山的種植規(guī)模和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。開展南城淮山脫毒苗培養(yǎng)及扦插繁種研究，構(gòu)建其脫毒種薯繁殖技術(shù)體系，可為南城淮山種性恢復(fù)和健康種薯快繁、工廠化生產(chǎn)提供重要技術(shù)支撐。【前人研究進展】現(xiàn)已報道的侵染山藥植株的病毒種類主要有山藥壞死花葉病毒（yam necrotic mosaic virus YNMV）、山藥溫和花葉病毒（Yam mild mosaic virus YMMV）、日本山藥花葉病毒（Japanese yam mosaic virus JYMV）、馬鈴薯Y 病毒（Potato virus Y PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus PLRV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus CMV）等[5-7]，病毒一般通過粉蚧、蚜蟲和機械損傷傳播[8-9]，感染病毒的山藥植株葉片通常表現(xiàn)為脈間花葉、卷曲和發(fā)育不良等，從而導(dǎo)致山藥塊莖產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[10-11]。目前，防治植物病毒病最經(jīng)濟有效的途徑是采用莖尖培養(yǎng)獲得無病毒種苗。對山藥植株莖尖進行離體培養(yǎng)，獲得脫毒試管苗，利用脫毒苗繁殖健康種薯，是解決山藥病毒病的根本方法之一[12]。

【本研究切入點】近年來，研究人員對鐵棍山藥、惠樓山藥、佛手山藥等地方山藥品種開展了莖尖脫毒培養(yǎng)相關(guān)研究[13-16]，表明不同地方品種莖尖脫毒培養(yǎng)條件和培養(yǎng)效果存在較大差異。此外，通過誘導(dǎo)愈傷組織分化產(chǎn)生叢生芽是實現(xiàn)試管苗增殖的常用方法，但一般培養(yǎng)周期長，且常常發(fā)生性狀的遺傳變異[17]。白玉娥等[18]、張映卿等[19]以腋芽為外植體進行微扦插研究，結(jié)果表明試管苗生長速度快，繁殖系數(shù)高，且遺傳穩(wěn)定性好；再者，扦插技術(shù)被廣泛應(yīng)用于作物的快速無性繁殖，近幾年研究人員也在陸續(xù)探索山藥的扦插繁種技術(shù)[20-21]，為節(jié)省山藥塊莖生產(chǎn)用種開辟了一條新途徑?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為解決南城種源帶病毒導(dǎo)致種性退化，缺乏脫毒快繁技術(shù)體系等問題，本研究以江西名優(yōu)特色山藥品種南城淮山為研究對象，系統(tǒng)開展其莖尖脫毒培養(yǎng)、脫毒苗微扦插快繁、帶葉莖節(jié)扦插繁種等研究，旨在為南城淮山脫毒健康種薯獲得以及工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

選取江西農(nóng)業(yè)大學(xué)山藥種質(zhì)資源圃中南城淮山的健壯植株，取其莖蔓腋芽（圖1a，圖1b）為外植體。

1.2 方法

1.2.1 莖尖脫毒培養(yǎng) 將南城淮山藤蔓腋芽切下，自來水快速沖洗干凈，置于超凈工作臺上，無菌水沖洗1 次，體積分數(shù)為75%乙醇浸泡30 s，無菌水洗3～4 次，質(zhì)量分數(shù)為0.1% HgCl2消毒8 min 后，無菌水重復(fù)洗3～4 次，于解剖鏡下將山藥莖尖由外到內(nèi)剝離至0.2～0.3 mm 大小，隨后將剝離的莖尖（圖1c）分別接種在添加有0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA、1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種20 個，3 次重復(fù)，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計莖尖的成活率與成苗率。

1.2.2 試管苗病毒檢測與繼代增殖 隨機選取大田種植的南城淮山葉片與莖尖培養(yǎng)的試管苗葉片（90 d），利用RNA 提取試劑盒（北京寶日生物科技有限公司）提取RNA，參考TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA 合成。

參照前人報道[22-26]設(shè)計相關(guān)病毒檢測引物（北京擎科生物技術(shù)有限公司合成）。PCR總體系為20μL：10μL 2X TSingKe Master mix，2μL cDNA，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，7μL dd H2O。95 ℃5 min；95 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存。通過PCR 擴增得到的PCR 產(chǎn)物，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照（表1）。

表1 山藥病毒類型及引物Tab.1 Virus types and primers of yam

將檢測后的脫毒苗接種在4 種添加不同濃度6-BA 和NAA（0.5 mg/L+0.1 mg/L、1.0 mg/L+0.5 mg/L、2.0 mg/L+0.1 mg/L、3.0 mg/L+0.3 mg/L）的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計脫毒苗增殖系數(shù)。

1.2.3 試管苗微扦插快繁 取長至3～5 cm 高長勢較好的試管苗，在超凈工作臺中將帶腋芽莖段切下（圖2b），分別接種在添加有0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA、1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA、2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種20 個外植體，重復(fù)3 次，待腋芽萌發(fā)后長成完整植株，統(tǒng)計生根率；間隔30 d反復(fù)進行以上操作，進行規(guī)?？旆保坷^代1次，調(diào)查增殖系數(shù)與生根率。此外，在此培養(yǎng)基中分別加入1.5 g/L 活性炭、0.01 g/L VC、0.15 g/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP），每個處理接種20個外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)15 d時統(tǒng)計試管苗褐化率。

1.2.4 試管苗移栽與扦插繁種 將微扦插培養(yǎng)的5 cm 高生根試管苗，移栽到基質(zhì)配比為草炭∶珍珠巖∶蛭石=5∶1∶1 的營養(yǎng)缽中培養(yǎng)（圖3a），澆足水分置于培養(yǎng)室中，給予弱光照，保持基質(zhì)濕潤，緩苗后正常管理。30 d后對健壯生長的南城淮山脫毒苗藤蔓（圖3b），剪成單葉單節(jié)插穗（圖3c），各插穗莖節(jié)處分別浸泡于0，50，100，150 mg/L NAA 溶液中1 h，后扦插于32 穴育苗盤基質(zhì)中，基質(zhì)配比為草炭∶珍珠巖∶蛭石=5∶1∶1，莖節(jié)處深入基質(zhì)下1.5 cm深。每處理濃度扦插20株，每穴扦插1株，重復(fù)3次。扦插后及時澆透水，并搭棚遮蔭，保持基質(zhì)及棚內(nèi)濕度，生根成活后去掉遮陽網(wǎng)，常規(guī)管理。扦插14 d時調(diào)查插穗生根率，45 d時調(diào)查插穗出苗率，120 d時統(tǒng)計新生脫毒薯塊的橫縱徑及質(zhì)量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對南城淮山莖尖成活率的影響

由表2 可知，不同激素配比對南城淮山莖尖成活率的影響差異顯著。南城淮山莖尖在1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基中成活率（85%）顯著高于其他培養(yǎng)基，其成苗率也最高，為80%。此外，由圖1d、圖1e、圖1f、圖1g 和圖1h 可以看出，接種的健康莖尖分生組織在10 d 左右開始轉(zhuǎn)綠，30 d 后明顯膨大，60 d時第1片葉長出并展平。

表2 不同濃度6-BA與NAA對莖尖成活的影響Tab.2 Effect of different concentrations of 6-BA and NAA on survival of stem tips

圖1 南城淮山莖尖培養(yǎng)Fig.1 Culture of stem tip of Nancheng Huaishan

2.2 試管苗RT-PCR病毒檢測

對莖尖培養(yǎng)的試管苗進行RT-PCR 病毒檢測，結(jié)果（圖2）表明，大田植株材料共檢測到日本花葉病毒（JYMV）、馬鈴薯Y病毒（PVY）與馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVD）等3類病毒，其對應(yīng)的病毒序列片段分別為1 100，581，360 bp，所有試管苗中均未擴增出JYMV、PVY 與PSTVD 病毒。此外，大田植株與試管苗葉片中均未檢測到馬鈴薯S病毒（PVS）與馬鈴薯X病毒（PVX）。

圖2 大田植株及試管苗葉片RT-PCR病毒檢測Fig.2 Virus detection of leaves from field and in vitro plantlet by RT-PCR

2.3 不同激素配比對脫毒苗增殖的影響

將檢測后的脫毒苗接種至4種增殖培養(yǎng)基上，生長60 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)，結(jié)果見表3所示。由表3可知，4個不同濃度6-BA與NAA的組合均可誘導(dǎo)脫毒苗增殖和分化。其中，脫毒苗在1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 培養(yǎng)基上的增殖系數(shù)達到4.5，顯著高于其他培養(yǎng)基，是脫毒苗增殖的最佳激素配比。在3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上的脫毒苗增殖系數(shù)最低，多數(shù)直接分化成苗，未發(fā)生增殖。

表3 不同濃度6-BA與NAA對脫毒苗增殖的影響Tab.3 Effect of different concentrations of 6-BA and NAA on proliferation of virus-free vaccine

2.4 不同激素配比對試管苗微扦插快繁的影響

由表4可以看出，在MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的6-BA與NAA均能使脫毒苗莖段誘導(dǎo)出新芽，但誘導(dǎo)效果差異顯著。將帶腋芽的莖段接入2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基中，5～7 d 后側(cè)芽萌動，出芽率為98.33%，誘導(dǎo)效果最佳，25 d側(cè)芽長成健壯的脫毒試管苗，且生根率達到100%，增殖系數(shù)為5.93，莖段未見分化出愈傷組織（圖3c，圖3d）。在MS 培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA 與0.5 mg/L NAA 時，莖基部形成少量愈傷組織并很快褐化，莖段出芽率最低，為53.33%，增殖系數(shù)為1.60，未見有根生成。

圖3 試管苗莖段微扦插成苗Fig.3 Seedling formation of test-tube stem by microcuttage

表4 不同濃度6-BA與NAA對試管苗莖段快繁與生根的影響Tab.4 Effect of different concentrations of 6-BA and NAA on stem rapid propagation and grow root of test tube seedling

2.5 抗褐化劑對試管苗生長的影響

如表5 所示，在前期篩選出的試管苗微扦插成苗最適的MS 培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）與VC 等抗褐化劑，與空白對照相比，三者均能抑制試管苗的褐化。其中，培養(yǎng)基中添加1.5 g/L AC，其試管苗褐化率最低，為10.33%，顯著低于PVP與VC處理，添加1.5 g/L PVP后試管苗的褐化率最高，達到68.33%。

表5 不同抗褐化劑對試管苗褐化的影響Tab.5 Effect of different browning agent in media on browning rate of test tube seedling

2.6 不同NAA濃度對試管苗扦插成活率及脫毒種薯生長的影響

如表6和圖4（d，e）所示，NAA 處理下試管苗扦插成活率及種薯生長情況顯著優(yōu)于清水處理。其中，100 mg/L NAA處理下插穗生根率為96.67%，且扦插培養(yǎng)獲得的脫毒種薯平均縱、橫徑分別為22.52 cm和13.12 mm，平均質(zhì)量為28.09 g，顯著高于其他處理。50、100 mg/L NAA 處理下扦插苗成活率與種薯縱、橫徑與平均質(zhì)量均沒有顯著差異，清水處理下扦插生根率最低，為81.67%，且脫毒種薯生長情況最差。100 mg/L NAA處理對試管苗扦插成活及脫毒種薯的生長有一定的促進作用。

圖4 南城淮山脫毒苗移栽與扦插繁種Fig.4 Transplant and cuttage propagation tuber of virus-free seedling of Nancheng Huaishan

表6 不同濃度NAA對插穗成活率及脫毒種薯生長的影響Tab.6 Effect on surviving rate of scions and growth of virus-free seeds treated with different concentrations of NAA

3 結(jié)論與討論

山藥作為典型的無性繁殖作物，在長期營養(yǎng)繁殖過程中病毒逐年積累，導(dǎo)致其種性不斷退化。近年來，研究人員通過莖尖培養(yǎng)、超低溫療法（Cryotherapy）、熱處理、化學(xué)藥劑處理、微型嫁接等方法進行植株病毒脫除[27-29]。其中熱處理和化學(xué)藥劑處理步驟繁多、技術(shù)難度高；微型嫁接程序復(fù)雜，費時費工，甚至可能存在嫁接不親和的問題[27]；超低溫療法存在脫除植株病毒不徹底、試管苗存活率和再生率降低等問題[30-31]。莖尖脫毒技術(shù)是剝?nèi)≈参镯敹藷o毒或帶病率極低的分生組織（莖尖）進行組織培養(yǎng)[32]，此技術(shù)已成功應(yīng)用到多種栽培植物中[33]。劉星月等[34]利用莖尖脫毒技術(shù)成功脫除芋（Colocasia esculenta）的芋花葉病毒（DsMV），并獲得脫毒芋。李會等[35]通過對半夏（Pinellia ternata）微莖尖脫毒培養(yǎng)，成功脫除半夏中的芋花葉病毒（DsMV）。本研究利用莖尖脫毒技術(shù)，研究不同質(zhì)量濃度6-BA 與NAA 對莖尖誘導(dǎo)的影響，篩選出最佳莖尖誘導(dǎo)成苗培養(yǎng)基，高效脫除了南城淮山中的日本花葉病毒（JYMV）、馬鈴薯Y 病毒（PVY）與馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVD）。

酚類物質(zhì)的種類與含量是導(dǎo)致組織培養(yǎng)過程中褐變的重要因素。由于山藥富含酚酸、黃酮及花色苷類等酚類物質(zhì)[36]，導(dǎo)致其在組織培養(yǎng)過程中容易造成外植體褐變甚至死亡。前人研究表明，在培養(yǎng)基中添加適量的聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、維生素C（vitamin C，VC）和活性炭（active carbon，AC）等物質(zhì)，能夠有效減少褐化物的積累[37-38]。廖煥琴等[39]認為在MS培養(yǎng)基中添加1.0 g/L活性炭可有效抑制褐化。有研究發(fā)現(xiàn)0.5 g/L PVP可以抑制芍藥（Paeonia lactifloraPall）褐化[40]。本研究結(jié)果顯示，在MS 培養(yǎng)基中添加1.5 g/L AC 較可有效的抑制南城淮山組織培養(yǎng)過程中的褐化現(xiàn)象，其效果優(yōu)于PVP和VC 的處理?；钚蕴靠梢晕脚嗷械挠泻ξ镔|(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)、外植體在培養(yǎng)過程中分泌的酚、醌類等對外植體自身有害的物質(zhì)，同時又能吸附生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。

通常，山藥莖尖脫毒培養(yǎng)是由莖尖誘導(dǎo)獲得不定芽再進行增殖、分化、生根[13-14]，而本研究中利用莖尖獲得不定芽并增殖，誘導(dǎo)分化后，以南城淮山的單芽莖段為外植體，直接誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，獲得大量繼代苗，增殖系數(shù)達到5.93，可在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)大量繁殖種苗。此外試驗結(jié)果還表明，南城淮山莖段在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基上，可以實現(xiàn)試管苗增殖與生根誘導(dǎo)同步進行，繼代繁殖周期20～30 d，生根誘導(dǎo)率達100%。既縮短培養(yǎng)時間，又降低了組培成本。采用微扦插技術(shù)大量繁殖試管苗，并伴有根的生成，對簡化培養(yǎng)程序、降低快速繁殖成本具有重要作用。

山藥規(guī)模種植通常以塊莖切塊為種，每公頃需種薯3 000 kg 以上，用種量大、成本高，且傷口容易感染病蟲害。山藥地上部莖蔓生長旺盛，通過藤蔓扦插結(jié)薯已有相關(guān)報道。如Oyetunji等[41]利用非洲白山藥（Dioscorea rotundata）藤蔓扦插生產(chǎn)微型塊莖，大大降低了山藥種植成本。本研究在培育出南城淮山脫毒苗基礎(chǔ)上，以脫毒苗帶葉莖節(jié)為插穗，在100 mg/L NAA 處理下，培育出平均質(zhì)量為28.09 g的微型塊莖，可做為脫毒種薯用于田間生產(chǎn)，也便于長途運輸，對加快優(yōu)良山藥品種提純復(fù)壯和推廣種植十分有利。本研究對南城淮山健康種薯的獲得及快繁規(guī)?；a(chǎn)可提供重要的技術(shù)支撐。

致謝：江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（JXARS-19）同時對本研究給予了資助，謹致謝意！