解淀粉芽孢桿菌JK10的鑒定及其對(duì)藍(lán)莓根癌病的防治效果

姚 博，何依璐＊，張晉豪，魏蘭芳，崔興國(guó)，姬廣海*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，云南 昆明 650201；3.云南省曲靖佳沃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司，云南 曲靖 655000）

【研究意義】藍(lán)莓（Vacciniumspp.）又名篤斯、甸果、越桔等，為杜鵑花科越橘屬多年生低灌木。藍(lán)莓作為一種新興果樹(shù)，近年在許多國(guó)家發(fā)展迅猛[1-2]。中國(guó)作為亞洲藍(lán)莓的主要栽培國(guó)家，2020年栽培面積已經(jīng)超過(guò)6 萬(wàn)hm2，全國(guó)規(guī)模化種植省、直轄市、自治區(qū)達(dá)到27 個(gè)[3-4]。云南地區(qū)由根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens引起[5]的藍(lán)莓根癌病目前已經(jīng)成為制約藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害[6]，而目前防治根癌病最有效的方法仍然是生物防治[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2010年阿根廷科學(xué)家首次報(bào)道懸鉤子土壤桿菌A.rubi和發(fā)根土壤桿菌A.rhizogenes能導(dǎo)致藍(lán)莓冠癭瘤[8]。2019年德國(guó)科學(xué)家報(bào)道了一種分離自杜鵑冠癭瘤組織的根瘤菌Rhizobium tumorigenes也能引起藍(lán)莓冠癭瘤[9]。2011 年傅俊范等[6]首次報(bào)道了中國(guó)遼寧、吉林、山東及黑龍江省藍(lán)莓園區(qū)內(nèi)藍(lán)莓根癌病原菌為根癌土壤桿菌A.tumefaciens。2021年張榮琴等[5]對(duì)云南滇中地區(qū)藍(lán)莓根癌病原菌進(jìn)行鑒定明確其為根癌土壤桿菌；目前藍(lán)莓根癌病的防治主要采用農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治。農(nóng)業(yè)防治包括調(diào)節(jié)土壤pH、選用健康苗木，剔除發(fā)病苗木、中耕施肥避免傷根、防治線蟲(chóng)等?；瘜W(xué)防治主要包括使用鏈霉素、波爾多液進(jìn)行土壤消毒，病株使用噻霉酮、乙蒜素、硫酸銅、農(nóng)用鏈霉素等灌根[4-5,10-11]。20 世紀(jì)70 年代Kerr 首次報(bào)道了利用放射性土壤桿菌A.radiobacterK84 菌株防治桃樹(shù)根癌[12]。隨后，陸續(xù)有生物防治根癌病的報(bào)道。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus39b、解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens32a通過(guò)產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)抑制根癌土壤桿菌的生長(zhǎng)達(dá)到生防的目的[13-14]。其它用于防治根癌病的生防菌有利迪鏈霉菌[15]、產(chǎn)堿桿菌[16]等。但目前除K84 菌株外，其余菌株僅用于試驗(yàn)研究均未在田間規(guī)?；瘧?yīng)用，國(guó)內(nèi)也未見(jiàn)登記的防治根癌病新的生防制劑，具體的生防機(jī)制也不明確?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)藍(lán)莓根癌病生物防治的報(bào)道，本研究前期通過(guò)大量的室內(nèi)篩選，得到一株對(duì)藍(lán)莓根癌土壤桿菌有良好拮抗效果的生防菌JK10?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確一株對(duì)藍(lán)莓根癌土壤桿菌有拮抗效果的生防菌的種類，評(píng)價(jià)其溫室及田間防效，初步探索其可能存在的活性物質(zhì)，為藍(lán)莓根癌病的綠色防控提供安全有效的技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

藍(lán)莓根癌土壤桿菌L-11（16S rDNA 登錄號(hào)：MK910214.1）由藍(lán)莓冠癭瘤中分離得到[5]；JK10（16S rDNA 登錄號(hào)：OL825023）為藍(lán)莓健康根內(nèi)生細(xì)菌中篩選得到的一株具有廣譜抑菌活性的生防細(xì)菌。番茄（中蔬4號(hào)）、向日葵（綠寶美食葵）均為市場(chǎng)購(gòu)買；試驗(yàn)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和云南省曲靖佳沃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司完成，田間試驗(yàn)藍(lán)莓品種為“Jewelry”，5年生苗。

1.2 培養(yǎng)基

YEM培養(yǎng)基：參考魏蘭芳等[17]；解淀粉芽孢桿菌優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基：以劉京蘭等[18]配方為基礎(chǔ)對(duì)解淀粉芽孢培養(yǎng)基進(jìn)行改良，改良后培養(yǎng)基命名為BA培養(yǎng)基（1 L），配方為工業(yè)蛋白胨11.25 g、酵母浸粉3.75 g、工業(yè)蔗糖5 g、馬鈴薯淀粉5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、NaCl 1 g，自來(lái)水定容至1 L，使用1 mol/L 的NaOH 溶液將pH調(diào)至7.0，分裝后滅菌備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 JK10 形態(tài)學(xué)觀察與生理生化檢測(cè) JK10 在LB 培養(yǎng)基上活化后，觀察菌落的隆起形狀、透明度、顏色、質(zhì)地、邊緣等，挑取少許單菌落經(jīng)革蘭氏染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。JK10生理生化測(cè)定，并參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定。

1.3.2 JK10基因組DNA 提取與16S rDNA、gyrB基因擴(kuò)增 使用細(xì)菌總DNA 提取試劑盒提取JK10基因組DNA；參照姚錦愛(ài)等[19]的方法與引物序列，對(duì)16S rDNA、gyrB基因擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.3.3 JK10 分子鑒定 將16S rDNA、gyrB基因序列提交到NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行BLAST 分析，對(duì)比GenBank中現(xiàn)有細(xì)菌的16S rDNA、gyrB序列，挑選相似序列，利用MEGA-X進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)Bootstrap 分析評(píng)價(jià)結(jié)果穩(wěn)定性，重復(fù)數(shù)為1 000，分析同源性關(guān)系較近的菌株[20-21]。

1.3.4 JK10對(duì)藍(lán)莓根癌土壤桿菌的拮抗作用及抑制起瘤效果 挑取在LB 培養(yǎng)基上純化后的JK10單菌落，接入到BA培養(yǎng)基中30 ℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)36 h備用。將YEM 平板上生長(zhǎng)藍(lán)莓根癌病原菌用無(wú)菌水稀釋成OD600=0.3 左右的菌懸液[22]，吸取100μL 于新的YEM 平板涂布均勻。平板內(nèi)均勻放置3 只牛津杯，處理中加100μL JK10菌液，無(wú)菌水作為對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)箱中放置36 h后測(cè)量抑菌圈直徑，以此評(píng)價(jià)JK10對(duì)藍(lán)莓根癌土壤桿菌的拮抗效果。

L-11、JK10 純化后分別挑取單菌落于LB、BA 培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 搖床內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)，然后使用無(wú)菌水分別將其OD600值調(diào)整到1.0 備用；參考高之蕾等[16]的接種方法和陶鐵男等[23]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以向日葵與番茄作為高感培養(yǎng)植株[24]評(píng)價(jià)JK10 對(duì)藍(lán)莓根癌土壤桿菌的抑制起瘤效果。每個(gè)處理或?qū)φ?0 棵向日葵苗，3次重復(fù)，參考王紅艷[25]方法將拮抗菌與病原菌按照1∶1混合后接種至出苗10 d的向日葵苗子葉處，距離子葉下方5 cm 處再接種1次。30 d后使用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤狀物直徑和向日葵莖粗，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，計(jì)算JK10的防治效果。

病情指數(shù)=∑（病級(jí)株數(shù)×代表數(shù)值）×100/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值） （1）

參考萬(wàn)其露[26]的接種方法和陶鐵男等[23]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，取上述混合后的混合菌懸液接種于30 d苗齡的番茄苗莖基部與距離莖基部5 cm 的位置，每棵番茄接種2 處，每個(gè)處理或?qū)φ?0 棵番茄苗，重復(fù)3 次。60 d后參考使用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤狀物直徑和番茄莖粗，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。

1.3.5 菌株JK10對(duì)藍(lán)莓根癌病的田間防治效果 JK10純化后挑取單菌落接種于BA 液體培養(yǎng)基中，1 L三角瓶裝液量500 mL，30 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)36 h（菌量為5×1010cfu/mL）后帶到藍(lán)莓基地內(nèi)進(jìn)行灌根。選取藍(lán)莓基地內(nèi)發(fā)病中等較輕且一致的區(qū)域進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)小區(qū)30棵藍(lán)莓苗，每個(gè)處理或?qū)φ罩貜?fù)3個(gè)小區(qū)，每棵處理每次灌根稀釋50倍菌液（菌量為1×109cfu/mL）2 L，清水作為對(duì)照。1月10日開(kāi)始，連續(xù)灌根3 次，2 次灌根間隔30 d。4 月初調(diào)查座果率，5 月調(diào)查3 次百粒質(zhì)量，7 月底調(diào)查植株根部新瘤發(fā)生率以及病情指數(shù)。

1.3.6 JK10活性物質(zhì)初探 生防菌JK10聚酮類和脂肽類化合物合成相關(guān)基因的檢測(cè)參照桑建偉等[27]設(shè)計(jì)的引物序列，使用beaS、bacA、dfnA、dhbA、bmyA、fenA、ituC、srfAA這8對(duì)聚酮類和脂肽類化合物合成相關(guān)基因特異引物，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌JK10的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后使用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20和Excel 2016軟件處理分析數(shù)據(jù)，顯著差異水平P＜0.05用小寫(xiě)字母表示。參考張榮琴等[5]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將藍(lán)莓根癌病的發(fā)生程度分為4個(gè)等級(jí)（表1）。新瘤一般特征為乳白色且較小，較軟；老瘤顏色為深褐色，表面堅(jiān)硬且較大。

表1 藍(lán)莓根癌病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Grading standards for blueberry crown gall

2 結(jié)果與分析

2.1 JK10鑒定結(jié)果分析

純化后的JK10 于NA 培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后的菌落及菌株顯微鏡下的形態(tài)見(jiàn)圖1。由圖1A可知，JK10菌落呈乳白色或淡黃色、不透明、菌落扁平有褶皺、無(wú)光澤、邊緣齒狀；圖1B顯示，JK10菌體近橢球形，單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列，革蘭氏染色為陽(yáng)性，芽孢中生。

圖1 JK10菌落形態(tài)（A）和顯微觀察（B）Fig.1 JK10 colony morphology（A）and microscopic observation（B）

生理生化特征如表2 所示，JK10 能利用淀粉、葡萄糖、麥芽糖、果糖等；卵磷脂降解、明膠水解、酪氨酸水解等反應(yīng)為陽(yáng)性。參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》可以發(fā)現(xiàn)JK10以下特征與芽孢桿菌特征吻合。

表2 菌株JK10生理生化指標(biāo)Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of JK10

16S rDNA 比對(duì)結(jié)果顯示，JK10 與Bacillussp. HB12274（KU529689.1）同源性最高，為99.24%，與B.amyloliquefaciensGKT04（KY328743.1）次之，為99.23%。圖2A JK10 的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，JK10 與Bacillussp.HB12274、B.amyloliquefaciensGKT04 聚在同一分支內(nèi)，說(shuō)明生防菌JK10 與這兩株芽孢桿菌的遺傳關(guān)系最近，可確定JK10 為芽孢桿菌屬菌株；挑選相似度97%以上的多個(gè)不同菌株gyrB基因序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。進(jìn)化分析顯示（圖2B），JK10 與所有的解淀粉芽孢桿菌都聚在了一起，且與親緣關(guān)系較近的貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌分開(kāi)，說(shuō)明通過(guò)gyrB基因可以將JK10 鑒定到種；結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定、分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，最終將JK10鑒定為解淀粉芽孢桿菌，命名為Bacillus amyloliquefaciensJK10。

圖2 16S rDNA（A）與gyrB（B）基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 16S rDNA（A）and gyrB（B）gene phylogenetic tree

2.2 JK10對(duì)藍(lán)莓根癌土壤桿菌的拮抗作用及抑制起瘤效果

拮抗試驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，與對(duì)照相比JK10菌懸液對(duì)藍(lán)莓根癌土壤桿菌有明顯抑制效果，抑菌圈達(dá)到（22±1.2）mm，且邊緣整齊，說(shuō)明JK10 菌懸液對(duì)藍(lán)莓根癌土壤桿菌拮抗效果明顯；向日葵活體接種試驗(yàn)結(jié)果表明，與只接種L-11菌懸液的對(duì)照相比，混合接種JK10與L-11菌懸液處理的向日葵苗病情指數(shù)為5.0±0.66，而對(duì)照為87.5±4.47，相對(duì)防效為94.28%；番茄接種試驗(yàn)結(jié)果表明，同時(shí)接種JK10 菌液的處理病情指數(shù)為10.0±1.44，只接種病原菌L-11 的對(duì)照病情指數(shù)為77.5±5.56，防效為87.09%；溫室活體接種試驗(yàn)證明：菌株JK10 能有效抑制L-11 引起的向日葵、番茄冠癭瘤，顯著降低其病情指數(shù)，可用于下一步田間試驗(yàn)。

圖3 JK10對(duì)藍(lán)莓根癌土壤桿菌的拮抗作用以及抑制起瘤效果Fig.3 The antagonistic effect of JK10 on blueberry Agrobacterium tumefaciens and its tumor-inhibiting effect

2.3 JK10對(duì)藍(lán)莓根癌病的田間防治效果

與對(duì)照和乙蒜素相比，藍(lán)莓根癌病病區(qū)植株使用JK10菌液連續(xù)灌根3次后，顯著增加了藍(lán)莓植株的座果率和百粒質(zhì)量，顯著降低了藍(lán)莓苗新瘤的出現(xiàn)率和病情指數(shù)（表3）。連續(xù)灌根3次即有明顯的田間防治效果和增產(chǎn)作用，可用于藍(lán)莓根癌病的田間防治。

表3 JK10對(duì)藍(lán)莓根癌病的大田防效及產(chǎn)量的影響Tab.3 The effect of JK10 on blueberry crown gall prevention and yield in the field

2.4 內(nèi)生細(xì)菌JK10脂肽類和聚酮類化合物合成相關(guān)基因的檢測(cè)

由圖4 可知，以內(nèi)生細(xì)菌JK10 基因組DNA 為模板，可以擴(kuò)增到BacillomycinD、Fengycin、Iturin、Surfactin、Bacilysin、Bacillaene、Difficidin、Bacillibactin 對(duì)應(yīng)的合成基因，表明菌株JK10基因組DNA 中含有上述8 種脂肽類和聚酮類化合物合成基因。說(shuō)明JK10 發(fā)酵液中可能含有相關(guān)物質(zhì)，這些物質(zhì)可能與其生防效果有關(guān)。

圖4 脂肽類與聚酮類合成基因PCR檢測(cè)Fig.4 The PCR detection of lipopeptide and polyketide compounds synthesis gene

3 討論與結(jié)論

本研究使用的16S rDNA 與gyrB基因聯(lián)合鑒定的方法，近年來(lái)常被用于未知菌株的快速鑒定。傅奇等[28]使用16S 與gyrB基因聯(lián)合建樹(shù)快速準(zhǔn)確鑒定了一株解淀粉芽孢桿菌。盧佳琦等[29]結(jié)合生理生化和16S rDNA 與gyrB基因鑒定了一株蠟樣芽胞桿菌。16S rDNA 基因序列普遍應(yīng)用于細(xì)菌鑒別或構(gòu)造細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定的局限性，但是由于16S rDNA 序列間過(guò)高的相似度，此方法難以區(qū)別親緣關(guān)系接近的菌種[30]。近年研究發(fā)現(xiàn)gyrA基因gyrB基因可彌補(bǔ)16S rDNA 基因法的缺點(diǎn)而被普遍使用，16S rDNA 和gyrB基因序列聯(lián)合鑒定法是一種科學(xué)且被國(guó)際上認(rèn)可的一種識(shí)別新分離物種身份的方法[31]。

篩選拮抗細(xì)菌是根癌病生物防治的一個(gè)思路[32]，李昱佳等[7]篩選得到的桃內(nèi)生菌泛菌Pantoea deleyi與腸桿菌Enterobacter cowanii，均能有效抑制根癌土壤桿菌引起的向日葵冠癭瘤。高之蕾等[16]篩選得到的糞產(chǎn)堿菌Alcaligenes faecalis對(duì)根癌土壤桿菌有良好拮抗作用，且強(qiáng)烈抑制根癌向日葵、番茄起瘤。張錫唐等[33]篩選得到的瓦雷茲芽孢桿菌Bacillus velezensis菌株對(duì)櫻花根癌病防效達(dá)到了50%；本研究使用JK10發(fā)酵液連續(xù)對(duì)藍(lán)莓根癌病植株連續(xù)灌根3次后，藍(lán)莓根癌病植株新瘤發(fā)生率和病情指數(shù)較清水和乙蒜素對(duì)照都有顯著降低，且防效達(dá)到56%，并且對(duì)藍(lán)莓植株的坐果率和百粒質(zhì)量也有一定的提高。這與張榮琴等[5]的研究結(jié)果防效45%相比，提高了11個(gè)百分點(diǎn)，這可能由于JK10來(lái)自健康藍(lán)莓根組織內(nèi)生菌，相較于其他生防菌更容易定殖。脂肽類與聚酮類化合物是解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的常見(jiàn)抑菌物質(zhì)。解淀粉芽孢桿菌32a 和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌39b 除能產(chǎn)生芽孢桿菌霉素外，還產(chǎn)生脂肽類混合物，且對(duì)根癌土壤桿菌引起的番茄冠癭瘤防治效果良好[14,34]。Chakraborty 等[35]報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生多種聚酮類物質(zhì)，對(duì)副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、創(chuàng)傷弧菌V.parahaemolyticus有良好的抑制效果。Chen 等[36]報(bào)道的貝萊斯芽孢桿菌B.velezensisCLA178 產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)脂類抗生素macrolactin 對(duì)根癌土壤桿菌C58 有較好的抑制活性。本研究通過(guò)對(duì)菌株JK10基因組中相關(guān)基因的擴(kuò)增，證明其代謝物中可能存在多種脂肽類和聚酮類物質(zhì)，具體哪種是主要抑制藍(lán)莓根癌土壤桿菌的物質(zhì)還有待研究。

本研究結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定和分子鑒定明確一株生防菌JK10為解淀粉芽孢桿菌。室內(nèi)拮抗試驗(yàn)和溫室活體接種試驗(yàn)證明菌株JK10 對(duì)藍(lán)莓根癌土壤桿菌L-11 有良好拮抗作用和抑制起瘤的效果。田間防效試驗(yàn)證明，JK10 發(fā)酵液對(duì)藍(lán)莓根癌病的田間防治效果良好，相對(duì)防效為56.4%，且有一定的增產(chǎn)作用，可以用作生防菌劑的開(kāi)發(fā)和藍(lán)莓根癌病的田間防治。

致謝：云南省“萬(wàn)人計(jì)劃”產(chǎn)業(yè)技術(shù)領(lǐng)軍人才（YNWR-CYJS-2019-046）同時(shí)對(duì)本研究給予的資助，謹(jǐn)致謝意！