黑水虻抗菌肽研究進(jìn)展

章啟慧，李昆太，王 會(huì)，王 飛*，王雷雨，陳玉梁，楊鈺妮

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江 524001；4.百色學(xué)院 農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西 百色 533000）

濫用抗生素導(dǎo)致病原菌抗藥性增強(qiáng)，甚至催生“超級(jí)致病菌”，從而減弱抗生素使用效果。目前，抗生素耐藥性與安全性已被世界衛(wèi)生組織列為全球公共衛(wèi)生的威脅之一。尤其是在抗生素越來越被嚴(yán)格限制使用的背景下，尋找綠色安全高效的抗生素替代品成為行業(yè)迫切所需。

昆蟲源抗菌肽因具有良好的抑菌活性、穩(wěn)定性及安全性，被認(rèn)為是潛在的抗生素替代品之一。作為昆蟲宿主防御機(jī)制的代表，抗菌肽廣泛存在于許多昆蟲體內(nèi)，是昆蟲宿主天然免疫系統(tǒng)的主要構(gòu)成成分。昆蟲抗菌肽主要是由小分子次級(jí)代謝物，以及小蛋白和肽組成，對細(xì)菌、真菌及病毒等病原體都有著防御機(jī)制[1]，具有較大的“替抗”潛力。本文綜述了近年來昆蟲抗菌肽的研究進(jìn)展，其中就黑水虻抗菌肽的產(chǎn)生機(jī)制、評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及其應(yīng)用進(jìn)行重點(diǎn)闡述，以期為黑水虻抗菌肽的研究與應(yīng)用提供一定參考。

1 黑水虻抗菌肽的制備與純化方法

在實(shí)驗(yàn)室研究水平，主要是根據(jù)已知的黑水虻抗菌肽基因，通過軟件預(yù)測抗菌肽并通過分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行表達(dá)抗菌肽是常用方法，也是近年來發(fā)現(xiàn)黑水虻新型抗菌肽的主要方式，但是在實(shí)際產(chǎn)業(yè)中，直接從黑水虻幼蟲體內(nèi)提取天然抗菌肽是較為經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法，也是挖掘黑水虻天然抗菌肽的重要手段。

1.1 黑水虻抗菌肽制備方法

1.1.1 分子技術(shù)法 通過分子生物學(xué)技術(shù)，從黑水虻幼蟲中的cDNA 庫中克隆出抗菌肽編碼基因或是根據(jù)已知的黑水虻抗菌肽編碼序列制備黑水虻抗菌肽。Park 等[2]利用cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆得到黑水虻抗菌肽編碼基因DLP1-DLP4及CLP1，Shin 等[3]同樣是利用cDNA 末端快速擴(kuò)增等技術(shù)得到黑水虻抗菌肽rHI-attacin，Elhag 等[4]從黑水虻幼蟲的cDNA 中篩選到7 種抗菌肽基因，并利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)stomoxynZH1，胡珊珊等[5]通過已知的黑水虻抗菌肽編碼序列設(shè)計(jì)引物，從黑水虻幼蟲的RNA 中擴(kuò)增得到DLP-5 抗菌肽序列，Xu 等[6]通過黑水虻轉(zhuǎn)錄組及基因組的交叉驗(yàn)證，得到在黑水虻幼蟲中表達(dá)水平較高的3 個(gè)來自于不同家族的抗菌肽基因Hidefensin-1，HiCG13551和Hidiptericin-1，并將其轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因家蠶系，使得家蠶對昆蟲病原細(xì)菌的抗性得到了提高。黑水虻新型抗菌肽的發(fā)現(xiàn)得益于分子生物學(xué)技術(shù)以及生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，也是當(dāng)前獲得黑水虻新型抗菌肽的主要來源。

1.1.2 血淋巴收集法 對個(gè)體較大，血淋巴較多的昆蟲一般采用血淋巴收集法。為了防止黑化，在收集昆蟲血淋巴時(shí)，收集管內(nèi)一般含有苯基硫脲及相關(guān)蛋白酶抑制劑，收集到血淋巴后，需要立即離心，恢復(fù)成無細(xì)胞的血淋巴，避免凝血，獲得黑水虻抗菌肽粗提物。馮群等[7]使用斷頭取血法收集黑水虻幼蟲免疫后的血淋巴，Alvarez等[8]使用刀剖黑水虻幼蟲腹部，用注射器收集幼蟲血淋巴，獲得抗幽門螺旋桿菌的抗菌肽，周義文等[9]為收集家蠅幼蟲含抗菌肽的血淋巴，使幼蟲表面布滿細(xì)菌懸液，用不銹鋼針刺透皮膚，造成損傷感染，24 h 后剪去幼蟲頭部，收集血淋巴。血淋巴收集方法可以得到較純的含有抗菌肽的血淋巴。

1.1.3 研磨提取法 對于個(gè)體較小以及血淋巴難以收集的昆蟲，為獲得大量抗菌肽時(shí)一般采用研磨或勻漿提取法。Lee等[10]為獲得大量的黑水虻抗菌肽，將感染后的4.5 kg黑水虻進(jìn)行微波干燥，干燥后研磨成粉末，獲得黑水虻抗菌肽粗制品，Vogel等[11]將黑水虻幼蟲經(jīng)有機(jī)試劑粉碎等步驟獲得黑水虻粗制抗菌肽，Kim 等[12]將雙叉犀金龜幼蟲進(jìn)行干燥研磨，以獲得幼蟲抗菌肽粉末。研磨提取獲得的是昆蟲的粗蛋白制品，由于昆蟲脂肪和其他蛋白較多，存在抗菌肽有效濃度不高的問題。

1.2 黑水虻抗菌肽純化工藝

昆蟲抗菌肽一般為2～7 ku左右大小的小分子肽，在純化過程中，需要考慮昆蟲蛋白種類較多，難以分離出較多種類不同的抗菌肽，純化方式也各有不同。Bhagavathula 等[13]使用配備C18 反相柱HPLC 進(jìn)行粗抗菌肽提取物的分級(jí)。在不同的線性梯度進(jìn)行洗脫，通過UV-DAD 檢測器監(jiān)測肽峰，根據(jù)保留時(shí)間不同收集到4個(gè)抗菌肽組分，Ge等[14]通過DEAE-Sepharose 離子色譜分離獲得抗菌肽粗提取物，然后通過Sephacryls-200HR 凝膠過濾層析對粗提物進(jìn)行分離和純化，減少不可逆結(jié)合造成的蛋白質(zhì)損失和失活。Hirsch 等[15]通過固相合成技術(shù)在聚合物載體樹脂上制備抗菌肽，經(jīng)反相色譜分析，再通過紫外吸收和電噴霧電離質(zhì)譜檢測抗菌肽的存在并進(jìn)一步測定抗菌肽含量。上述方法中，Sephacryls-200HR 凝膠過濾層析方法過程簡短，同時(shí)也能盡最大可能保持蛋白質(zhì)活性及分子量，但由于抗菌肽特性并不相同，在純化時(shí)仍要根據(jù)抗菌肽種類進(jìn)行純化工藝選擇及優(yōu)化。

2 黑水虻抗菌肽的產(chǎn)生機(jī)制及抗菌肽基因

2.1 黑水虻抗菌肽產(chǎn)生機(jī)制

昆蟲抗菌肽是在昆蟲進(jìn)化中獲得的具有抑菌功效的活性物質(zhì)，其中黑水虻是目前被發(fā)現(xiàn)具有較多抗菌肽基因的昆蟲之一。目前普遍認(rèn)為，昆蟲抗菌肽產(chǎn)生于脂肪體。作為雙翅目模式生物的代表，有關(guān)果蠅抗菌肽的產(chǎn)生機(jī)制已有大量研究，這也給研究黑水虻抗菌肽產(chǎn)生機(jī)制帶來很大啟發(fā)。Tzou 等[16]發(fā)現(xiàn)Toll 和IMD 通路在誘導(dǎo)果蠅產(chǎn)抗菌肽中起作用，Hason 和Lemaitre[17]發(fā)現(xiàn)抗菌肽在塑造腸道生物區(qū)系中的作用沒有得到相同程度的表征，但I(xiàn)MD 缺陷導(dǎo)致果蠅腸道中較高的細(xì)菌數(shù)量，進(jìn)一步支持腸道抗菌肽控制微生物群的觀點(diǎn)，不過IMD 途徑不僅在抗菌免疫反應(yīng)中起著重要作用，它也參與了許多過程，像細(xì)胞競爭、病毒控制、抗脫水等過程，這表明抗菌肽不是一個(gè)簡單的免疫效應(yīng)器。Huang 等[18]通過對黑水虻腸道系統(tǒng)免疫的研究，認(rèn)為腸道微生物直接或間接影響腸道上皮細(xì)胞的免疫功能，進(jìn)而影響宿主體內(nèi)環(huán)境和發(fā)育，并發(fā)現(xiàn)缺乏抗菌肽表達(dá)的Toll 途徑突變體黑水虻幼蟲通常表現(xiàn)為抗藥性降低，遭受由腸道感染導(dǎo)致的致死效應(yīng)，確定黑水虻幼蟲是利用DUOX-ROS 免疫系統(tǒng)和Toll 信號(hào)通路作為腸道免疫防御的手段，BsfDuox 和BsfTLR3 能調(diào)節(jié)腸道關(guān)鍵細(xì)菌Providencia和Dysgonomonas 的動(dòng)態(tài)平衡。目前關(guān)于黑水虻產(chǎn)生抗菌肽的機(jī)制尚不明確，現(xiàn)有研究結(jié)果表明，Toll和IMD 通路在產(chǎn)抗菌肽的過程中起關(guān)鍵作用，但仍需深入研究產(chǎn)生其作用機(jī)制，明確黑水虻抗菌肽分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

2.2 黑水虻抗菌肽基因

因采用的注釋方式及數(shù)據(jù)庫不同，所獲得的黑水虻抗菌肽基因也略有不同。Moretta 等[19]借助生物信息學(xué)手段從黑水虻幼蟲及雄雌成蟲的轉(zhuǎn)錄組中推斷出57 種不同的抗菌肽，包括防御素、抗菌肽、附著蛋白和溶菌酶等，Zhan 等[20]從黑水虻幼蟲基因中篩選出能夠編碼50 種抗菌肽的基因，其中包括36 種cecropin 抗菌肽基因。NCBI 上現(xiàn)有黑水虻蛋白質(zhì)組學(xué)（BioProject：PRJNA683030）數(shù)據(jù)顯示，被成功注釋的黑水虻抗菌肽共有52 種（表1），其中cecropin 類抗菌肽36 種，attacin 類抗菌肽4 種，防御素類抗菌肽12 種。

表1 黑水虻抗菌肽基因的基本信息Tab.1 Basic information of antimicrobial peptide gene of black soldier fly

3 黑水虻抗菌肽的抑菌機(jī)制及評價(jià)方法

3.1 黑水虻抗菌肽的抑菌機(jī)制

不同抗菌肽的抑菌機(jī)制有所不同，目前抗菌肽與細(xì)菌相互作用機(jī)制，較被認(rèn)可的兩種觀點(diǎn)分別是抗菌肽對細(xì)菌膜作用機(jī)理和抗菌肽對細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)殺傷機(jī)理[21]?？咕目赏ㄟ^膜溶解機(jī)制導(dǎo)致細(xì)菌膜上的孔隙形成，或與磷脂相互作用，導(dǎo)致脂膜中的微觀異質(zhì)性，從而致使病原細(xì)菌死亡[22]?？咕膶?xì)菌細(xì)胞膜的透過作用機(jī)制分為三類：桶壁模型，抗菌肽滲透通過雙層磷脂；環(huán)孔模型，抗菌肽與脂質(zhì)頭部基團(tuán)相互作用，誘導(dǎo)雙層彎曲并垂直插入膜雙層；地毯模型，抗菌肽覆蓋整個(gè)細(xì)胞膜，使得抗菌肽的非極性側(cè)鏈與膜疏水核結(jié)合，而極性殘基與磷脂結(jié)合，與碎片膜形成膠束[23]?？咕膶?xì)菌細(xì)胞內(nèi)殺傷機(jī)理主要是通過與細(xì)胞膜內(nèi)的特異性酶結(jié)合或作用于細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA[24]，此類抗菌肽不作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，而是進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)進(jìn)行殺菌。

圖1 抗菌肽與細(xì)菌膜相互作用模型[23]Fig.1 Interaction model between antimicrobial peptides and bacterial membrane[23]

3.2 黑水虻抗菌肽的抗菌活性和穩(wěn)定性評價(jià)方法

3.2.1 評價(jià)抗菌活性及抑菌率 對于抗菌活性及抑菌率的評價(jià)，盡管目標(biāo)病原菌不同，但采用的評價(jià)方法相對一致。Lee等[10]采用徑向擴(kuò)散法研究了干酪乳桿菌免疫的黑水虻血淋巴對3種沙門氏菌的抗菌活性，根據(jù)徑向擴(kuò)散的面積來評價(jià)抑菌率。與徑向擴(kuò)散法較為相似的是抑制區(qū)試驗(yàn)法。抑制區(qū)試驗(yàn)法是最簡單也是較為通用的抑菌評價(jià)方法，其中又能分為牛津杯法、濾紙片法、打孔法等。Elhag 等[4]采用牛津杯法，將純化的抗菌蛋白加入牛津杯中，培養(yǎng)后測量抑菌圈直徑。Choi等[25]采用濾紙片法，將濾紙片浸入黑水虻幼蟲不同抗菌肽提取液，培養(yǎng)后以濾紙片周邊透明圈為抑菌圈直徑，Park 等[26]使用打孔法在固體培養(yǎng)基中打直徑為3 mm 的孔洞，每孔加入抗菌肽樣品，培養(yǎng)后測量透明帶直徑，以抑菌圈直徑大小來評價(jià)抑菌活性及抑菌率。

液體抑菌法也是評價(jià)抗菌肽活性的方法之一，在病原菌培養(yǎng)的過程中，添加抗菌肽稀釋液能一定程度上抑制病原菌的生長，也可以根據(jù)稀釋液濃度測定最小抑菌濃度來評價(jià)抑菌活性及抑菌率。李尚偉等[27]在96 孔板中加入100 μL 對數(shù)期細(xì)菌，再加入10 μL 抗菌肽樣品，經(jīng)過24 h 培養(yǎng)后，用酶標(biāo)儀在600 nm 處測定吸光值，以此確定細(xì)菌生長的最小抑菌濃度。液體抑菌所用抗菌肽樣品量少，適用于小型試驗(yàn)。

3.2.2 評價(jià)抗菌肽穩(wěn)定性 抗菌肽的穩(wěn)定性多從pH、溫度、紫外照射等方面進(jìn)行評價(jià)研究。趙啟鳳[28]將黑水虻抗菌肽樣品放置溫度為25，37和50 ℃水浴加熱10 min，同時(shí)也用鹽酸與氨水配比好的pH 為1、3、5、7、9、11的溶液與黑水虻抗菌肽樣品等體積混合，發(fā)現(xiàn)黑水虻幼蟲抗菌肽熱穩(wěn)定性較好，同時(shí)也具有一定的抗酸堿能力，在一定的pH 范圍內(nèi)能維持抗菌肽活性。岳陽[29]以100 ℃，20 min 條件處理蠶蛹抗菌肽，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌的抑菌效果基本保持不變，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)分離得到的蠶蛹抗菌肽是性質(zhì)穩(wěn)定的抗菌肽，在室溫下一定時(shí)間內(nèi)能夠保持穩(wěn)定活性。黑水虻抗菌肽與大多數(shù)昆蟲抗菌肽一樣，都有著較強(qiáng)的耐熱性，能夠在一定條件下維持抑菌活性的穩(wěn)定。

4 黑水虻抗菌肽的應(yīng)用及前景

黑水虻是一種高蛋白昆蟲資源，聯(lián)合國FAO 曾在2013 年推出《可食用昆蟲報(bào)告》，其中黑水虻作為替代畜禽蛋白飼料前景最具優(yōu)勢的昆蟲。同時(shí)，黑水虻在不同飼養(yǎng)基質(zhì)下可表達(dá)不同種類的抗菌肽，這為黑水虻養(yǎng)殖過程高產(chǎn)抗菌肽提供了科學(xué)依據(jù)。圖2為黑水虻資源及抗菌肽應(yīng)用方案，即通過將黑水虻轉(zhuǎn)化不同底物獲得鮮蟲過程作為黑水虻轉(zhuǎn)化處理系統(tǒng)，對鮮蟲中的抗菌肽進(jìn)行深加工，最終應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)、養(yǎng)殖行業(yè)和食品行業(yè)等領(lǐng)域。

圖2 黑水虻資源及抗菌肽應(yīng)用方案Fig.2 Black soldier fly resources and application scheme of antimicrobial peptides

4.1 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

在中醫(yī)歷史上，昆蟲抗菌肽的藥用價(jià)值非常豐富。例如家蠅幼蟲粉與其他中藥混合，是治療傳染病的有效復(fù)方藥物?？咕脑趪H上已應(yīng)用于臨床治療腦膜炎、幽門螺桿菌感染和真菌感染。德國和美國臨床應(yīng)用抗菌肽治療術(shù)后真菌感染和重癥肺炎的報(bào)道較多。Hong 等[30]開發(fā)自組裝的納米抗菌肽，可作為傷口愈合的抗感染劑。Kalsy 等[31]發(fā)現(xiàn)來自大蠟蛾的天蠶素A 可以破壞尿病原性大腸桿菌的生物膜，從而解決抗生素?zé)o法徹底根除由尿病原性大腸桿菌導(dǎo)致的尿路反復(fù)感染的問題。Xu 等[32]發(fā)現(xiàn)家蠶抗菌肽對人食管癌細(xì)胞具有抗腫瘤活性。馮群等[7]研究發(fā)現(xiàn)黑水虻抗菌肽粗提物對癌細(xì)胞的增殖具有一定抑制作用。黑水虻抗菌肽種類繁多且具有較廣的抑菌譜，是未來生物醫(yī)藥研發(fā)的來源之一，同時(shí)也是解決細(xì)菌耐藥性的方案之一。

4.2 在養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

喂養(yǎng)抗菌肽不僅可以提高生產(chǎn)性能，還能抑制養(yǎng)殖中的病原菌。如免疫柞蠶蛹血淋巴可減輕斷奶仔豬的腹瀉，在飼養(yǎng)奶牛時(shí)，在日糧中添加抗菌肽可以顯著提高奶牛乳蛋白率和奶牛產(chǎn)奶量[33]。將抗菌肽添加到肉雞日糧中，顯著提高肉雞的活重、屠體重、全凈膛重、腿肌重和腿肌率等[34]?？咕腟urfactin可對吉富羅非魚腸道健康指標(biāo)產(chǎn)生有益影響[35]，可提高吉富羅非魚腸道皺襞高度，調(diào)節(jié)腸道菌群，提高腸道抗氧化能力，從而改善吉富羅非魚腸道健康狀態(tài)。黑水虻目前可以作為替代蛋白加入到養(yǎng)殖日糧中，同時(shí)黑水虻抗菌肽替代養(yǎng)殖抗生素，展現(xiàn)出非常可期的發(fā)展?jié)摿颓熬啊?/p>

4.3 在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

在食品領(lǐng)域中，因化學(xué)防腐劑對人體具有一定的危害，使得綠色安全高效的生物防腐劑備受關(guān)注。Nisin 是目前使用最廣泛的細(xì)菌素，同樣也是抗菌肽的一種，在美國已被授予食品公認(rèn)安全的地位，并已被用于各種食品中以控制和預(yù)防單核細(xì)胞增多性李斯特菌。Yaron 等[36]從樹蛙皮膚中分離得到抗菌肽，在蘋果汁有明顯的抑菌活性，表明抗菌肽可以作為潛在的食品防腐劑。黑水虻抗菌肽可以殺滅食品來源性的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，為黑水虻抗菌肽在食品領(lǐng)域發(fā)揮抗菌效果提供基礎(chǔ)。

5 結(jié)論與展望

昆蟲抗菌肽的作用機(jī)制非常保守，并且在數(shù)百年的進(jìn)化中已經(jīng)形成，這表明其耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)較低。黑水虻抗菌肽可以保護(hù)生物體免受細(xì)菌和真菌的侵襲，最有可能成為替代抗生素的產(chǎn)品之一，要促進(jìn)黑水虻抗菌肽大規(guī)模的生產(chǎn)與應(yīng)用，未來研究可側(cè)重以下幾方面：

（1）進(jìn)一步明確黑水虻抗菌肽的產(chǎn)生機(jī)制。通過明確黑水虻腸道菌群與抗菌肽之間的關(guān)系，闡釋黑水虻抗菌肽的分泌特征和蟲體抗菌肽分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為抗菌肽高產(chǎn)工藝提供理論指導(dǎo)。

（2）建立黑水虻抗菌肽的評價(jià)體系。因黑水虻抗菌肽為小分子抑菌蛋白，在評價(jià)黑水虻抗菌肽時(shí)，可以從抑菌性和蛋白質(zhì)特性進(jìn)行評價(jià)，同時(shí)根據(jù)黑水虻抗菌肽在不同領(lǐng)域的應(yīng)用，一并形成一套較為完整的黑水虻抗菌肽評價(jià)體系。

（3）黑水虻抗菌肽的推廣應(yīng)用。黑水虻對固體廢物的轉(zhuǎn)化，能把廢棄物轉(zhuǎn)化為高蛋白，其被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源，并且黑水虻抗菌肽的熱穩(wěn)定性較好，可以忍受飼料生產(chǎn)的溫度。因此，黑水虻抗菌肽用作飼料添加劑極具推廣價(jià)值。盡管黑水虻體內(nèi)抗菌肽的產(chǎn)生，能使基質(zhì)的病原菌減少，但不管是黑水虻本身還是黑水虻抗菌肽作為飼料添加劑，其應(yīng)用的安全性需要充分考慮，這也是促進(jìn)建立黑水虻抗菌肽評價(jià)體系的原因之一。

致謝：廣東海洋大學(xué)科研啟動(dòng)費(fèi)資助項(xiàng)目（060302042006）同時(shí)對本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！