‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育期有機(jī)酸含量變化及檸檬酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

易明亮，張王妮，2＊，楊 莉，匡柳青，劉德春，劉 勇，胡 威*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/江西省井岡蜜柚繁育與栽培技術(shù)工程中心，江西 南昌 330045；2.陜西楓丹百麗生物科技有限公司，陜西 寶雞 721199）

【研究意義】‘馬家柚’[Citrus maxima（Burm.）Merr.，Rutaceae]是江西名優(yōu)柑橘品種，在上饒市廣豐地區(qū)廣泛種植，其果肉呈紅色、果味清香、風(fēng)味獨(dú)特，享有江西省酸柚類第一名的美譽(yù)[1]。有機(jī)酸含量的高低是柚類果實(shí)獨(dú)特品質(zhì)形成的重要指標(biāo)之一[2-3]，對(duì)果實(shí)口感具有決定性作用。因此研究‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育過程中各有機(jī)酸含量的變化規(guī)律及檸檬酸合成、降解、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)變化對(duì)探究其果實(shí)品質(zhì)形成機(jī)制具有重要價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】果實(shí)中不同的有機(jī)酸比例形成其獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)，不同柑橘品種的檸檬酸代謝機(jī)制也存在差異。高陽等[4]研究發(fā)現(xiàn)‘靖安椪柑’果實(shí)有機(jī)酸各組分中檸檬酸含量最高，奎寧酸、酒石酸次之，而蘋果酸最低。柑橘果實(shí)發(fā)育過程中有機(jī)酸變化與檸檬酸代謝密切相關(guān)，檸檬酸的代謝大致分為合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解3個(gè)環(huán)節(jié)。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，檸檬酸的合成始于磷酸烯醇式丙酮酸經(jīng)羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）羧化，而后經(jīng)檸檬酸合成酶（citrate synthase，CS）的催化合成檸檬酸[5]。林瓊[6]的研究結(jié)果表明CitPEPCs和CitCSs基因的上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致了露地栽培的椪柑檸檬酸含量顯著高于溫室栽培果實(shí)。檸檬酸在線粒體中合成后，轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞液泡中儲(chǔ)存，在液泡膜上，檸檬酸的轉(zhuǎn)運(yùn)受到質(zhì)子泵的調(diào)控[7]，其中液泡膜上的質(zhì)子泵H+-ATP酶（V-ATPase）和H+-焦磷酸化酶（V-PPase）通過水解ATP 釋放能量并不斷的泵入H+以維持液泡中的酸性環(huán)境[8-9]。Yao 等[10]在蘋果上分別鑒定出VATPase 和V-PPase 的編碼基因MdVHP1和MdVHA-A，同時(shí)證明這兩個(gè)基因都與蘋果中有機(jī)酸的積累有關(guān)；Li 等[11]在柑橘中也發(fā)現(xiàn)了液泡膜質(zhì)子泵編碼基因CitVHA-c4與柑橘果實(shí)檸檬酸積累密切相關(guān)。另外，CHX（cation/h+exchanger）作為陽離子和氫離子的交換蛋白，可以通過增加液泡膜內(nèi)的電化學(xué)梯度來調(diào)控柑橘果實(shí)中的檸檬酸積累[12]，同時(shí)有研究表明CitCHX和二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因（dicarboxylate carrier gene，CitDIC）參與柑橘類水果中熱空氣激活的檸檬酸鹽的降解[13]。檸檬酸降解始于從液泡中釋放后在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)順烏頭酸酶（Aconitase，Aco）轉(zhuǎn)化為異檸檬酸，而后經(jīng)NADP-異檸檬酸脫氫酶（NADP-isocitrate dehydrogenase，NADP-IDH）生成谷氨酸，谷氨酸在谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）或谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）作用下經(jīng)谷氨酰胺或γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）途徑進(jìn)行降解。陳明[14]的研究結(jié)果顯示CitAco3、CitGAD4/5、CitGS2的轉(zhuǎn)錄豐度在低酸早熟椪柑果實(shí)中均顯著高于高酸的普通椪柑。曹淑燕等[15]研究砧木對(duì)黃果柑有機(jī)酸的影響，表明通過嫁接可顯著提高黃果柑N(yùn)ADP-IDH 活性，降低果實(shí)中有機(jī)酸含量。此外，檸檬酸還可能在ATP-檸檬酸裂合酶（ATP citrate lyase，ACL）的作用下，經(jīng)乙酰輔酶A 降解途徑生成草酰乙酸和乙酰輔酶A，然后參與類黃酮等次生代謝物合成[16]。羅麗娟等[17]研究表明低溫處理可顯著降低溫州蜜柑ACOs和ACLβ1基因的表達(dá)水平，同時(shí)提高汁胞中檸檬酸含量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，‘馬家柚’前期研究多集中在氣象因子、土壤環(huán)境以及栽培管理措施等外在因素對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響[18-20]，而關(guān)于‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育階段有機(jī)酸各組分含量變化規(guī)律及其與檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量變化的內(nèi)在聯(lián)系和機(jī)制研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了解‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育過程中檸檬酸代謝的分子機(jī)制，本研究對(duì)‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育階段的有機(jī)酸各組分及檸檬酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，以期鑒定其檸檬酸代謝的關(guān)鍵基因，為良種‘馬家柚’的栽培管理及品質(zhì)調(diào)控提供理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘馬家柚’果實(shí)于2018年6月開始采自江西省上饒市廣豐區(qū)蘆林鎮(zhèn)果園，選定6棵長勢相同且樹齡在10年以上的成年結(jié)果樹，2棵為一次生物學(xué)重復(fù)，在盛花后60（S1），75（S2），90（S3），105（S4），120（S5），135（S6），150（S7），165（S8），180（S9），195（S10），210 d（S11）直至果實(shí)成熟，每個(gè)時(shí)期分別采集6個(gè)果實(shí)，選取成熟度和大小均一、無病蟲害無機(jī)械損傷的正常果實(shí)，剝?nèi)〕嗟捞幑庥靡旱賰?，?80 ℃低溫中保存。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 有機(jī)酸的提取與含量測定 果實(shí)有機(jī)酸的提取參考陳明[14]的方法，采用高效液相色譜法（HPLC）測定有機(jī)酸各組分含量。有機(jī)酸測定的色譜條件為：Water C18 柱（4.6 mm×250 mm），柱溫為25 ℃，流動(dòng)相為0.05 mol/L的磷酸氫二氨水溶液（pH=2.7），流速為0.5 mL/min；二極管陣列檢測器檢測?？傆袡C(jī)酸含量是檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、奎尼酸含量之和。

1.2.2 RNA 的提取與逆轉(zhuǎn)錄 果肉RNA 的提取采用華越洋快速通用植物RNA 提取試劑盒，采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)提取的RNA 進(jìn)行檢測，RNA 逆轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司（型號(hào)為Cat.#RR047A）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。

1.2.3 熒光定量 使用Bio-RAD 熒光定量PCR 儀，日本TaKaRa 公司的SYBR Premix EX TaqTM 熒光定量酶進(jìn)行q-PCR 基因的定量表達(dá)分析，其中內(nèi)參基因（Actin）與檸檬酸相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)參考Lin 等[13]、Guo等[21]的設(shè)計(jì)（表1），引物序列委托生工生物工程股份有限公司合成，PCR反應(yīng)體系采用Jiang等[22]的設(shè)計(jì)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量分析采用2-△△CT方法。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及整理采用Office365 Excel 2019軟件，數(shù)據(jù)分析利用IBM SPSS 軟件進(jìn)行Duncan 式方差分析以及LSD檢驗(yàn)差異顯著性（P＜0.05），最后采用Origin2018軟件進(jìn)行圖形的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育過程中有機(jī)酸含量的變化

從圖1可觀察到‘馬家柚’果實(shí)從幼果到成熟過程中的變化，S1～S9時(shí)期（花后60～180 d）為果實(shí)膨大期，果實(shí)橫縱徑及單果質(zhì)量逐漸變大，之后果實(shí)不再膨大進(jìn)入成熟期，同時(shí)S7～S10時(shí)期果皮由綠轉(zhuǎn)黃的同時(shí)果肉也逐漸變紅。在發(fā)育過程中‘馬家柚’果實(shí)中檸檬酸含量在膨大期呈上升趨勢，在S1～S5 時(shí)期上升較為緩慢，之后在S6～S9 時(shí)期即膨大后期快速上升。成熟初期檸檬酸含量繼續(xù)上升，至S10 時(shí)期時(shí)達(dá)到最大值5.85 mg/g，之后開始顯著下降（圖2）。從圖2中可以看到檸檬酸含量變化趨勢與總有機(jī)酸基本相同，在果實(shí)膨大期不斷上升而在果實(shí)成熟期后開始下降。從‘馬家柚’果實(shí)整個(gè)發(fā)育期來看，檸檬酸的積累可以分為緩慢增長期（S1～S5）、快速增長期（S5～S10）和下降期（S10～S11）。而蘋果酸、酒石酸和奎寧酸含量在發(fā)育期間變化量不大?！R家柚’果實(shí)中檸檬酸含量始終最高，占總有機(jī)酸含量的45.51%～81.47%，蘋果酸含量占總有機(jī)酸含量的3.07%～24.56%，酒石酸含量占總酸含量的5.65%～27.88%，奎尼酸占總有機(jī)酸含量的5.62%～23.6%，由此表明，‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育至成熟期間主要的有機(jī)酸是檸檬酸，總有機(jī)酸變化趨勢主要由檸檬酸含量決定。

圖1 ‘馬家柚’發(fā)育過程中果實(shí)變化Fig.1 Fruit and cross section during development of‘Majia’pomelo

圖2 ‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育期有機(jī)酸含量Fig.2 Organic acid content of‘Majia’pomelo during fruit development

2.2 ‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育期檸檬酸合成相關(guān)基因的表達(dá)

對(duì)檸檬酸積累的3 個(gè)階段具有代表性的S3、S5、S7、S9、S10、S11 時(shí)期進(jìn)行檸檬酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和檸檬酸合成酶（CS）參與了柑橘檸檬酸的合成。由圖3a 可知在‘馬家柚’整個(gè)果實(shí)發(fā)育過程中，CmPEPC1在S3時(shí)期表達(dá)量相對(duì)較高，在S5～S11時(shí)期保持較低水平穩(wěn)定表達(dá)且無顯著變化。由圖3b 可知，CmPEPC2基因相對(duì)表達(dá)量在S3～S11 整個(gè)時(shí)期相對(duì)穩(wěn)定且無明顯變化，兩個(gè)基因的表達(dá)趨勢與檸檬酸積累趨勢并不一致。

圖3 ‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育期檸檬酸合成相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.3 Expression of genes related to citric acid synthesis during fruit development of‘Majia’pomelo

由圖3c 可知，CmCS1基因相對(duì)表達(dá)量在S3～S7 時(shí)期持續(xù)下降，在S9～S10 時(shí)期又重新上升，到S11 時(shí)CmCS1基因相對(duì)表達(dá)量則顯著下降至0.51。由圖3d 可知，CmCS2基因的相對(duì)表達(dá)量在S3～S7 期間無明顯變化，之后一直呈上升趨勢，在成熟期S10～S11時(shí)期相對(duì)表達(dá)量急劇上升，達(dá)到最高值2.43（圖3）。由此表明CmCSs基因的表達(dá)量變化對(duì)檸檬酸含量沒有影響。

2.3 ‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育期檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)

質(zhì)子泵可以為檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡貯藏而提供動(dòng)力，對(duì)果實(shí)中有機(jī)酸積累具有正向調(diào)節(jié)作用。質(zhì)子泵基因CmVHP2的相對(duì)表達(dá)量在S3～S10 時(shí)期整體呈下調(diào)表達(dá)趨勢，在S10 時(shí)期達(dá)到最低相對(duì)表達(dá)量0.43，S11 時(shí)期顯著上升至最大值1.35，其變化趨勢與檸檬酸變化趨勢并不一致（圖4a）。質(zhì)子泵基因CmVHA-c4在果實(shí)發(fā)育期S5～S9 呈上升趨勢，在S9 時(shí)期達(dá)到最高值后緩慢下降，S10 時(shí)期雖有下降但并不顯著（圖4b），因而其變化趨勢與檸檬酸的積累模式類似，可能對(duì)檸檬酸的積累起重要作用。

H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CmCHX相對(duì)表達(dá)量呈先降低后上升再緩慢降低再上升的波動(dòng)趨勢，與果實(shí)檸檬酸含量的變化規(guī)律沒有聯(lián)系（圖4c）。二羧酸載體基因CmDIC在S3時(shí)期相對(duì)表達(dá)量最高，至S5時(shí)期時(shí)顯著下降，并維持相對(duì)低水平表達(dá)，而此時(shí)從S5 時(shí)期開始果實(shí)檸檬酸積累剛好進(jìn)入快速增長期，至S10時(shí)期開始后進(jìn)入下降期，而S11 時(shí)期CmDIC基因表達(dá)量相對(duì)于S10 時(shí)期顯著上調(diào)（圖4d）。由此表明檸檬酸含量受到CmDIC基因的負(fù)調(diào)控，其對(duì)‘馬家柚’果實(shí)檸檬酸積累具有重要作用。

圖4 ‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育期有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)Fig.4 Expression of organic acid transport related genes during fruit development of‘Majia’pomelo

2.4 ‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育期檸檬酸降解相關(guān)基因表達(dá)

在‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育階段CmACLα1基因的表達(dá)是先下降后上升，在S7時(shí)期相對(duì)表達(dá)量最小，在S11時(shí)期時(shí)達(dá)到最大值（圖5a）。CmACLβ1基因在S3 時(shí)期表達(dá)較高，隨后下降，在果實(shí)發(fā)育S5～S11 時(shí)期表達(dá)水平較低，且保持相對(duì)穩(wěn)定（圖5b），S5時(shí)期開始檸檬酸進(jìn)入快速增長期，因此CmACLβ1基因可能是馬家柚果實(shí)膨大期調(diào)控檸檬酸積累的重要因素。CmAco3基因表達(dá)量在S3～S7 時(shí)期保持較低水平，之后開始上調(diào)表達(dá)，至S11時(shí)期時(shí)表達(dá)量顯著升高至最高值（圖5c），而此時(shí)檸檬酸含量下降，因此認(rèn)為CmAco3可能是調(diào)控果實(shí)成熟期降解‘馬家柚’檸檬酸的重要基因之一。

從圖5f可知谷氨酸合酶基因CmGS2的表達(dá)量在檸檬酸含量較低的S3～S7時(shí)期保持較高水平表達(dá)，而在檸檬酸含量較高的S9～S11時(shí)期維持較低水平表達(dá)，因此檸檬酸含量極可能是由CmGS2基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。在果實(shí)生長發(fā)育過程中，CmNAD-IDH2基因相對(duì)表達(dá)量在S3～S5時(shí)期有下降趨勢，之后在檸檬酸上升期卻呈上升趨勢，并且從S9 時(shí)期開始其表達(dá)量并無顯著差異（圖5d）；CmNAD-IDH3基因的表達(dá)在S3～S7時(shí)期相對(duì)穩(wěn)定，在S9時(shí)期達(dá)到最大值，隨后表達(dá)量又逐漸下降，其表達(dá)量變化對(duì)檸檬酸含量沒有影響（圖5b）。

谷氨酸脫氫酶基因CmGAD5的相對(duì)表達(dá)量在S3～S9 時(shí)期無顯著變化，在S10 時(shí)表達(dá)量最低，隨后在S11時(shí)期達(dá)到最大值（圖5g）；γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶基因CmGABA-T的相對(duì)表達(dá)量在S3～S10時(shí)期相對(duì)穩(wěn)定，在S11 時(shí)顯著上調(diào)達(dá)峰值（圖5h），因此認(rèn)為CmGAD5和CmGABA-T基因在果實(shí)成熟期的顯著上調(diào)表達(dá)也是檸檬酸降解的重要因素。

圖5 ‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育期有機(jī)酸降解相關(guān)基因表達(dá)Fig.5 Expression of organic acid degradation-related genes during fruit development of‘Majia’pomelo

3 結(jié)論與討論

柑橘果實(shí)在發(fā)育過程中有機(jī)酸逐漸積累，其中檸檬酸為主要有機(jī)酸，呈先增加后降低的趨勢，而其他有機(jī)酸組分含量因品種不同而存在差異[23]。研究發(fā)現(xiàn)，‘馬家柚’果實(shí)中有機(jī)酸以檸檬酸為主，蘋果酸、酒石酸次之，奎尼酸含量最低，檸檬酸的變化趨勢為先上升后下降。溫州蜜柑、早香柚[24]以及‘靖安椪柑’[4]在果實(shí)發(fā)育期，其有機(jī)酸含量均呈先上升后下降趨勢，檸檬酸含量均在總有機(jī)酸含量中占比最大，溫州蜜柑占比56%以上，早香柚占比53%以上，而靖安椪柑更是達(dá)到71%以上。

前人對(duì)柑橘檸檬酸積累與檸檬酸合成相關(guān)基因表達(dá)之間的研究很多，大部分研究認(rèn)為檸檬酸的積累與其合成相關(guān)基因無直接聯(lián)系。如易明亮等[25]研究表明，溫州蜜柑完熟栽培過程中檸檬酸合成相關(guān)基因CitPEPCs和CitCSs的表達(dá)與果實(shí)有機(jī)酸積累并沒有聯(lián)系。羅安才等[26]和Chen等[27]研究結(jié)果也表明檸檬酸合成相關(guān)酶活性以及相關(guān)基因的表達(dá)量也均與檸檬酸含量無顯著相關(guān)性。在本研究中CmPEPC1、CmPEPC2、CmCS1和CmCS2基因的相對(duì)表達(dá)量變化與檸檬酸含量變化規(guī)律不一致，他們之間無顯著相關(guān)性，說明‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育過程中檸檬酸的積累并不是由檸檬酸合成基因決定。

檸檬酸合成后需要通過載體運(yùn)輸?shù)揭号葜羞M(jìn)行保存，其降解同樣需要通過載體從液泡中運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行降解反應(yīng)。質(zhì)子泵基因促進(jìn)檸檬酸運(yùn)輸至液泡貯存，對(duì)提高果實(shí)檸檬酸含量具有積極作用。Guo 等[21]的研究表明V 型質(zhì)子泵基因CsVHA、CsVHP和p 型質(zhì)子泵基因CsPH8在低檸檬酸突變品種‘紅暗柳’橙中的表達(dá)水平明顯低于‘暗柳’橙；李紹佳[28]的研究表明CitVHA-c4基因的表達(dá)模式與椪柑果實(shí)發(fā)育過程中檸檬酸的積累呈正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)在煙草葉片中瞬時(shí)過表達(dá)CitVHA-c4基因可顯著提高葉片中檸檬酸含量。并且在不同柑橘品種中各運(yùn)輸載體基因在檸檬酸積累的過程中發(fā)揮的作用不盡相同[24]。有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因CHX和DIC可將檸檬酸從液泡中運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)中促進(jìn)其降解，Lin 等[13]的研究證實(shí)低酸的溫州蜜柑中CitCHX和CitDIC基因表達(dá)水平顯著高于高酸品種‘高橙’，同時(shí)在煙草葉片中瞬時(shí)超表達(dá)CitCHX和CitDIC基因可顯著降低煙草葉片中檸檬酸含量。在‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育期CmCHX和CmVHP2基因表達(dá)量變化與檸檬酸含量變化趨勢并不一致；而檸檬酸含量受CmDIC基因負(fù)調(diào)控，與此同時(shí)CmVHA-c4基因的表達(dá)模式與檸檬酸的變化趨勢相近，認(rèn)為CitDIC和CmVHA-c4基因在‘馬家柚’果實(shí)檸檬酸的積累過程中發(fā)揮著重要作用。

柑橘果實(shí)發(fā)育過程中檸檬酸的積累與檸檬酸降解基因的表達(dá)相關(guān)，檸檬酸可以通過多個(gè)途徑進(jìn)行降解，主要有谷氨酰胺途徑、γ-氨基丁酸（GABA）和乙酰輔酶A 3 個(gè)途徑。Terol 等[29]研究了甜橙、橘、檸檬等多個(gè)柑橘種類果實(shí)發(fā)育過程中檸檬酸的變化規(guī)律及CcACOs基因的表達(dá)水平變化，結(jié)果表明在除檸檬外的大部分品種中CcACOs基因的表達(dá)能促進(jìn)果實(shí)中檸檬酸的降解。在椪柑葉片及果實(shí)中瞬時(shí)超表達(dá)CitAco3基因或調(diào)控CitAco3基因的轉(zhuǎn)錄因子基因CitNAC62和CitWRKY1時(shí)均能顯著降低其檸檬酸含量[30]，同時(shí)Chen 等[31]研究發(fā)現(xiàn)熱處理能促進(jìn)柑橘果實(shí)CitAco3基因的上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致檸檬酸下降。以上研究均說明ACO基因在促進(jìn)檸檬酸降解的途徑中發(fā)揮著重要作用。另外，有研究報(bào)道在臍橙果實(shí)生長發(fā)育過程中，CitAco3-CitIDH1-CitGS2的級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能參與了不同環(huán)境下檸檬酸的降解，而CitGS2基因是谷氨酰胺途徑中的關(guān)鍵酶基因[27]。Katz 等[16]發(fā)現(xiàn)果實(shí)檸檬酸含量下降過程中GAD 酶活性持續(xù)升高，同時(shí)Lin 等[32-33]證實(shí)在椪柑的果實(shí)成熟過程中，以及在低溫誘導(dǎo)下檸檬酸的降解主要與CitGAD4基因的表達(dá)密切相關(guān)，Sheng 等[34]的研究表明HB 柚采后儲(chǔ)存過程中CitGABA-T基因高表達(dá)導(dǎo)致了檸檬酸的降解，而CitGAD4和CitGABA-T基因均是GABA 途徑上關(guān)鍵的酶基因。在柑橘不同品種果實(shí)發(fā)育過程對(duì)轉(zhuǎn)錄本的分析表明乙酰輔酶A 途徑的關(guān)鍵基因ACLs對(duì)果實(shí)檸檬酸含量的調(diào)控作用根據(jù)品種的不同而有所差異，同時(shí)僅有CitACLβ1基因可以受干旱和ABA 誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)造成檸檬酸含量的顯著上升[35]，在溫州蜜柑和紐荷爾臍橙果實(shí)中也發(fā)現(xiàn)編碼ACL 的基因表達(dá)升高導(dǎo)致檸檬酸含量的降低，說明CitACL基因在檸檬酸降解過程中發(fā)揮著重要作用[36]。本研究的結(jié)果顯示CmACLβ1基因在‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育中后期低水平表達(dá)是檸檬酸積累的重要原因；CmAco3基因在檸檬酸下降時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)，因此認(rèn)為CmAco3基因在果實(shí)成熟期檸檬酸降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而檸檬酸前期緩慢積累后期大量積累也受降解基因CmGS2前期的高表達(dá)以及后期的低水平表達(dá)所控制，說明谷氨酰胺途徑是‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育前期檸檬酸降解的重要途徑之一。CmGAD5和CmGABA-T基因的表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育前中期表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，而在后期顯著上調(diào)表達(dá)，說明CmGAD5和CmGABA-T基因是‘馬家柚’果實(shí)在成熟期檸檬酸降解的關(guān)鍵基因，且在‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育后期（果實(shí)成熟期）檸檬酸降解主要以GABA 途徑為主；而CmACLβ1基因可能是馬家柚果實(shí)膨大期調(diào)控檸檬酸積累的重要因素，其下調(diào)表達(dá)直接導(dǎo)致檸檬酸的快速積累，由此說明乙酰輔酶A 途徑可能是果實(shí)發(fā)育前期檸檬酸降解的重要途徑。因此‘馬家柚’果實(shí)發(fā)育期間檸檬酸降解在不同時(shí)間段主要通過不同的代謝途徑進(jìn)行，而不同柑橘品種在果實(shí)發(fā)育期檸檬酸降解途徑是有差異的，如早熟溫州蜜柑在果實(shí)發(fā)育期其檸檬酸降解是通過谷氨酰胺和GABA 途徑進(jìn)行[14]，普通溫州蜜柑在果實(shí)發(fā)育期檸檬酸降解則主要通過谷氨酰胺途徑進(jìn)行[6]，而‘紐荷爾’臍橙則主要通過GABA 途徑降解檸檬酸，CsAcos、CsIDH1/3與CsGAD4表達(dá)水平?jīng)Q定果實(shí)檸檬酸含量[37]。

本研究明確了‘馬家柚’果實(shí)有機(jī)酸在整個(gè)發(fā)育期的變化規(guī)律，其有機(jī)酸以檸檬酸為主，檸檬酸積累呈先上升后下降的趨勢。在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期檸檬酸的積累并不由檸檬酸合成相關(guān)基因決定，而是由檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因以及降解基因決定。在果實(shí)發(fā)育前中期，檸檬酸的積累主要受CmDIC、CmVHA-c4、CmGS2和CmACLβ1基因的調(diào)控，其代謝主要是通過谷氨酰胺途徑和乙酰輔酶A 途徑進(jìn)行；而在果實(shí)發(fā)育后期檸檬酸的積累在受CmVHA-c4基因調(diào)控的同時(shí)也受CmAco3、CmGAD5和CmGABA-T的調(diào)控，其降解主要通過GABA 途徑進(jìn)行；因此本研究豐富了柑橘類果實(shí)發(fā)育期檸檬酸積累及代謝規(guī)律。

致謝：江西省柑橘產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（JXARS-07）同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！