帕羅西汀對慢性應激性小鼠抑郁樣行為和干細胞因子的影響

魏 樂，黃欣怡，顏夢園，李 箏，段月梅，唐中秋

湖南醫(yī)藥學院(湖南 懷化 418000)

抑郁癥是臨床上常見的情緒障礙疾病，一般表現(xiàn)為情緒低下、興趣減退、快感缺失、認知障礙，甚至出現(xiàn)自殺等。目前，全球近3億人患有抑郁癥，發(fā)病率、致殘率和死亡率均逐年增加[1]。據(jù)相關統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，抑郁癥將成為危害人類身心健康的重大疾病[2]。抑郁癥的發(fā)病機制及其治療也引起了國內外廣大學者的高度重視。但抑郁癥的發(fā)病機制極其復雜，至今尚未完全研究清楚，因此抗抑郁藥物的研發(fā)受到很大限制，目前抗抑郁藥物治療仍然不盡人意，因此深入研究抑郁癥的發(fā)病機制對于防治抑郁癥極為重要。

目前已發(fā)現(xiàn)抑郁癥的發(fā)病機制與海馬突觸可塑性的損傷、神經發(fā)生等密切相關[3]。干細胞因子(SCF)是近年發(fā)現(xiàn)的一種多功能細胞因子[4]。SCF構成的信號通路對多種細胞具有調控作用[5]。SCF在中樞神經系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，尤其在海馬突觸電位的傳遞、學習和記憶中發(fā)揮作用[6]。SCF被證明和中樞神經系統(tǒng)的神經元軸突的生長有關，且SCF作為一個細胞因子可通過血腦屏障影響神經發(fā)生和神經保護[7]。研究發(fā)現(xiàn)在SCF的受體c-KIT突變小鼠中降低c-KIT表達后，小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為[8]。臨床研究表明高血壓伴抑郁癥患者的血清SCF水平明顯降低[9]。但是抑郁癥造模是否可降低小鼠SCF水平，以及抗抑郁藥物帕羅西汀是否可升高抑郁小鼠SCF水平仍有待研究。本研究將從SCF這一新思路進一步揭示帕羅西汀的抗抑郁機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與試劑

1.1動物雄性昆明小鼠共45只，清潔級，體質量18～20 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.2藥品和試劑鹽酸帕羅西汀(中美天津史克制藥有限公司，國藥準字H10950043)。

1.3分組和造模45只小鼠隨機分為對照組、應激組和治療組，每組15只。對照組小鼠進行正常喂養(yǎng)。應激組和治療組的小鼠均進行慢性不可預測溫和刺激(CUMS)，包括9種應激：異物24 h、禁食24 h、禁水24 h、熱水游泳(45℃)5 min、冰水游泳(4℃)5 min、夾尾1 min、潮濕墊料24 h、傾斜(45°)24 h、空籠24 h，每天隨機選取以上2種不同應激因素，不重復，連續(xù)應激4周。治療組小鼠在慢性應激的第4周開始進行帕羅西汀(10 mg/kg，7 d)灌胃治療1周，第4周后各組小鼠進行行為學檢測(新環(huán)境攝食抑制、懸尾、強迫游泳)和蛋白質免疫印跡檢測。

1.4行為學檢測

1.4.1 新環(huán)境攝食抑制實驗 該實驗動物在新的環(huán)境中且處于饑餓狀態(tài)下產生攝食和對新環(huán)境恐懼的矛盾沖突。抑郁的動物將產生新環(huán)境恐懼，攝食潛伏期較長。給予抗抑郁藥物治療后可使動物的沖突反應降低，攝食的潛伏期縮短。實驗前應禁食24 h，然后將小鼠放入1個新房間并給予食物，記錄小鼠前爪抓起食物進食的潛伏期，同時統(tǒng)計30 min內小鼠新老籠子的進食量[10]。

1.4.2 懸尾 將小鼠通過固定動物尾部使其頭向下懸掛，小鼠在該環(huán)境中拼命掙扎試圖逃跑又無法逃脫，從而提供了一個無可回避的壓迫環(huán)境，記錄小鼠5 min內的不動時間[11]。不動時間可反映出動物的行為絕望狀態(tài)，不動時間越長，表明小鼠行為絕望狀態(tài)越嚴重，越傾向于抑郁癥。

1.4.3 強迫游泳 將小鼠置于底部直徑為20 cm，高40 cm，水深30 cm，水溫(25±1)℃的圓柱形塑料桶中，進行6 min游泳實驗，前2 min作為“前游泳”階段，后4 min作為“測試階段”，統(tǒng)計后4 min內小鼠游泳的不動時間、攀爬時間和游泳時間。游泳不動，指小鼠處于靜止不動狀態(tài)，除了為防止沒入水中而向上的主動運動外，無其他行為[12]。

1.5蛋白質印跡法(WesternBlot，WB)檢測各組小鼠SCF和c-KIT的蛋白表達水平行為學結束后，腹腔注射7%水合氯醛麻醉后，取腦組織海馬，用生理鹽水沖洗多余雜質，置于-80℃冰箱保存。做WB實驗前將海馬組織取出置于冰上解凍，按照BCA法說明書進行蛋白定量，計算蛋白濃度。按照目的蛋白分別進行配膠、上樣、電泳、切膠、轉膜、封閉、孵育一抗和二抗、洗膜、顯影、計算。

2 結果

2.1小鼠新環(huán)境攝食抑制實驗的比較在新環(huán)境攝食抑制實驗中，應激組小鼠的進食潛伏期明顯高于對照組(P<0.01，圖1A)，且新籠子進食量低于對照組(P<0.01，圖1B)，但是各組小鼠老籠子進食量無顯著性差異(P>0.05，圖1C)。治療組進食潛伏期明顯低于應激組(P<0.05，圖1A)，且新籠子進食量高于應激組(P<0.01，圖1B)，但是各組小鼠的老籠子攝食量無明顯差異(P>0.05，圖1C)。

注：A:進食潛伏期；B：新籠子進食量；C：老籠子進食量；與對照組比較，**：P<0.01；與應激組比較，#：P<0.05，##：P<0.01。圖1 各組小鼠新環(huán)境攝食抑制實驗潛伏時間和新老籠子攝食量比較

2.2小鼠懸尾實驗比較在懸尾實驗中，應激組小鼠不動時間明顯高于對照組(P<0.05，圖2)。治療組小鼠不動時間明顯低于應激組(P<0.01，圖2)。

注：與對照組比較，*：P<0.05；與應激組比較，##：P<0.01。圖2 各組小鼠不動時間比較

2.3小鼠強迫游泳實驗比較應激組小鼠不動時間明顯高于對照組(P<0.05，圖3)。治療組小鼠不動時間明顯低于應激組(P<0.05，圖3)。

注：與對照組比較，*：P<0.05；與應激組比較，#：P<0.05。圖3 各組小鼠不動時間的比較

2.4小鼠SCF蛋白表達水平比較應激組小鼠的SCF蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05，圖4)。治療組小鼠的SCF蛋白表達水平明顯高于應激組(P<0.05，圖4)。

注：與對照組比較，*：P<0.05；與應激組比較，#：P<0.05。圖4 各組小鼠SCF蛋白表達水平的比較

3 討論

抑郁癥是一種反復發(fā)作的精神類疾病，以明顯而持久的心境低落和認知障礙等為主要特征[13]。抑郁癥的病因及發(fā)病機制極為復雜，與遺傳、社會、心理、環(huán)境和生物化學等均有關，至今尚未完全明確。相關研究表明抑郁癥的發(fā)病機制與突觸可塑性緊密相連[14]，但研究甚少。目前CUMS造模方式已被國內外研究學者廣泛應用于抑郁癥的防治研究，該造模方式所造成動物模型的病理生理改變與人類抑郁癥患者相似[15]。本文結果顯示應激組小鼠新環(huán)境攝食抑制實驗的潛伏期、懸尾和強迫游泳不動時間明顯高于對照組(P<0.05)。

SCF是多功能細胞生長因子的一種，在調控機體細胞生長中發(fā)揮關鍵作用[16]。SCF可通過多種信號通路激活受體c-KIT，最終作用于不同的組織細胞，發(fā)揮不同的作用[17]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)[18]SCF在神經元突觸可塑性過程中也是必不可少的因素。SCF在抗腦缺血再灌注損傷中具有促進神經功能恢復的作用[19]。本研究結果顯示，應激組小鼠海馬SCF蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，慢性應激對小鼠海馬SCF蛋白表達具有抑制作用。

目前抑郁癥有一系列治療手段，包括各種抗抑郁藥物、心理療法和電休克療法[20]。新型的抗抑郁藥物帕羅西汀是一種選擇性5-HT再攝取抑制劑，可用于治療各種類型的抑郁癥。本實驗治療組抑郁小鼠經灌胃帕羅西汀后，應激小鼠潛伏期和不動時間明顯降低，且SCF表達水平明顯增加(P<0.05)，表明帕羅西汀可提高海馬SCF蛋白水平并改善抑郁樣行為。

綜上所述，帕羅西汀對慢性應激性小鼠抑郁樣行為具有明顯的改善作用，且上調干細胞因子SCF的表達水平。因此SCF可能參與帕羅西汀改善慢性應激誘導的抑郁樣行為。