血清miR-483-5p miR-487b表達與膿毒癥所致急性肺損傷患者炎性因子病情和預(yù)后的關(guān)系研究

戴 梅， 王 麗， 沙 丹， 張 薇， 王 昕， 雷育軍

(1.長江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院, 湖北 仙桃 433000 2.武漢金域醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司， 湖北 武漢 430000)

膿毒癥是宿主對感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙，膿毒癥誘導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)可損害組織和器官功能，其中肺是最易受累的器官之一，表現(xiàn)為肺部大量中性粒細胞浸潤，細胞因子、趨化因子和活性氧等過度產(chǎn)生，引起不可控的炎癥反應(yīng)和急性肺損傷(acute lung injury，ALI)[1]。過度炎癥反應(yīng)是ALI發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)，炎癥反應(yīng)可破壞肺泡-毛細血管屏障，導(dǎo)致肺水腫和氣體交換嚴重受損[2]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)是天然存在的、高度保守的轉(zhuǎn)錄物家族，主要通過促進信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)降解或抑制 mRNA 翻譯來調(diào)節(jié)基因表達，涉及細胞發(fā)育、分化和信號傳導(dǎo)的各種過程，部分miRNA 參與B 細胞、T 細胞和樹突細胞分化和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)[3]。miR-483-5p可調(diào)節(jié)其靶基因-細胞因子信號通路抑制因3促使細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和單核細胞趨化蛋白-1的分泌[4]，miR-487b可靶向白細胞介素-33(interleukin-33，IL-33)抑制巨噬細胞激活，繼而抑制IL-33誘導(dǎo)的抗原呈遞細胞、共刺激分子以及促炎介質(zhì)的表達，發(fā)揮抗炎作用[5]。miR-483-5p、miR-487b與膿毒癥所致ALI的報道十分少見，鑒于此，本研究擬探討miR-483-5p、miR-487b與膿毒癥所致ALI的關(guān)系，以期為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1臨床資料:選擇2018年9月至2021年12月我院收治的133例膿毒癥患者，納入標準：①膿毒癥參考《中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》診斷標準[6]；②年齡18周歲以上。排除標準：①創(chuàng)傷、肺部手術(shù)、溺水、有毒氣體吸入等導(dǎo)致的ALI；②經(jīng)臨床確診的肺癌、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、肺纖維化等肺部疾??；③自身免疫疾病，血液系統(tǒng)疾病。其中51例合并ALI(ALI組)，82例未合并ALI(NALI組)，ALI參考2012年柏林急性呼吸窘迫綜合征診斷標準[7]。根據(jù)氧合指數(shù)(氧分壓/吸入氣氧濃度]將ALI組分為輕度組(201～300mmHg)16例、中度組(101～200mmHg)20例和重度組(≤100mmHg)15例[8]。追蹤膿毒癥所致ALI患者28d生存狀況并將ALI組分為生存組(28例)、死亡組(23例)。另選擇同期于我院體檢中心體檢的43例志愿者為對照組，均排除急慢性感染、肺癌、肺炎、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病。

1.2實驗室檢測方法:ALI組患者入住急診重癥醫(yī)學(xué)科立即(基線)、住院3d、住院7d(對照組體檢當日檢測一次，NALI組入院當日檢測一次)采集靜脈血完善實驗室檢查，其中干燥試管(3mL)標本室溫下靜置30～60min后取上層血清離心(3000rpm，半徑10cm，時間10min)后-20℃保存?zhèn)溆?。取?fù)融血清標本20μL，加入TRIzol試劑(Invitrogen生命技術(shù)公司，美國)提取總RNA，全波長酶標儀(型號Multiskan SkyHigh，賽默飛公司，美國)選取OD260：OD2801.8～2.0樣本，miRNeasy試劑盒(Qiagen公司，德國)提取miRNA，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit試劑盒(北京天根生化科技有限公司)將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2μL cDNA樣品加入反應(yīng)體系，RT-qPCR系統(tǒng)(型號CFX96，BIO-RAD公司，美國)進行基因表達分析，2-ΔΔCt法計算miR-483-5p、miR-487b相對表達水平，引物設(shè)計金斯瑞生物科技公司合成，引物序列，反應(yīng)體系和條件見表1。取復(fù)融血清標本，采用Varioskan LUX多功能酶標儀(美國賽默飛公司)運用酶鏈免疫吸附試驗檢測血清白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-33水平，試劑盒購自美國賽默飛公司。

表1 引物序列反應(yīng)體系和條件

2 結(jié) 果

2.1ALI組、NALI組、對照組基線資料和實驗室指標比較:ALI組、NALI組、對照組年齡和性別比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，ALI組膿毒癥休克比例、機械通氣比例、APACHE Ⅱ評分、血清基線miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33水平高于NALI組(P<0.05)，氧合指數(shù)、血清基線miR-487b表達低于NALI組(P<0.05)，見表2。

表2 基線資料差異

2.2不同病情嚴重程度患者臨床資料血清miR-483-5p、miR-487b表達和炎性因子水平比較:三組住院后miR-483-5p、miR-487b表達，IL-6、TNF-α、IL-33水平差異顯著(F組間=56.127、69.353、42.807、39.424、50.247，P<0.05)。輕度組血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33于住院3d輕度升高后，于住院7d下降，miR-487b表達于住院3d輕度下降后，于住院7d增高，中度組和重度組住院后血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33逐漸增高，miR-487b表達逐漸降低(F時間=32.052、41.009、22.427、28.724、30.524，P<0.05)。三組間存在交互效應(yīng)(F交互=29.352、35.642、15.667、20.598、25.609，P<0.05)。重度組基線、住院3d、住院7d血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33水平高于中度組和輕度組(P<0.05)，且中度組高于輕度組(P<0.05)，miR-487b表達低于中度組和輕度組(P<0.05)，且中度組低于輕度組(P<0.05)。重度組APACHE Ⅱ評分高于中度組和輕度組(P<0.05)，氧合指數(shù)低于中度組和輕度組(P<0.05)，中度組血清APACHE Ⅱ評分高于輕度組(P<0.05)，氧合指數(shù)低于輕度組(P<0.05)。重度組、中度組膿毒癥休克比例和死亡率高于輕度組(P<0.05)，重度組、中度組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同病情嚴重程度患者臨床資料和基線血清miR-483-5p miR-487b表達和炎性因子水平差異

2.3膿毒癥所致ALI患者不同預(yù)后患者血清miR-483-5p、miR-487b表達和炎性因子水平比較:兩組住院后miR-483-5p、miR-487b表達，IL-6、TNF-α、IL-33水平差異顯著(F組間=63.235、59.485、73.681、42.152、38.452，P<0.05)。生存組血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33于住院3d輕度升高后，于住院7d下降，miR-487b表達于住院3d輕度下降后，于住院7d增高，死亡組住院后血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33逐漸增高，miR-487b表達逐漸降低(F時間=62.351、69.358、43.285、38.152、29.657，P<0.05)。兩組間存在交互效應(yīng)(F交互=26.351、35.652、28.462、30.265、29.449，P<0.05)。死亡組基線、住院3d、住院7d血清miR-483-5p表達，IL-6、TNF-α、IL-33水平高于生存組(P<0.05)，miR-487b表達低于生存組(P<0.05)。見表4。

表4 膿毒癥所致ALI患者不同預(yù)后患者血清miR-483-5p miR-487b表達和炎性因子水平差異

2.4血清miR-483-5p、miR-487b表達與炎性因子水平相關(guān)性:膿毒癥所致ALI患者基線、住院3d、住院7d血清miR-483-5p表達與IL-6、TNF-α、IL-33水平呈正相關(guān)(P<0.05)，miR-487b表達與IL-6、TNF-α、IL-33水平呈負相關(guān)(P<0.05)，見表5。

表5 血清miR-483-5p miR-487b表達與炎性因子相關(guān)系數(shù)(r，P)

2.5miR-483-5p、miR-487b預(yù)測膿毒癥所致ALI的價值分析:住院7dmiR-483-5p、miR-487b預(yù)測膿毒癥所致ALI的曲線下面積高于基線和住院3d miR-483-5p、miR-487b(z=2.156、2.337；2.059、2.097，P<0.05)，基于二元Logistic回歸分析聯(lián)合住院7dmiR-483-5p和miR-487b預(yù)測膿毒癥所致ALI的曲線下面積為0.964，經(jīng)DeLong檢驗大于單獨檢測(z=2.612、3.141，P<0.05)，見表6和圖1。

表6 miR-483-5p miR-487b預(yù)測膿毒癥所致ALI的效能

圖1 miR-483-5p、miR-487b預(yù)測膿毒癥所致ALI的ROC圖

3 討 論

ALI是臨床常見的危及生命的重癥疾病，肺部中性粒細胞浸潤和介導(dǎo)不可控的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致肺泡毛細血管膜屏障功能障礙、肺水腫、呼吸衰竭和死亡的主要原因[9]。miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，參與人類幾乎所有的生理病理活動過程，其中不乏炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，據(jù)報道m(xù)iRNA可調(diào)節(jié)巨噬細胞極化及其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[10]，還可直接調(diào)節(jié)炎癥因子參與炎癥反應(yīng)過程[11]。

miR-483-5p與炎癥疾病存在密切關(guān)系，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)miR-483-5p可調(diào)節(jié)血紅素加氧酶-1促使氧化應(yīng)激和肥大細胞成熟、T細胞趨化因子表達以及樹突狀細胞脫顆粒，導(dǎo)致過敏反應(yīng)發(fā)生[12]，miR-483-5p在特應(yīng)性皮炎患兒血清中表達上調(diào)，調(diào)節(jié)皮膚慢性炎癥反應(yīng)過程[13]。miR-483-5p在膿毒癥中也表達上調(diào)，且與膿毒癥嚴重程度以及預(yù)后密切相關(guān)[14]。但是miR-483-5p是否與膿毒癥所致ALI有關(guān)尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)ALI組患者血清基線miR-483-5p表達高于NALI組和對照組，說明miR-483-5p與膿毒癥介導(dǎo)的ALI也存在密切關(guān)系。進一步觀察發(fā)現(xiàn)ALI組患者中度和重度組基線至住院7d血清miR-483-5p表達逐漸增高，輕度組則在住院3d后表達下降，組間比較中度和重度組基線、住院3d、住院7d miR-483-5p表達均高于輕度組，表明miR-483-5p表達隨著ALI病情加重而增加，miR-483-5p表達與ALI病情嚴重程度有關(guān)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白抑制劑和轉(zhuǎn)錄激活因子 1(Protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription-1，PIAS1)是炎癥信號網(wǎng)絡(luò)的重要調(diào)節(jié)因子，可通過激活調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶通路抑制炎性細胞粘附，降低IL-6水平[15]，PIAS1是miR-483-5p的直接靶點，miR-483-5p通過負性調(diào)控PIAS1表達增加IL-6和白細胞介素-1β水平，本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示miR-483-5p表達與IL-6、TNF-α、IL-33呈正相關(guān)，推測miR-483-5p通過促使炎癥反應(yīng)加劇膿毒癥肺損傷進展。本研究結(jié)果表明miR-483-5p高表達與膿毒癥所致ALI患者預(yù)后不良也有關(guān)，ROC分析結(jié)果也顯示住院7d miR-483-5p預(yù)測膿毒癥所致ALI患者預(yù)后具有較高的效能，提示住院7d的miR-483-5p可作為膿毒癥所致ALI預(yù)后的標志物。

在炎癥背景下，miR-487b通過抑制基因轉(zhuǎn)錄、阻止翻譯和破壞mRNA穩(wěn)定性來抑制IL-6、TNF-α等細胞因子的產(chǎn)生[16]，miR-487b可直接靶向IL-33，抑制IL-33和生長刺激表達因子2蛋白表達，抑制促炎細胞因子白細胞介素-4、白細胞介素-5和白細胞介素-13水平。本研究發(fā)現(xiàn)miR-487b在膿毒癥所致ALI患者血清呈低度表達，且miR-487b表達與IL-6、TNF-α、IL-33呈負相關(guān)，說明miR-487b是炎癥反應(yīng)的負向調(diào)控因子，miR-487b表達缺失可能促使炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致膿毒癥病情進展。通過追蹤臨床結(jié)局發(fā)現(xiàn)miR-487b與膿毒癥患者預(yù)后有關(guān)，死亡組基線至住院7d血清miR-487b表達逐漸降低，且基線、住院3d、住院7d血清miR-487b表達均低于存活組，說明miR-487b持續(xù)低表達可促使ALI病情進展和不良結(jié)局發(fā)生。分析原因為miR-487b表達缺失，其抗炎作用減弱，導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)，加速肺損傷。ROC分析結(jié)果顯示住院7d的miR-487b預(yù)測膿毒癥所致ALI患者預(yù)后的曲線下面積為0.762，說明住院7d的miR-487b具有預(yù)測患者預(yù)后的效能，聯(lián)合住院7d的miR-487b和miR-483-5p后預(yù)測效能明顯提高，表明住院7d miR-483-5p表達上調(diào)，miR-487b表達下調(diào)可能預(yù)示更高的死亡風險。

綜上，膿毒癥所致ALI患者血清miR-483-5p表達上調(diào)，miR-487b表達下調(diào)，miR-483-5p過表達，miR-487b低表達與膿毒癥所致ALI患者病情加重和不良預(yù)后有關(guān)，住院7d的miR-483-5p、miR-487b可作為預(yù)后預(yù)測的生物學(xué)指標。miR-483-5p、miR-487b可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與膿毒癥所致ALI的發(fā)病過程。