北京黑豬肌內(nèi)脂肪含量高、低組間脂質(zhì)組差異分析

張 潤(rùn)，劉 海，楊 曼，張龍超*，王 源

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 3.北京黑六牧業(yè)科技有限公司， 北京 102211)

豬肉是世界上最廣泛消費(fèi)的肉類，尤其是在中國(guó)。以2020年國(guó)家統(tǒng)計(jì)年鑒數(shù)據(jù)為例，豬肉消費(fèi)量占年肉類消費(fèi)總量的75.46%。在過(guò)去的幾十年里，豬的選擇主要集中在生長(zhǎng)性狀和瘦肉率上。現(xiàn)代豬品種選擇性育種的目標(biāo)導(dǎo)致脂肪生成潛力強(qiáng)烈降低，然而近些年由于對(duì)生物多樣性的重要性和集約化生產(chǎn)系統(tǒng)的負(fù)面影響的認(rèn)識(shí)，導(dǎo)致了對(duì)培育地方豬種的興趣增加。肌內(nèi)脂肪的差異導(dǎo)致烹飪后產(chǎn)生芳香化合物的不同，最終香氣特征也會(huì)不同，這為肌內(nèi)脂肪含量是肉品質(zhì)特性及其消費(fèi)者可接受性的重要決定因素提供支撐。而目前的商品豬在肌肉中沉積的脂肪比本地豬種少。中國(guó)地方豬種，通常被稱為脂肪型豬，比外來(lái)豬種有更豐富的脂肪。降低背膘厚(BFT)和增加IMF含量是現(xiàn)代豬育種計(jì)劃的目標(biāo)，也滿足了消費(fèi)者保持健康的需求。地方豬種對(duì)其特定環(huán)境條件和飼養(yǎng)資源的適應(yīng)性更強(qiáng)，因此是一種寶貴的遺傳資源。與現(xiàn)代品種相比，它們能夠沉積更多的脂肪，具有獨(dú)特的生脂能力，以及更好的脂肪酸組成。保持了高的脂質(zhì)沉積能力，這反映在皮下脂肪組織和IMF含量的增加。北京黑豬是我國(guó)著名的培育品種，有著肌內(nèi)脂肪高，肉味濃郁的特點(diǎn)，因其肉質(zhì)優(yōu)良，風(fēng)味獨(dú)特非常受消費(fèi)者歡迎。作為可持續(xù)的地方豬肉鏈的基礎(chǔ)，在北京當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要作用。

大理石花紋是肌肉纖維之間或肌肉束之間的脂肪堆積，這種脂肪被稱為肌內(nèi)脂肪(IMF)。結(jié)締組織在肌纖維之間或肌束之間的空間中發(fā)育，IMF沿結(jié)締組織積聚。IMF是一種重要的豬肉感官品質(zhì)，它影響消費(fèi)者的偏好和豬肉的溢價(jià)。IMF是肌肉纖維中與瘦肉混合的可見(jiàn)脂肪條紋，決定豬肉的感官品質(zhì)，如風(fēng)味、嫩度和多汁性，其已被證明是影響感官肉質(zhì)的主要決定因素。事實(shí)上一些研究表明，在IMF和豬肉的多汁性和嫩度之間存在有利的關(guān)系，IMF的最低閾值水平是使豬肉嫩度最大化所必需的。當(dāng)IMF含量高于2.5%時(shí)，豬肉的風(fēng)味和多汁性增強(qiáng)。豬的脂肪代謝和IMF發(fā)育受飲食營(yíng)養(yǎng)、基因及其代謝途徑的控制。豬肉風(fēng)味性狀在很大程度上取決于產(chǎn)生和沉積脂質(zhì)的代謝過(guò)程。因此，為了提高肉質(zhì)風(fēng)味性狀，需要更好的了解豬肌肉組織中脂質(zhì)的構(gòu)成，以此找到影響IMF的目標(biāo)脂質(zhì)并有目的的改善肉品質(zhì)。肌內(nèi)脂肪由磷脂、甘油三酯和膽固醇組成。甘油三酯的合成、降解和攝取之間的平衡反映在IMF含量中。北京黑豬、東北民豬、五指山豬的飽和脂肪酸總量低于DLY豬，而不飽和脂肪酸總量高于雜交豬。脂肪生成被定義為葡萄糖轉(zhuǎn)化為甘油三酯，它提供了豬體內(nèi)至少80%的沉積脂肪酸。脂肪酸決定了肉類脂肪的熔點(diǎn)和品質(zhì)，與肉類的食用品質(zhì)密切相關(guān)。脂質(zhì)在通過(guò)自氧化或熱氧化形成生肉氣味和熟肉風(fēng)味方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。脂質(zhì)的熱氧化能力取決于脂肪酸的種類，以及單個(gè)脂質(zhì)分子和脂質(zhì)類別的結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，低IMF減少了來(lái)自美拉德反應(yīng)的揮發(fā)性化合物和熟腌豬肉火腿令人愉悅的香氣屬性。有研究表明，不同風(fēng)味的雞肉可以用脂質(zhì)組很明顯的區(qū)分。但到目前為止，利用脂質(zhì)組學(xué)方法鑒別豬肉不同肌肉或鑒別豬肉品種的研究還很少。

為了研究北京黑豬背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量與脂質(zhì)的關(guān)系，本試驗(yàn)就北京黑豬肌內(nèi)脂肪高低兩組進(jìn)行了非靶向脂質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)，并利用每一類脂質(zhì)脂肪酸鏈的信號(hào)值進(jìn)行多元化分析。本研究旨在獲得中國(guó)地方豬肉脂肪組成的更全面信息，并進(jìn)一步揭示貢獻(xiàn)較大的潛在化學(xué)標(biāo)記。當(dāng)前的數(shù)據(jù)集將有助于更好地了解所研究北京黑豬肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并可以擴(kuò)展到更大的樣本量以進(jìn)行脂質(zhì)標(biāo)記驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

400頭210日齡北京黑豬均在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，樣品采自北京黑六牧業(yè)科技有限公司，于屠宰后2 h內(nèi)采集完畢，取背最長(zhǎng)肌第6、7肋處樣品于2 mL凍存管置于液氮中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 肌內(nèi)脂肪含量的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)室使用SOXTEC脂肪測(cè)定儀，采用索氏提取法提取脂肪。首先除盡外周筋膜，將肉塊切成糜狀待測(cè)。秤取100 g左右肉末置于培養(yǎng)皿中，65 ℃烘箱脫水至恒重(約24 h)。分別秤取2份10 g左右碎肉樣置于水分皿中，打開(kāi)稱量瓶蓋1/2，瓶蓋斜支于瓶邊，65 ℃烘箱脫水(約24 h)，取出后置于干燥器中冷卻至室溫，稱重一次，直至恒重，計(jì)算新鮮肉樣風(fēng)干水分含量。將風(fēng)干肉末置于105 ℃烘箱烘2 h稱重一次，直至絕干恒重，計(jì)算絕干含水量。將恒溫脫水的樣品取出，用打碎機(jī)瞬時(shí)磨為粉狀，稱取3.5 g左右粉狀風(fēng)干樣，用濾紙包好后加入SOXTEC脂肪測(cè)定儀測(cè)定杯中，每個(gè)測(cè)定杯中加入100 mL石油醚，設(shè)定抽提溫度為135 ℃，經(jīng)過(guò)2 h的抽提，最后烘箱105 ℃烘1 h，稱量得到脂肪重量(具體的SOXTEC脂肪測(cè)定儀操作方法見(jiàn)儀器使用說(shuō)明書)。

肌內(nèi)脂肪含量計(jì)算公式：

1.2.2 非靶向脂質(zhì)組學(xué)測(cè)定 取(60±3) mg左右組織于2 mL組織研磨管中，按比例加入CHCl∶MeOH(2∶1)，如60 mg加入600 μL有機(jī)相，加入的有機(jī)溶劑體積按照組織重量等比例加入即可。全程在冰上操作，用組織研磨儀(北京赫德 GRINDER)研磨，參數(shù)設(shè)置，55 Hz，10 s,3次，-20 ℃。按水相與有機(jī)相1∶4的比例，加入水相進(jìn)行分層，渦旋，靜置，如此反復(fù)3次，充分抽提后離心15 min，12 000 r·min，取出下層有機(jī)相360 μL于新的離心管中。按水相與有機(jī)相1∶4的比例，加入水相，對(duì)有機(jī)層進(jìn)行二次萃取，洗掉多余蛋白質(zhì)，渦旋，靜置，重復(fù)3次，充分抽提后離心15 min，12 000 r·min，取出下層有機(jī)相150 μL于新的離心管中，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下吹干有機(jī)溶劑至透明薄膜狀，吹干過(guò)程氮?dú)饬鞑灰^(guò)大，不能加熱。將吹干的樣品保存在-80 ℃冰箱。將處理好的樣品送至清華大學(xué)代謝組平臺(tái)進(jìn)行LC-MS檢測(cè)。

按Tang等的方法使用Cortecs C18柱(2.1*100 mm，2.7 μm，Waters)選擇反相色譜法進(jìn)行LC分離。流動(dòng)相A通過(guò)將400 mL含有0.77 g乙酸銨的HPLC級(jí)水與600 mL HPLC級(jí)乙腈混合來(lái)制備。流動(dòng)相B含有10%乙腈和90%異丙醇。以0.25 mL·min的流速進(jìn)行梯度洗脫，柱溫箱溫度設(shè)置為40 ℃。梯度如下： 0 min，30% B；3.0 min，30% B；4.5 min，33% B；7.0 min，45% B；8.0 min，52% B；11.0 min，58% B；14.0 min，66% B；17.0 min，70% B；21.0 min，75% B；23.0 min，98% B；30.0 min，98% B；30.5 min，30% B；35.0 min，30% B。脂質(zhì)分析在Q Exactive HF orbitrap質(zhì)譜儀(Thermo，CA)和UHPLC系統(tǒng)Ultimate 3000 (Thermo，CA)上進(jìn)行。詳細(xì)的質(zhì)譜儀參數(shù)如下：噴霧電壓，正3.2 kV，負(fù)2.8 kV；毛細(xì)管溫度，320 ℃；鞘氣流量 (arb)，35；輔助氣體流量 (arb)，10；質(zhì)量范圍 (m·z)，240～2 000為正，200～2 000為負(fù)。全MS分辨率，60 000；MS/MS分辨率，15 000；top N，10；使用Lipidsearch 4.2 (Thermo Fisher，USA)對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

用R中的stats包做檢驗(yàn)，使用Metaboanalyst 5.0進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，GraphPad Prism 9.0軟件用于可視化統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 北京黑豬肌內(nèi)脂肪含量高、低組差異分析

從采集的400個(gè)北京黑豬的樣品中按肌內(nèi)脂肪含量的高低選取11個(gè)樣品和19個(gè)樣品分別為高肌內(nèi)脂肪含量組和低肌內(nèi)脂肪含量組。高組中肌內(nèi)脂肪含量最大值為5.00%，最小值為3.09%；低組中肌內(nèi)脂肪含量最大值為1.03%，最小值為0.07%：兩組間檢驗(yàn)得到的值為7.95×10，差異極顯著(表1)。

表1 北京黑豬高、低肌內(nèi)脂肪含量組Table 1 Intramuscular fat content of Beijing black pig in high and low groups

2.2 北京黑豬高、低肌內(nèi)脂肪含量組脂質(zhì)組學(xué)多元分析

在陽(yáng)離子模式下測(cè)定的脂質(zhì)有?；鈮A(AcCa)、甘油二酯(DG)、甘油三酯(TG) 3類，在陰離子模式下測(cè)定的脂質(zhì)有心磷脂(CL)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS) 6類，能確定的組成每一類脂質(zhì)的脂肪酸共104種。主要脂質(zhì)種類為PE(29，27.88%)、TG(23，22.12%)、PC(21，20.19%)(圖1A、1B)。

A. 分別在正離子和負(fù)離子模式下檢測(cè)出的脂質(zhì)種類及數(shù)目；B. 各脂質(zhì)種類分別占全部的比例；C. 高、低組間PCA結(jié)果展示；D. 高、低組間PLS-DA結(jié)果展示A. The types and numbers of lipids were detected in positive and negative ion modes, respectively; B. All kinds of lipids account for the total proportion, respectively; C. PCA results display between high and low groups; D. PLS-DA results display between high and low groups圖1 脂質(zhì)譜分布圖與多元分析比分圖Fig.1 Lipid distribution chart and multivariate analysis score chart

為了區(qū)分北京黑豬高、低肌內(nèi)脂肪含量組的完整脂質(zhì)組學(xué)特征，使用多變量統(tǒng)計(jì)分析脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。對(duì)組成每一類脂質(zhì)的脂肪酸進(jìn)行了主成分分析(PCA)和偏最小二乘回歸分析法(PLS-DA)分析。PCA是通過(guò)幾個(gè)主成分來(lái)體現(xiàn)脂質(zhì)組學(xué)多維數(shù)據(jù)下的特征，因此通過(guò)PCA圖可以觀察到兩組間的差異。在PCA圖中，高、低肌內(nèi)脂肪含量組明顯分離(圖1C)，其中第一主成分(PCA1)可以解釋原始數(shù)據(jù)集的45.2%的特征，這表明在高、低肌內(nèi)脂肪含量組間樣品中代謝物有明顯的不同。

偏最小二乘判別分析(PLS-DA)是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，通過(guò)投影分別將預(yù)測(cè)變量和觀測(cè)變量投影到一個(gè)新空間，來(lái)尋找一個(gè)線性回歸模型。PLS-DA分析根據(jù)觀察或測(cè)量到的若干變量值，來(lái)判斷研究對(duì)象如何分類。PLS-DA評(píng)分圖表明，北京黑豬高、低肌內(nèi)脂肪含量組清晰的分為兩類，高組樣品可以與低組樣品明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)(圖1D)。這些結(jié)果表明，兩組之間的脂質(zhì)組成存在差異。

2.3 北京黑豬高、低肌內(nèi)脂肪含量組差異脂肪酸篩選

對(duì)北京黑豬高、低肌內(nèi)脂肪含量組間進(jìn)行了檢驗(yàn)，有差異的脂肪酸有33種，其中TG有23個(gè)，AcCa有2個(gè)，DG有4個(gè)，PE有4個(gè)(圖2A、2B)。可以初步判定這些脂質(zhì)與肌內(nèi)脂肪之間有顯著的聯(lián)系。

A、B. T檢驗(yàn)差異代謝物信息。橫坐標(biāo)是脂質(zhì)名稱，縱坐標(biāo)是歸一化后的脂質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。*. P<0.05；**. P<0.01A, B. T-test differential metabolites information. The abscissa is lipid name; The ordinate is the normalized relative expression of lipid. *. P<0.05; **. P<0.01圖2 差異脂肪酸T檢驗(yàn)柱狀圖Fig.2 T-test histogram of differential fatty acids

根據(jù)構(gòu)建的PLS-DA模型計(jì)算VIP值；以VIP>1為標(biāo)準(zhǔn)篩選的脂肪酸有23個(gè)，其中TG有22個(gè)，DG有1個(gè)。根據(jù)高組與低組間的差異倍數(shù)FC進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)FC>2即上調(diào)的脂肪酸有22種，均為TG，F(xiàn)C<0.5即下調(diào)的脂肪酸為0。綜合3種篩選方法(<0.05，VIP>1，F(xiàn)C>2或FC<0.5)取交集，最終篩選到滿足3個(gè)條件的脂肪酸有22個(gè)(圖3A)，其中TG有21個(gè)，DG有1個(gè)(圖3B)。具體104個(gè)物質(zhì)的3個(gè)指標(biāo)及其上下調(diào)情況見(jiàn)表2。

A. 3種篩選方法結(jié)果對(duì)比；B.綜合P值、VIP值、FC值，共同篩選出的22個(gè)物質(zhì)的類別及數(shù)量A. Comparison of results of three screening methods; B. The category and quantity of 22 substances selected together by P value, VIP value, FC value圖3 3種篩選指標(biāo)對(duì)比韋恩圖與篩選物質(zhì)分布圖Fig.3 Comparison of 3 screening indexes with Venn diagram and distribution diagram of screened substances

表2 肌內(nèi)脂肪高、低組間組成各脂質(zhì)的脂肪酸差異指標(biāo)Table 2 Fatty acid difference index of each lipid between high and low groups of IMF

(續(xù)表2 Continued)

3 討 論

本研究的脂質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果得出，北京黑豬肌內(nèi)脂肪含量高、低組豬肉樣品的脂質(zhì)譜是不同的，初步差異分析篩選出的物質(zhì)主要為AcCa、DG、TG和PE。Lísa等通過(guò)進(jìn)行RP-LC/MS將豬腦提取物分級(jí)成非極性脂質(zhì)、己糖神經(jīng)酰胺(Hex1Cer)、磷酸乙醇胺(PE)、磷酸膽堿(PC)、鞘磷脂(SM)和溶血磷酸膽堿(LPC)類。背最長(zhǎng)肌主要由中性脂質(zhì)組成，主要是甘油三酯(TG)和膽固醇酯(CE)，它們?yōu)槟芰慨a(chǎn)生、膜成分和信號(hào)脂質(zhì)提供底物。Kaabia等發(fā)現(xiàn)了不同物種間的脂質(zhì)差異，但是只有豬的通常脂質(zhì)分布與人重疊，其通過(guò)查詢260個(gè)分子種類的脂質(zhì)庫(kù)，從4 899個(gè)變量中清晰準(zhǔn)確地鑒定出106個(gè)，包括神經(jīng)酰胺(Cer)、鞘脂(SM)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、甘油二酯(DG)和甘油三酯(TG)。Wu和Wang使用MMSE-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，從PE標(biāo)準(zhǔn)品中鑒定出己醛、辛醛、壬醛、癸醛、1-己醇和1-辛烯-3-醇等香味物質(zhì)。說(shuō)明PE對(duì)肉類風(fēng)味有貢獻(xiàn)，本研究進(jìn)行差異分析篩選出的PE(16:1)、PE(18:1)、PE(22:3)、PE(22:5)或許是重要的風(fēng)味前體物質(zhì)。Li等通過(guò)研究閹割對(duì)湖羊脂質(zhì)種類及含量的影響，發(fā)現(xiàn)閹割后大多數(shù)脂質(zhì)種類增加，尤其是TG、DG和PE，與本研究的分組結(jié)果相似的是，閹割后的湖羊肌內(nèi)脂肪是顯著升高的。Tonazzi等報(bào)道，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅱ催化?；鶑娜鈮A向線粒體CoA的酯交換，并釋放AcCa，從而為脂肪酸β-氧化提供酰基CoA底物，也進(jìn)一步說(shuō)明AcCa與脂肪沉積相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

本研究進(jìn)一步篩選后，發(fā)現(xiàn)其主要區(qū)別在于甘油三酯含量的不同，并且其差異極顯著。先前的研究表明，多不飽和脂肪酸(PUFA)的一個(gè)重要來(lái)源是甘油三酯，它是脂肪酸(FAs)的主要載體。Zhang等認(rèn)為，IMF含量的增加主要是由于TG含量增加。Fernandez等進(jìn)行了兩個(gè)試驗(yàn)來(lái)評(píng)估IMF水平對(duì)脂質(zhì)部分的組成和對(duì)背最長(zhǎng)肌的感官品質(zhì)的影響，這兩個(gè)試驗(yàn)均證明了肌肉中甘油三酯含量的增加幾乎完全反映了IMF含量的增加。甘油三酯是哺乳動(dòng)物脂肪組織中能量?jī)?chǔ)存的主要形式，當(dāng)動(dòng)物表現(xiàn)出高日采食量時(shí)，出現(xiàn)高TG水平,高TG水平與高脂肪沉積相關(guān)。Ren等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，金華豬血清甘油三酯(TG)和總膽固醇(TCHO)濃度高于長(zhǎng)白豬。1是Sirtuins家族中研究最多的，已被確定可影響哺乳動(dòng)物的糖異生和脂肪酸氧化。同時(shí)先前的研究發(fā)現(xiàn)，在皮下脂肪組織中，1基因的表達(dá)在中國(guó)地方脂肪品種豬(金華豬)中低于瘦肉型豬(長(zhǎng)白豬)。這與北京黑豬高肌內(nèi)脂肪組比低肌內(nèi)脂肪組中TG含量高結(jié)果相一致。肌內(nèi)脂肪(IMF)主要是儲(chǔ)存在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中的三?；视王?TAG)。BHLB豬肉比DLY豬肉含有更多的甘油三酯，這歸因于BHLB豬肉含有更多的IMF。這些結(jié)果表明，肌內(nèi)脂肪高組中甘油三酯的含量顯著高于肌內(nèi)脂肪低的豬肉，這可能會(huì)影響烹飪過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)的濃度及釋放。Zhao等發(fā)現(xiàn)，與瘦版納小型豬相比，肥胖版納小型豬通過(guò)上調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c、二?；视王；D(zhuǎn)移酶和心臟脂肪酸結(jié)合蛋白，增加了脂肪酸和甘油三酯的合成。

4 結(jié) 論

在本研究中，對(duì)選定的北京黑豬肌內(nèi)脂肪高低組進(jìn)行了全面的比較和脂質(zhì)組分析。通過(guò)化學(xué)和物理計(jì)量學(xué)的方法，找到了鑒別肌內(nèi)脂肪高低豬肉的潛在脂類標(biāo)記。發(fā)現(xiàn)構(gòu)成肌內(nèi)脂肪高低豬肉樣品的脂質(zhì)組差異物質(zhì)主要集中在TG和DG兩類物質(zhì)上。