日糧添加酵母硒對(duì)雞肉線粒體氧化損傷及細(xì)胞凋亡的影響

楊 雪，楊 超，王 拙，唐德富，張 麗*，余群力

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

動(dòng)物屠宰放血后，由于細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧供應(yīng)中斷，進(jìn)而發(fā)生缺血、缺氧和能量逐漸耗盡等劇烈應(yīng)激變化，機(jī)體細(xì)胞為維護(hù)內(nèi)環(huán)境的平衡導(dǎo)致細(xì)胞迅速發(fā)生凋亡。誘發(fā)細(xì)胞凋亡的可能途徑有以下三種：第一種為涉及Cyt-c釋放并激活Caspase-3的內(nèi)源性線粒體信號(hào)途徑；第二種為由Caspase-8和Caspase-10激活介導(dǎo)的外源性死亡受體途徑；第三種為由Caspase-12激活介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)途徑。隨著凋亡概念引入宰后肌肉嫩化，大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)宰后肌肉中的細(xì)胞凋亡酶被激活，且認(rèn)為細(xì)胞凋亡與宰后肌肉的嫩化高度相關(guān)，其中線粒體凋亡途徑被認(rèn)為是引起肌肉嫩度改善的主要途徑。線粒體途徑細(xì)胞凋亡是指線粒體上游信號(hào)分子作用于線粒體膜，隨著線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的打開(kāi)，Cyt-c等凋亡蛋白從孔道中釋放，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔是由多種線粒體蛋白構(gòu)成的復(fù)合孔道，同時(shí)，細(xì)胞過(guò)氧化反應(yīng)積累的活性氧可調(diào)控線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔從而引起線粒體氧化損傷直至細(xì)胞功能缺失甚至凋亡。

大量研究表明，飼糧中添加天然或合成抗氧化劑可顯著提高動(dòng)物宰后肌肉的抗氧化性能。王玉龍和費(fèi)兆生研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加茶葉提取物可顯著提高育肥豬肌肉中GSH-Px等抗氧化酶的活性，提示可能是由于茶葉中的茶多酚進(jìn)入肌細(xì)胞清除過(guò)氧化物，從而提高肌肉的抗氧化能力。李月明研究發(fā)現(xiàn)，日糧中補(bǔ)充活性干酵母制劑可顯著提高牛肉中超氧化物歧化酶的含量并降低活性氧水平，說(shuō)明活性干酵母飼喂對(duì)宰后牛肉抗氧化能力的提高具有積極的作用效果。此外，高毅剛研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)日糧中添加0.2%硒鍺酵母對(duì)延邊黃牛臀肉總抗氧化能力下降具有明顯抑制作用，這是由于日糧中添加硒鍺酵母顯著增加了牛肉中微量元素硒的含量，其可清除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害過(guò)氧化物，進(jìn)而減輕細(xì)胞的氧化損傷。

動(dòng)物屠宰后，凋亡程序開(kāi)始啟動(dòng)，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞ROS的大量積累以及機(jī)體抗氧化能力的減弱，凋亡加劇。線粒體是產(chǎn)生ROS的主要細(xì)胞器，且易受其攻擊產(chǎn)生氧化損傷。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，促凋亡因子可從受損的線粒體中釋放，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡酶，并參與宰后肌肉的嫩化。王琳琳研究發(fā)現(xiàn)，利用N,N,N’,N’-四甲基對(duì)苯二胺二鹽酸鹽處理宰后牦牛肉可減弱線粒體氧化損傷，同時(shí)顯著抑制了Caspase-3及Caspase-9的活性，并導(dǎo)致了嫩度的降低。此外，李文東等研究發(fā)現(xiàn)，快速冷卻可顯著降低牦牛背最長(zhǎng)肌成熟初期的Caspase-3和Caspase-9的活性，最終導(dǎo)致肌原纖維降解的減弱。因此，動(dòng)物宰后成熟過(guò)程中，線粒體發(fā)生氧化損傷可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程從而影響肌肉的嫩化。

目前，對(duì)于飼喂富硒日糧提高宰后動(dòng)物的免疫能力、抗氧化能力及肉品質(zhì)的研究較為廣泛，而在肉雞宰后成熟過(guò)程中，酵母硒飼喂對(duì)線粒體氧化損傷及細(xì)胞凋亡造成何種影響，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文以添加酵母硒日糧飼養(yǎng)的肉雞胸肉為試驗(yàn)對(duì)象，分別測(cè)定宰后成熟過(guò)程中對(duì)照組和酵母硒組的硒含量、抗氧化酶活性、線粒體氧化損傷程度、細(xì)胞凋亡酶活性及嫩度，研究日糧添加酵母硒對(duì)宰后肉雞線粒體氧化損傷及細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)探究酵母硒飼喂對(duì)肉嫩度的影響，以期為營(yíng)養(yǎng)調(diào)控肉雞宰后成熟嫩化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)選用l日齡白羽肉用雛雞180只，隨機(jī)分成3組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。在玉米-雜粕型基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上，參照NRC(1994)營(yíng)養(yǎng)需要添加酵母硒(購(gòu)自加拿大拉曼公司，商品名Lalmin Se 2000，硒含量2 000 mg·kg)，按添加酵母硒水平的不同分為3個(gè)處理組，分別為CK(基礎(chǔ)日糧)組、0.3S組(基礎(chǔ)日糧+0.3 mg·kg酵母硒)和0.6S組(基礎(chǔ)日糧+0.6 mg·kg酵母硒)。在相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)周期為42 d，分為(0～21 d)和(22～24 d)兩個(gè)階段，其中前期(0～21 d)飼糧組成為64.16%玉米、2%植物油、20%豆粕、3%棉籽粕、3%玉米蛋白粉、3%菜籽粕、1.2%石粉、1.7%磷酸氫鈣、0.5%預(yù)混料、0.4%食鹽、0.15%蛋氨酸、0.5%賴氨酸、0.2%小蘇打及0.2%氯化膽堿；營(yíng)養(yǎng)水平為：12.34 MJ·kg代謝能、20%粗蛋白、1%鈣、0.45%有效磷、1.15%賴氨酸、0.54%蛋氨酸。后期(22～24 d)飼糧組成為65.27%玉米、3.5%植物油、16%豆粕、4%棉籽粕、3%玉米蛋白粉、4%菜籽粕、1.1%石粉、1.2%磷酸氫鈣、0.5%預(yù)混料、0.35%食鹽、0.16%蛋氨酸、0.48%賴氨酸、0.24%小蘇打及0.2%氯化膽堿；營(yíng)養(yǎng)水平為：12.97 MJ·kg代謝能、18%粗蛋白、0.8%鈣、0.35%有效磷、1.05%賴氨酸、0.4%蛋氨酸。其中，代謝能是根據(jù)原料組成計(jì)算所得(干物質(zhì)為基礎(chǔ))，其他均為實(shí)測(cè)值。飼養(yǎng)結(jié)束后，將180只白羽肉雞割斷頸靜脈，放血2 min處死。去內(nèi)臟，取出雞胸肉(盡量保護(hù)細(xì)胞組織)。在宰后0 h和4 ℃下分別成熟12、24、48和72 h后，迅速測(cè)定雞胸肉剪切力并分割成約3.0 g的肉塊，于-80 ℃保存，隨后進(jìn)行其他指標(biāo)的測(cè)定。

1.1.2 試劑 DNPH、PIPES、DTNB、乙二胺四乙酸(EDTA)、NaN、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、鹽酸胍、鹽酸、氯化鉀、Triton-X-100 購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；NaCl、CuSO·5HO、NaOH和NaPO均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)有限公司；本試驗(yàn)試劑盒均選用北京索萊寶生物工程所的試劑盒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞肉中硒含量的測(cè)定 雞肉中硒含量的測(cè)定采用GB 5009.93—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》。

1.2.2 活性氧水平的測(cè)定 參照Z(yǔ)hu等的方法。1 g雞肉樣本加入4倍體積預(yù)冷緩沖液(10 mmol·LTris-HCl，10 mmol·L蔗糖，0.1 mmol·LEDTA-2 Na，0.8% g·LNaCl，pH7.4)，勻漿破碎，勻漿液于3 000×、4 ℃離心15 min。上清液與等體積的反應(yīng)緩沖液(10 mmol·LTris-HCl，10 mmol·L蔗糖，0.1 mmol·LEDTA-2 Na，0.8% g·LNaCl，10 μmol·LDCFH-DA，pH 7.4)迅速混合，37 ℃孵育30 min，于激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.2.3 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定采用北京索萊寶生物工程所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 總抗氧化能力的測(cè)定 總抗氧化能力活性的測(cè)定采用北京索萊寶生物工程所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 線粒體提取 參照Li等的方法，取2 g雞胸肉樣，剪碎后置于10倍體積的線粒體分離介質(zhì)中(220 mmol·L甘露醇，70 mmol·L蔗糖和2.0 mmol·LEDTA，5.0 mmol·L4-丙磺酸基嗎啉和0.5%BSA，pH 7.4)勻漿。勻漿液于4 ℃、1 000×離心10 min；取上清液于4 ℃、1 000×離心10 min；隨后在4 ℃，8 000×離心20 min，所得沉淀即為線粒體。

1.2.6 線粒體膜電位的測(cè)定 線粒體膜電位的測(cè)定按照北京索萊寶生物工程所的試劑盒并按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以檢測(cè)到線粒體膜電位的下降。取總蛋白含量為100 μg·mL的純化線粒體加入0.9 mL 5倍稀釋的JC-1染色工作液，孵育20 min，然后測(cè)定熒光值，紅綠熒光強(qiáng)度的比值能夠反映線粒體膜電位水平(檢測(cè)JC-1單體時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm)。

1.2.7 線粒體膜通透性的測(cè)定 參考陳騁所述的方法。將10 g雞肉樣本加入100 mL分離液(250 mmol·L蔗糖，10 mmol·LTris-HCl，1 mmol·LEDTA，pH 7.4)，于10 000×勻漿2 min后于1 500×、4 ℃條件下離心15 min，取上清液于12 000×、4 ℃條件下離心20 min，沉淀用提取液沖洗兩次后與緩沖液(250 mmol·L蔗糖，10 mmol·LTris-HCl，pH 7.4)混合均勻，即得到線粒體懸浮液。采用雙縮脲法測(cè)定線粒體蛋白的濃度。迅速將稀釋好的線粒體溶液300 μL(3 g·L)加入到700 μL 測(cè)試介質(zhì)(230 mmol·L甘露醇，70 mmol·L蔗糖，3 mmol·LHEPES，pH 7.4)中，25 ℃孵育3 min后，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。3 mL測(cè)試介質(zhì)作為對(duì)照，試驗(yàn)過(guò)程保證上樣量一致。

1.2.8 MPTP開(kāi)放程度的測(cè)定 按照“1.2.5”的方法提取線粒體，使用前用MPTP測(cè)試介質(zhì)(230 mmol·L甘露醇、70 mmol·L蔗糖、3.0 mmol·LHepes，pH 7.4)稀釋至0.3 mg·mL蛋白質(zhì)量濃度。取1 mL定量好的線粒體懸浮液與3 mL MPTP測(cè)試介質(zhì)混合加入到石英杯中，檢測(cè)540 nm處的吸光度值。

1.2.9 胞漿Cyt-c還原水平的測(cè)定 參照Borutaite和Brown的方法，制備胞漿懸液，取一定量的懸液，分別在550 nm和535 nm處測(cè)定吸光度，用不同波長(zhǎng)下的吸光值之差與蛋白濃度的比值來(lái)表示胞漿Cyt-c的還原水平。

1.2.10 Caspase-3/9活性的測(cè)定 參考王琳琳等的方法，取160 mg肉樣，剪碎后加入1 mL Caspase-3/9裂解液，冰水浴條件下用玻璃勻漿器勻漿30次。勻漿液于4 ℃離心10 min(10 000×)，取上清液待測(cè)，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取170 μL Caspase-3/9反應(yīng)緩沖液，20 μL待測(cè)上清液(蛋白原液)，10 μL 2 mmol·LCaspase-3/9的反應(yīng)底物DEVD-pNA，依次加入96孔酶標(biāo)板中，對(duì)照孔加入190 μL反應(yīng)緩沖液，于37 ℃恒溫反應(yīng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處吸光度值。

1.2.11 肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)的測(cè)定 參考Culler等方法稍作修改。取2 g已修整雞肉，絞碎，加入20 mL MFI緩沖液(100 mmol·LKCl，8.8 mmol·LKHPO，1 mmol·LEGTA，11.2 mmol·LKHPO，1 mmol·LMgCl，1 mmol·LNaN)，高速勻漿3次，每次20 s(間隔1 min)，1 000×離心15 min。棄去上清液，在沉淀中加入20 mL緩沖液，攪勻，離心1次；取沉淀物加入5 mL緩沖液后攪勻并濾除結(jié)締組織。另用5 mL緩沖液洗滌濾渣。用MFI緩沖液將濾液蛋白配制成(0.5±0.05) mg·mL，在540 nm處測(cè)定光密度值，將測(cè)得數(shù)值乘以200即為肌原纖維小片化指數(shù)。

1.2.12 剪切力的測(cè)定 將樣品順著肌纖維方向切為截面為1 cm×1 cm的3個(gè)肉條，嫩度儀垂直肌纖維方向進(jìn)行剪切，結(jié)果取3次剪切力讀數(shù)的平均值。

1.3 儀器與設(shè)備

C-LM4 嫩度儀購(gòu)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)購(gòu)自江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；雷磁PHS-25 pH計(jì)購(gòu)自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TGL-16MC臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀集團(tuán)；RF-5301PC熒光分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津公司；SP-756P紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自上海美普達(dá)儀器有限公司；AFS-230E原子熒光光度計(jì)購(gòu)自上海儀器有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019 計(jì)算平均值作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用 SPSS 20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及兩因子交互作用分析，運(yùn)用Origin 2018 繪制主成分分析雙標(biāo)圖及柱狀圖，差異顯著性分析采用鄧肯氏新復(fù)極差法(<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 雞胸肉中硒含量

由表1可知，宰后0 h，0.3S和0.6S飼喂組雞胸肉中硒含量均顯著高于對(duì)照組(<0.05)，分別增加了96%和156%?？梢?jiàn)，日糧中添加酵母硒可通過(guò)動(dòng)物自身的代謝和積累有效地在雞肉中富集，同時(shí)存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

表1 飼喂酵母硒日糧對(duì)白羽肉雞胸肉硒含量的影響Table 1 The effect of diet supplemented with yeast selenium on the selenium content of white-feathered broiler breast mg·kg-1

2.2 雞胸肉中活性氧水平

由表2可知，3種飼喂方式下，雞胸肉中ROS水平在成熟過(guò)程中均呈上升趨勢(shì)，其中，在同一成熟時(shí)間點(diǎn)，0.3S和0.6S處理組中雞胸肉ROS水平顯著低于對(duì)照組(<0.05)，且在宰后0 h及24～48 h，0.3 mg·kg飼喂組ROS水平顯著低于0.6 mg·kg飼喂組(<0.05)。說(shuō)明，日糧中添加酵母硒可以顯著降低宰后雞胸肉的ROS水平，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

表2 飼喂酵母硒日糧對(duì)白羽肉雞胸肉活性氧水平的影響Table 2 The effect of diet supplemented with yeast selenium on active oxygen level of white-feathered broiler breast fluorescence value·mg-1 prot

2.3 雞胸肉中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性

由表3可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，各飼喂組雞胸肉GSH-Px活性均呈下降趨勢(shì)，但是，添加酵母硒的飼喂組雞胸肉中GSH-Px活性相較于對(duì)照組均顯著提高，且0.6S組雞胸肉GSH-Px活性顯著高于0.3S組(<0.05)。表明日糧中添加酵母硒可提高宰后雞胸肉的GSH-Px活性，且高劑量的酵母硒效果更加顯著(<0.05)。此外，不同濃度的酵母硒添加量與成熟時(shí)間對(duì)雞肉中GSH-Px的活性存在極顯著交互作用影響(<0.01)。

表3 飼喂酵母硒日糧對(duì)白羽肉雞胸肉谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的影響Table 3 The effect of diet supplemented with yeast selenium on glutathione peroxidase activity of white-feathered broiler breast μmol·g-1

2.4 雞胸肉的總抗氧化能力

由表4可知，3種飼喂方式下，雞胸肉的總抗氧化能力在成熟過(guò)程中均呈下降趨勢(shì)。0.3S組和0.6S組在宰后0～12 h較對(duì)照組雞胸肉總抗氧化能力均顯著提高，且0.6S組顯著高于0.3S組(<0.05)，在成熟后期(48～72 h)，添加酵母硒的處理組較對(duì)照組總抗氧化能力差異不顯著。表明，日糧中添加酵母硒可顯著提高成熟初期雞胸肉的總抗氧化能力(<0.05)，且高劑量的酵母硒效果更加顯著，在其它時(shí)間，添加酵母硒組雞胸肉的總抗氧化能力相較于對(duì)照組有所提高，但差異不顯著(>0.05)。此外，不同酵母硒添加量與成熟時(shí)間對(duì)雞胸肉的總抗氧化能力存在極顯著交互作用影響(<0.01)。

表4 飼喂酵母硒日糧對(duì)白羽肉雞胸肉總抗氧化能力的影響Table 4 Effects of diet supplemented with yeast selenium on the total antioxidant capacity of white-feathered broiler breast U·g-1

2.5 雞胸肉線粒體膜電位

由表5可知，3種飼喂方式下，雞胸肉線粒體膜電位在宰后成熟過(guò)程中均呈下降趨勢(shì)，宰后0～72 h，0.3S和0.6S組線粒體膜電位顯著高于對(duì)照組(<0.05)，且0.6S組顯著高于其他兩組(<0.05)?？梢?jiàn)，日糧中添加酵母硒可顯著提高宰后雞胸肉的線粒體膜電位，且高劑量的酵母硒效果更加顯著。此外，不同酵母硒添加量與成熟時(shí)間對(duì)雞胸肉線粒體膜電位的變化存在極顯著交互作用影響(<0.01)。

表5 飼喂酵母硒日糧對(duì)白羽肉雞胸肉線粒體膜電位的影響(JC-1單體熒光值/聚集態(tài)熒光)Table 5 Effect of diet supplemented with yeast selenium on mitochondrial membrane potential of white-feathered broiler breast (JC-1 monomer fluorescence value/aggregated fluorescence)

2.6 雞胸肉線粒體膜通透性

由表6可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，3種飼喂方式下雞胸肉線粒體膜通透性均呈上升趨勢(shì)(<0.05)。除宰后48 h外，0.3S和0.6S組在雞胸肉線粒體膜通透性顯著低于對(duì)照組(<0.05)，且除12 h外，0.3S組和0.6S組雞胸肉線粒體膜通透性差異不顯著(>0.05)。綜上，日糧中添加酵母硒可顯著降低宰后雞胸肉的線粒體膜通透性(<0.05)。

表6 飼喂酵母硒日糧對(duì)白羽肉雞胸肉線粒體膜通透性的影響(吸光值)Table 6 Effects of diet supplemented with yeast selenium on mitochondrial membrane permeability of white-feathered broiler breast (absorbance value)

2.7 雞胸肉中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放程度

由表7可知，3種飼喂方式下，雞胸肉中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔在宰后成熟過(guò)程中逐漸開(kāi)放(<0.05)，0.3S和0.6S組在宰后0～72 h雞胸肉中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放程度顯著低于對(duì)照組(<0.05)。并且，0.6S組在宰后0～48 h顯著低于0.3S組。表明，酵母硒可通過(guò)減弱線粒體氧化應(yīng)激損傷保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，且高劑量的酵母硒效果更加顯著。

表7 飼喂酵母硒日糧對(duì)白羽肉雞胸肉線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放程度的影響Table 7 The effect of diet supplemented with yeast selenium on the opening degree of mitochondrial permeability transition pore of white-feathered broiler breast 吸光值·mg-1 prot

2.8 雞胸肉Cyt-c還原水平

由表8可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，各飼喂組雞胸肉Cyt-c還原水平均呈下降趨勢(shì)(<0.05)，0.3S和0.6S處理組Cyt-c還原水平顯著高于對(duì)照組(<0.05)，且除宰后24 h，0.6S組顯著高于0.3S組(<0.05)?？梢?jiàn)，與對(duì)照組相比，日糧中添加酵母硒后雞胸肉表現(xiàn)出更高的Cyt-c還原水平，且高劑量的酵母硒效果更加顯著。

表8 飼喂酵母硒日糧對(duì)白羽肉雞雞胸肉Cyt-c還原水平的影響Table 8 The effect of diet supplemented with yeast selenium on the Cyt-c reduction level of white-feathered broiler breast 吸光值·mg-1 prot

2.9 雞胸肉中Caspase-3/Caspase-9活性

由圖1可知，在3種飼喂方式下，Caspase-3和Caspase-9活性隨成熟的進(jìn)行均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在宰后24 h酶活性達(dá)最大值。其中，酵母硒飼喂組Caspase-3和Caspase-9活性均低于對(duì)照組，且0.6 mg·kg添加量時(shí)的活性更低。綜上，日糧中添加酵母硒抑制了雞肉中Caspase-3和Caspase-9的活性，且高劑量的酵母硒效果更加顯著。

不同大寫(xiě)字母表示同一飼喂方式下不同成熟時(shí)間的差異顯著性(P<0.05)；對(duì)照組和添加酵母硒組在同一成熟時(shí)間指標(biāo)變化差異顯著用“*”表示(P<0.05)，差異極顯著用“**”表示(P<0.01)Different capital letters indicate the significance of the difference in different maturation times under the same feeding method (P<0.05); the significant difference in index changes between the control group and the yeast-selenium-added group at the same maturity time is indicated by “*”(P<0.05), The very significant difference is represented by “**”(P<0.01)圖1 酵母硒處理對(duì)宰后雞胸肉成熟過(guò)程中Caspase-3(A)和Caspase-9(B)活力變化的影響Fig.1 The effect of diet supplemented with yeast selenium on the changes of Caspase-3 (A) and Caspase-9 (B) activity during the maturation of chicken breast after slaughter

2.10 雞胸肉肌原纖維小片化指數(shù)

由表9可知，隨著成熟的進(jìn)行，3種飼喂方式下雞胸肉的MFI值逐漸增大，整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。酵母硒飼喂可顯著降低雞胸肉的MFI值，其中，宰后0和24 h，0.6S組雞胸肉的MFI值顯著低于0.3S組(<0.05)，而在宰后其他的時(shí)間點(diǎn)差異不顯著(>0.05)。表明，日糧中添加酵母硒可抑制宰后雞肉中肌原纖維的降解。

2.11 雞胸肉剪切力

由表10可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，3種飼喂方式下雞肉的剪切力均呈下降趨勢(shì)(<0.05)。0.3S組和0.6S組除了宰后24 h外，其余成熟時(shí)間點(diǎn)的剪切力值較對(duì)照組均顯著增加，且0.6S組在宰后0和72 h雞胸肉的剪切力顯著高于0.3S組(<0.05)，這一結(jié)果與MFI測(cè)定結(jié)果一致。說(shuō)明，酵母硒通過(guò)延緩線粒體細(xì)胞凋亡進(jìn)程進(jìn)一步抑制了其對(duì)雞肉嫩度改善的作用。

2.12 基于主成分分析的酵母硒對(duì)宰后肉雞線粒體氧化損傷及細(xì)胞凋亡的影響

基于線粒體氧化損傷及細(xì)胞凋亡酶活性等指標(biāo)進(jìn)行主成分分析結(jié)果如表11所示。PC1和PC2分別解釋了74.69%和16.32%的方差貢獻(xiàn)率，累計(jì)達(dá)91.01%，基本反映了3種飼喂方式下雞肉成熟過(guò)程中12個(gè)相關(guān)指標(biāo)的大部分初始信息。因此，可提取前兩個(gè)主成分因子進(jìn)行討論分析，分析結(jié)果如圖2所示。由表11可得各指標(biāo)成分載荷，絕對(duì)值大者表明主成分與指標(biāo)相關(guān)性較高，正負(fù)號(hào)表明正相關(guān)與負(fù)相關(guān)。PC1主要綜合了ROS、MPTP、線粒體膜電位、線粒體膜通透性、Cyt-c還原水平、T-AOC、Se含量的信息，主要表征宰后雞胸肉的氧化損傷程度，故將PC1定義為氧化因子；PC2主要綜合了Caspase-3和Caspase-9，主要表征雞胸肉中的凋亡酶的活性，故將PC2定義為凋亡因子。PC1與線粒體轉(zhuǎn)孔開(kāi)放程度、線粒體膜電位、線粒體膜通透性、Cyt-c還原水平、剪切力、GSH-Px活性、總抗氧化能力及硒含量呈正相關(guān)。PC2與Caspase-3和Caspase-9這兩個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性較高。

CK表示對(duì)照組，CK后面數(shù)字1～5分別表示宰后0 h，成熟12、24、48、72 h。0.3S表示日糧添加0.3 mg·kg-1酵母硒組，0.6S表示添加0.6 mg·kg-1酵母硒組CK means control group, the digit 1-5 behind CK mean 0 h after slaughter and 12, 24, 48, 72 h postmortem, respectively. 0.3S means diet supplemented with 0.3 mg·kg-1 yeast selenium group， 0.6S means adding 0.6 mg·kg-1 yeast selenium group圖2 主成分分析雙標(biāo)圖Fig.2 Principal component analysis double plot

不同飼喂方式下雞肉成熟過(guò)程中硒含量、各個(gè)氧化和抗氧化指標(biāo)及嫩度變化的主成分分析雙標(biāo)圖如圖2所示，雞肉成熟過(guò)程中，硒含量、GSH-Px活性、總抗氧化能力、MPTP開(kāi)放程度、線粒體膜電位、線粒體膜通透性、剪切力及Cyt-c還原水平的變化明顯；在成熟的12～24 h，Caspase-3和Caspase-9的活性發(fā)生顯著變化；而在成熟48～72 h，ROS水平及MFI的值變化明顯，這與表1～10及圖1的結(jié)果一致。由圖可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組從右上部分，逐漸轉(zhuǎn)移至左下部分，從對(duì)應(yīng)指標(biāo)來(lái)看，雞肉中硒含量變少、線粒體的氧化程度增大及發(fā)生細(xì)胞凋亡，肉的嫩度變好；對(duì)照組，0.3S組，0.6S組從左至右均勻分布。表明，隨著飼糧中酵母硒含量的增加，雞胸肉中硒含量不斷增加，雞肉的抗氧化性能提高，細(xì)胞凋亡酶的活性降低，抑制了雞肉的嫩化。同時(shí)，高劑量的酵母硒減弱線粒體氧化損傷的效果更加顯著，存在劑量效應(yīng)。

3 討 論

日糧中添加微量元素硒可以顯著提高宰后動(dòng)物肌肉中硒的沉積。何珍研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加有機(jī)硒(SeO)可顯著提高黃羽肉雞胸肌中硒的含量，同時(shí)，硒的沉積與添加硒的濃度存在劑量效應(yīng)。此外，Lu等研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加0.3 mg·kg酵母硒使海蘭褐母雞雞胸肉的硒含量相較于對(duì)照組提高了299.44%。上述研究結(jié)果表明，酵母硒飼喂可顯著提高宰后雞肉中硒的含量，這是由于有機(jī)硒中的硒代蛋氨酸可滲入蛋白質(zhì)分子中而在動(dòng)物體內(nèi)很好地沉積。本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.3和0.6 mg·kg酵母硒處理組較對(duì)照組分別提高了96%和156%，可以看出日糧中添加酵母硒可顯著提高雞胸肉中硒的沉積，且存在劑量效應(yīng)。

宰后動(dòng)物自身的氧化與抗氧化失衡，過(guò)多的ROS積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生一系列氧化應(yīng)激損傷。弓劍研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加0.9 mg·kg酵母硒時(shí)，奶牛乳腺的抗氧化功能相較于0.6 mg·kg時(shí)顯著降低，這可能是由于低劑量的硒通過(guò)提高動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化酶活性進(jìn)而有效降低了ROS水平，改善機(jī)體的抗氧化功能，且效果隨硒濃度的增加而提高。當(dāng)硒的濃度過(guò)量時(shí)，可能產(chǎn)生一定的毒性，此時(shí)硒不再是發(fā)揮清除ROS的作用，還有可能產(chǎn)生更多的ROS，消耗機(jī)體的抗氧化酶，從而降低抗氧化能力。本試驗(yàn)中，酵母硒飼喂組雞胸肉中ROS水平顯著低于對(duì)照組，同時(shí)，日糧中添加0.3 mg·kg酵母硒的清除效果優(yōu)于0.6 mg·kg處理組。說(shuō)明日糧中添加酵母硒可通過(guò)抑制細(xì)胞過(guò)氧化反應(yīng)顯著降低雞胸肉中ROS水平，進(jìn)而減弱了線粒體的氧化應(yīng)激。因此，在一定的劑量范圍內(nèi)，提高日糧中硒的添加水平可顯著提高雞肉的抗氧化功能，但劑量過(guò)高可能會(huì)產(chǎn)生不利影響。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，日糧中添加酵母硒組雞胸肉的GSH-Px活性在宰后成熟過(guò)程中均顯著高于對(duì)照組，且存在劑量效應(yīng)，這一結(jié)果與樊懿萱等研究發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸中添加457 mg·kgDM酵母硒(即0.75 mg·kg硒)可顯著提高湖羊肌肉中GSH-Px這一結(jié)果一致。這可能是由于硒是GSH-Px的活性成分，而酵母硒飼喂通過(guò)提高宰后雞肉中硒的富集增強(qiáng)了GSH-Px的活性，GSH-Px作為內(nèi)源性抗氧化酶可參與動(dòng)物的過(guò)氧化防御系統(tǒng)，其廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體，能催化谷胱甘肽(GSH)生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能。此外，酵母硒飼喂可顯著提高宰后初期雞胸肉的總抗氧化能力，但隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)雖有提高但并不顯著。這可能是由于隨著機(jī)體代謝的進(jìn)行，細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，而動(dòng)物自身存在酶與非酶抗氧化防御系統(tǒng)保護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，但是隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，動(dòng)物的抗氧化能力逐漸下降，自由基大量積累，細(xì)胞發(fā)生氧化。酵母硒飼喂可通過(guò)增加宰后雞肉中硒蛋白的含量從而提高機(jī)體過(guò)氧化物酶活性達(dá)到清除細(xì)胞中過(guò)量自由基的效果，間接提高了動(dòng)物宰后初期對(duì)缺氧的耐受程度，降低應(yīng)激損傷。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生受到諸多因素的影響，其中ROS已被證實(shí)為細(xì)胞凋亡重要誘因之一。有研究指出，在應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，促使線粒體內(nèi)外膜間的MPTP構(gòu)象發(fā)生改變，各種促凋亡因子從孔道大量釋放，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，牦牛肉宰后成熟過(guò)程中線粒體膜電位顯著降低，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。而本研究中，在日糧中添加酵母硒對(duì)線粒體膜電位和膜通透性均有所改善，且存在劑量效應(yīng)，提示酵母硒飼喂可通過(guò)降低線粒體氧化損傷從而保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能。近期也有研究發(fā)現(xiàn)低聚殼聚糖硒加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中可通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生，顯著增加豬腸上皮細(xì)胞線粒體膜電位，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化機(jī)制。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加酵母硒可顯著抑制MPTP的開(kāi)放程度，使胞漿中Cyt-c的還原水平顯著增強(qiáng)。張彐寧等研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮可顯著降低促凋亡蛋白Cyt-c、Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)，從而顯著降低大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡水平。這可能是由于酵母硒、毛蕊異黃酮等抗氧化物質(zhì)可顯著抑制促凋亡蛋白Cyt-c的釋放進(jìn)而延緩細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。此外，Chen等研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加亞硒酸鈉可能通過(guò)改善海蘭褐蛋雞的氧化應(yīng)激降低雞肉Caspase-3的活性，這與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酵母硒飼喂可顯著降低宰后雞肉Caspase-3及Caspase-9活性這一結(jié)果一致，說(shuō)明加硒日糧通過(guò)還原Cyt-c，從而抑制了Caspase-9的激活，進(jìn)而降低了下游細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶Caspase-3的活性。

內(nèi)源性細(xì)胞凋亡酶已被證實(shí)可參與宰后肌肉的嫩化。宰后成熟過(guò)程是肌肉向肉轉(zhuǎn)化的過(guò)程，MFI可以作為反映肌細(xì)胞內(nèi)部纖維及肌原纖維骨架蛋白完整程度的指標(biāo)。本研究中，在日糧中添加酵母硒可顯著降低宰后雞胸肉的MFI和增加剪切力，這與王琳琳等在牦牛肉中注射茶多酚研究發(fā)現(xiàn)茶多酚通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑從而阻礙了肌肉的嫩化這一結(jié)果類似。這可能是由于酵母硒飼喂通過(guò)其他方式抑制了細(xì)胞凋亡酶的活力進(jìn)而抑制了雞肉肌原纖維的降解。然而也有研究指出，基礎(chǔ)日糧中添加不同濃度的硒(亞硒酸鈉形式添加)降低了宰后肉仔雞腿肌及胸肌剪切力，與本研究中雞肉嫩度發(fā)生的變化不同，這可能是由于所取雞的類型及基礎(chǔ)日糧的不同造成試驗(yàn)結(jié)果的差異。因此，酵母硒飼喂對(duì)宰后肉雞雞胸肉嫩度的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上，酵母硒飼喂不僅可提高宰后雞肉的抗氧化能力，同時(shí)通過(guò)抑制線粒體途徑細(xì)胞凋亡進(jìn)而延緩了雞肉的成熟。

4 結(jié) 論

肉雞日糧中添加0.3和0.6 mg·kg的酵母硒均可顯著提高GSH-Px活性及減弱線粒體的氧化損傷，進(jìn)而保護(hù)了線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，0.6 mg·kg的酵母硒的效果更加顯著。此外，本研究發(fā)現(xiàn)添加酵母硒延緩了細(xì)胞凋亡，一定程度上抑制了肌原纖維蛋白蛋白的降解，從而延緩了因內(nèi)源酶作用下的雞肉進(jìn)一步嫩化，使雞肉嫩度較好的保持在一個(gè)區(qū)間。