基于離子淌度質(zhì)譜研究低濃度甘油對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

何源峰，朱龍平，苗 慧，陳 寶

(中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

甘油是一種簡(jiǎn)單的多元醇化合物，與水混合后，具有許多生物和工業(yè)應(yīng)用。甘油能在極端條件下穩(wěn)定蛋白質(zhì)，如熱應(yīng)激、冷沖擊、高壓等[1-4]。大多數(shù)蛋白質(zhì)在純化后通常保存在含有甘油的緩沖體系中，以保持其生物活性的穩(wěn)定性[5]。目前，關(guān)于甘油對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，大部分研究主要著眼于高濃度甘油對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響[1,5-6]，而對(duì)低濃度甘油的研究則較少。因此，深入了解低濃度甘油對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，有利于蛋白質(zhì)的相關(guān)研究和應(yīng)用。

電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的常用技術(shù)，具有可靠、省時(shí)的特點(diǎn)[7-8]。當(dāng)ESI-MS與離子淌度(ion mobility spectrometry, IMS)相結(jié)合時(shí)，可以更詳細(xì)地描述蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[9-14]。當(dāng)不同尺寸、電荷和形狀的離子穿過(guò)離子淌度腔室時(shí)，會(huì)根據(jù)碰撞截面積(CCS)的大小在中性介質(zhì)中遷移并分離。通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、電荷態(tài)分布、漂移時(shí)間和CCS值，可以得到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化信息。

本研究以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)為模型蛋白，采用離子淌度質(zhì)譜(IM-MS)技術(shù)考察低濃度甘油對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，并探討其可能的機(jī)制。采用動(dòng)態(tài)光散射法驗(yàn)證液體狀態(tài)下低濃度甘油對(duì)蛋白質(zhì)粒徑的影響，同時(shí)利用碰撞誘導(dǎo)去折疊指紋圖譜研究其對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，以期進(jìn)一步了解甘油穩(wěn)定蛋白質(zhì)的機(jī)制，為蛋白質(zhì)的相關(guān)研究和開(kāi)發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Synapt G2-Si HDMS電噴霧-四極桿-行波離子淌度-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；DynaPro Plate Reader II高通量動(dòng)態(tài)光散射儀：美國(guó)Wyatt公司產(chǎn)品；P-97毛細(xì)管拉制儀：美國(guó)Sutter公司產(chǎn)品；5424R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；MPC-P25 微孔板離心機(jī)：杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；XS105十萬(wàn)分之一天平、Delta 320 pH計(jì)：德國(guó)Mettler公司產(chǎn)品；Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)：德國(guó)Merck Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

馬心肌紅蛋白、BSA、氨水：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；甘油：上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；醋酸銨、甲酸：美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；甲醇：美國(guó)Honeywell公司產(chǎn)品；硼硅酸毛細(xì)管：美國(guó)Sutter公司產(chǎn)品；96孔板：美國(guó)Corning公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1溶液配制 精密稱取適量的BSA，用100 mmol/L醋酸銨溶液(pH 7.4)配制成50 μmol/L母液。取20 μL BSA母液，分別加入不同體積的10%甘油，并用100 mmol/L醋酸銨溶液稀釋至50 μL，得到甘油濃度分別為0%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%和4%的BSA溶液(20 μmol/L)。

精密稱取適量的馬心肌紅蛋白，用甲醇-水-甲酸溶液(49∶49∶2，V/V/V)配制成10 μmol/L的變性馬心肌紅蛋白溶液。

1.3.2行波離子淌度數(shù)據(jù)采集 將質(zhì)譜儀切換為離子淌度采集模式，打開(kāi)氮?dú)?淌度氣體)、氬氣(碰撞、冷卻、凈化離子)和氦氣(緩沖作用)。吸取3 μL BSA蛋白溶液上樣，優(yōu)化離子淌度條件。采用已知CCS的變性馬心肌紅蛋白進(jìn)行CCS校正，計(jì)算BSA離子的CCS。行波離子淌度的基本原理及校正程序已有報(bào)道[15-17]，主要參數(shù)如下：納升電噴霧離子源(nESI)，正離子模式，毛細(xì)管電壓0.8～1.2 kV，錐孔電壓40 V，源偏移80 V，源溫度37 ℃，離子淌度氣體為氮?dú)?，行波速?75 m/s，行波高度8 V。通過(guò)4 V的增量將碰撞能量逐步增加到70 V，以獲得碰撞誘導(dǎo)去折疊數(shù)據(jù)。

1.3.3動(dòng)態(tài)光散射 以100 mmol/L醋酸銨溶液(pH 7.4)為溶劑，配制甘油濃度分別為0%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%和4%的BSA溶液(1 g/L)，4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，緩慢吸取100 μL上清液，加入96孔板中，25 ℃下以2 000 r/min離心3 min；利用高通量動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)量各樣品的流體力學(xué)半徑，測(cè)量溫度25 ℃，散射角150 °。

1.3.4數(shù)據(jù)處理 采用Waters公司的Masslynx V4.1和Driscopt軟件處理離子淌度數(shù)據(jù)，WYATT公司的DYNAMICS 7.8.1.3軟件處理動(dòng)態(tài)光散射數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 ESI-MS分析

質(zhì)譜分析具有基于電荷態(tài)分布的變化跟蹤蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的能力[18]。電荷態(tài)分布結(jié)果顯示，在不含甘油的情況下，BSA的主要電荷態(tài)為+15和+16，表明其四級(jí)結(jié)構(gòu)保存完好，處于緊湊的折疊狀態(tài)[19]；當(dāng)甘油濃度≤0.1%時(shí)，BSA的電荷態(tài)分布與不含甘油的電荷態(tài)分布基本一致，表明結(jié)構(gòu)未發(fā)生顯著變化；當(dāng)甘油濃度為0.5%時(shí)，BSA的電荷態(tài)分布發(fā)生顯著變化，整體向高電荷態(tài)轉(zhuǎn)移；隨著甘油濃度的進(jìn)一步增加(≤4%)，BSA的電荷態(tài)不斷向高電荷態(tài)轉(zhuǎn)移，低電荷態(tài)的峰基本消失，表明氣相中BSA結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，示于圖1。

圖1 不同濃度甘油條件下BSA的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of BSA with different concentrations of glycerol

(1)

2.2 離子淌度分析

(2)

圖2 甘油濃度對(duì)BSA平均電荷的影響Fig.2 Effect of glycerol concentrations on average charge of BSA

圖3 甘油濃度對(duì)BSA的CCS值的影響Fig.3 Effect of glycerol concentrations on CCS of BSA

進(jìn)一步考察不同電荷態(tài)BSA離子的折疊情況，結(jié)果示于圖4。攜帶不同電荷的BSA離子具有不同的漂移時(shí)間，其CCS值隨著電荷數(shù)的增加而增大，表明BSA離子所帶電荷數(shù)越多，其去折疊程度越大。

圖4 2%甘油存在下不同電荷 BSA離子的碰撞截面積Fig.4 CCS of BSA ions with different charges in 2% glycerol

同一蛋白質(zhì)較高電荷態(tài)的離子比較低電荷態(tài)的離子具有更大的CCS值，其原因可能是高電荷態(tài)導(dǎo)致庫(kù)侖排斥力增加，進(jìn)而使離子在氣相中展開(kāi)，也可能是從溶液中轉(zhuǎn)移了不太緊湊的蛋白質(zhì)進(jìn)入質(zhì)譜[20]。為了研究低濃度甘油導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)分析了單電荷態(tài)蛋白質(zhì)離子的CCS值與甘油濃度之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，在一定的甘油濃度范圍(0.1%～4%)內(nèi)，+16、+17和+18電荷態(tài)BSA離子的CCS值均隨著甘油濃度的增大而增大，示于圖5a；類似地，單個(gè)電荷態(tài)BSA離子的到達(dá)時(shí)間也隨著甘油濃度增大而增加，示于圖5b～5d。以上結(jié)果表明，甘油引起的電荷增加導(dǎo)致庫(kù)侖排斥作用的增強(qiáng)不是導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散的唯一因素，甘油引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散也可能發(fā)生在溶液中。

2.3 動(dòng)態(tài)光散射

為了證明甘油引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散是否發(fā)生在溶液中，本實(shí)驗(yàn)利用動(dòng)態(tài)光散射法(dynamic light scattering)測(cè)量不同甘油濃度下BSA的水化半徑大小，從而監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，當(dāng)甘油濃度≤1%時(shí)，BSA粒徑未發(fā)現(xiàn)顯著變化；當(dāng)1%<甘油濃度≤4%時(shí)，BSA粒徑隨著甘油濃度的增大而增大，示于圖6。結(jié)果表明，甘油引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散發(fā)生在溶液中。

2.4 碰撞誘導(dǎo)去折疊

較高濃度的甘油(10%～40%)可提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性[1,6,21]，而低濃度甘油在引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散的情況下是否可以提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性有待進(jìn)一步分析。本研究考察了在添加/不添加甘油情況下進(jìn)入離子淌度腔室前對(duì)BSA離子進(jìn)行碰撞激活，得到相應(yīng)的碰撞誘導(dǎo)去折疊指紋圖譜，示于圖7。在相對(duì)較低的碰撞能量下，無(wú)論是否添加甘油，BSA離子的漂移時(shí)間基本一致(約13.6 ms)，表明BSA處于緊湊構(gòu)象。隨著碰撞能量的增加，未添加甘油的BSA在40～44 V之間發(fā)生了一個(gè)去折疊事件，產(chǎn)生漂移時(shí)間約15.5 ms的松散構(gòu)象，48 V時(shí)緊湊構(gòu)象完全消失，示于圖7a；而在含0.5%甘油的情況下，BSA去折疊開(kāi)始發(fā)生在更高的電壓，并且去折疊過(guò)渡發(fā)生在更寬的電壓范圍內(nèi)，44～58 V之間仍以緊湊構(gòu)象為優(yōu)勢(shì)構(gòu)象，62～70 V之間則以松散構(gòu)象為優(yōu)勢(shì)構(gòu)象，在70 V時(shí)仍可檢測(cè)到緊湊構(gòu)象(約30%)，示于圖7b。以上結(jié)果表明，低濃度甘油仍可提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，抑制蛋白質(zhì)去折疊。這可能是由于甘油會(huì)與蛋白質(zhì)發(fā)生極強(qiáng)的非共價(jià)相互作用[22]，從而抑制蛋白質(zhì)去折疊。

圖5 BSA的16+、17+、18+電荷狀態(tài)的CCS值(a)和到達(dá)時(shí)間(b～d)與甘油濃度的關(guān)系Fig.5 Relationship between CCS value (a) and arrival time (b-d) of the 16+, 17+ and 18+ charge states of BSA with glycerol concentrations

圖6 甘油濃度對(duì)BSA水化半徑的影響Fig.6 Effect of glycerol concentration on hydration radius of BSA

3 結(jié)論

本研究采用離子淌度質(zhì)譜法和動(dòng)態(tài)光散射法考察了在近似生理?xiàng)l件下低濃度甘油(0.05%～4%)對(duì)BSA結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響，并探討可能的機(jī)制。結(jié)果表明，低濃度甘油可引起氣相中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的松散，這是電荷增加導(dǎo)致庫(kù)侖排斥力增強(qiáng)和溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散共同作用的結(jié)果。碰撞誘導(dǎo)去折疊指紋圖譜表明，低濃度甘油可提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，這可能是甘油與蛋白質(zhì)發(fā)生極強(qiáng)的非共價(jià)相互作用的結(jié)果。

注：a.不含甘油；b.含0.5%甘油圖7 電荷狀態(tài)為16+的BSA碰撞誘導(dǎo)去折疊指紋圖譜Fig.7 Collision-induced unfolding fingerprint spectra of 16+ charge state of BSA