應(yīng)用非變性質(zhì)譜-行波式離子淌度譜表征完整糖蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性及小規(guī)模結(jié)構(gòu)差異

徐 香，柴胡玲瀟，王冠博

(1.南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023； 2.深圳灣實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞分析研究所，廣東 深圳 518132；3.北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心，北京 100871)

蛋白的糖基化是最為常見和多樣化的翻譯后修飾，影響著蛋白質(zhì)的構(gòu)象、穩(wěn)定性和溶解度，同時(shí)在分子識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)和免疫防御等方面具有關(guān)鍵作用[1-2]。研究糖蛋白生物功能有賴于對(duì)糖蛋白進(jìn)行多層次結(jié)構(gòu)分析和動(dòng)態(tài)性分析。其中，獲取關(guān)于糖蛋白修飾程度、蛋白型(proteoform)分布、糖蛋白相互作用、結(jié)合計(jì)量關(guān)系、構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化等方面的信息，則有賴于在完整糖蛋白或完整復(fù)合物層面的結(jié)構(gòu)表征。作為與X射線晶體衍射、冷凍電鏡、核磁共振等經(jīng)典生物物理學(xué)手段高度互補(bǔ)的技術(shù)，生物質(zhì)譜能夠在分析物尺寸、純度或復(fù)雜度、空間分辨能力(部分情況下)、即時(shí)性等方面突破局限，已成為生物大分子結(jié)構(gòu)表征的有力工具[3]。在結(jié)構(gòu)質(zhì)譜策略中，非變性質(zhì)譜能夠在分析過程中最大限度地保持生物大分子體系中關(guān)鍵的非共價(jià)作用[4]，從而維系完整的復(fù)合物體系和初始構(gòu)象，在蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)分析中發(fā)揮獨(dú)特作用[5]。為豐富可獲取的結(jié)構(gòu)表征信息，科研人員將非變性質(zhì)譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用以增加結(jié)構(gòu)表征的深度，并與離子淌度譜聯(lián)用以增加結(jié)構(gòu)表征的維度[6]。離子淌度不僅可基于不同離子的氣相淌度差異實(shí)現(xiàn)離子分離、降低質(zhì)譜圖復(fù)雜度，還可在行波式(travelling-wave)離子淌度等特定類型的淌度方案中實(shí)現(xiàn)碰撞截面積(CCS)的測定，提供分析物幾何形貌層面的結(jié)構(gòu)信息[7]。行波式離子淌度模塊可置于質(zhì)譜儀器內(nèi)部的不同質(zhì)量分析器之間，利用行波原理取代傳統(tǒng)的漂移管原理，能夠大幅減少離子損失，提高靈敏度[8]。這一特性對(duì)于分析生物大分子具有獨(dú)特優(yōu)勢，離子淌度譜與非變性質(zhì)譜的結(jié)合已在蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)復(fù)合物分析中發(fā)揮了重要作用，在分析蛋白質(zhì)構(gòu)象變化、去折疊/重折疊、蛋白凝集、蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝和結(jié)構(gòu)演變等方面提供關(guān)鍵信息[9]。

除以上提及的大規(guī)模結(jié)構(gòu)變化外，小規(guī)模結(jié)構(gòu)變化或差異的表征對(duì)于糖蛋白結(jié)構(gòu)分析也具有重要意義。糖蛋白分子中含有分子質(zhì)量及個(gè)數(shù)各不相同的單糖殘基，形成宏觀異質(zhì)性(糖基化位點(diǎn)的占據(jù)程度差異)和微觀異質(zhì)性(各糖基化位點(diǎn)的糖鏈結(jié)構(gòu)差異)，由此產(chǎn)生的各蛋白型呈現(xiàn)一定的分子質(zhì)量分布[10]。糖蛋白的蛋白型異質(zhì)性解析和針對(duì)特定蛋白型亞群分布的分析對(duì)于糖基化與構(gòu)象關(guān)聯(lián)性等結(jié)構(gòu)研究[11]、糖基化與親和力關(guān)聯(lián)性等功能研究[12]、以及蛋白質(zhì)藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性分析[13]等具有重要意義。離子淌度譜已被用于在游離糖鏈或糖肽層面進(jìn)行異質(zhì)性或異構(gòu)體解析[14-19]，并在完整蛋白層面體現(xiàn)了部分蛋白型的淌度差異[20-21]，但對(duì)于是否能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白型的有效分離尚有待深入驗(yàn)證。在蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)分析方面，離子淌度可揭示配體結(jié)合所引起的構(gòu)象變化[22]，然而糖蛋白自身的異質(zhì)性增大了糖蛋白自身復(fù)合物的異質(zhì)性，進(jìn)而增大了復(fù)合物與其他分子所形成的高階復(fù)合物的復(fù)雜程度，離子淌度對(duì)此類高階復(fù)合物的分辨能力有待證明。此外，蛋白質(zhì)復(fù)合物的質(zhì)譜分析常使用減電荷試劑降低蛋白離子價(jià)態(tài)以降低譜圖的復(fù)雜性或強(qiáng)化生物大分子復(fù)合物的穩(wěn)定性[23]，也常使用增電荷試劑提高蛋白離子價(jià)態(tài)以改善串聯(lián)質(zhì)譜性能[24]。明確這些電荷調(diào)控操作是否會(huì)造成蛋白質(zhì)分析物結(jié)構(gòu)的人為改變以及改變程度對(duì)于方法準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)至關(guān)重要，尤其在已有證據(jù)表明部分增電荷試劑可導(dǎo)致一定程度構(gòu)象變化的情況下則更具迫切性[25-26]。離子淌度已被用于監(jiān)測增、減電荷試劑對(duì)蛋白構(gòu)象的影響[27-30]，但不同蛋白型在電荷調(diào)控條件下的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性是否存在差異尚有待深入研究。

針對(duì)上述問題，本研究以親和素復(fù)合物及親和素-生物素復(fù)合物作為模式蛋白體系，利用與行波式離子淌度相結(jié)合的非變性質(zhì)譜及串聯(lián)質(zhì)譜探究離子淌度對(duì)于復(fù)合物層面及亞基層面的蛋白型亞群分辨與分離、亞基解離過程伴隨的構(gòu)象變化、復(fù)合物結(jié)合小分子形成高階復(fù)合物的形態(tài)變化、電荷調(diào)控條件下的結(jié)構(gòu)響應(yīng)等方面所能提供的結(jié)構(gòu)信息收益；并通過對(duì)由不同物種表達(dá)的親和素在上述方面的CCS差異，探索離子淌度應(yīng)用于蛋白復(fù)合物穩(wěn)定性評(píng)價(jià)的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Synapt XS三重四極桿-離子淌度-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：英國Waters公司產(chǎn)品，配有靜態(tài)納升電噴霧離子源(nanoESI)；5424R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；DS-11+光譜儀：美國Denovix公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

重組親和素(avidin 1，由玉米細(xì)胞表達(dá)，經(jīng)親和純化提取，≥12 units/mg，純度≥80%，質(zhì)量水平200)、天然親和素(avidin 2，由雞蛋蛋白經(jīng)親和純化提取，≥10 units/mg，純度≥98%，質(zhì)量水平200)；牛血清白蛋白(BSA)、牛紅細(xì)胞細(xì)胞泛素(ubiqutin)、馬心肌肌紅蛋白(myoglobin)、馬心肌細(xì)胞色素c蛋白(cytochrome c)、生物素(biotin，色譜級(jí))、乙酸三甲基銨(triethylammonium acetate, TEAA，色譜級(jí))、間硝基芐醇(m-nitrobenzyl alcohol,m-NBA，質(zhì)譜級(jí))：均為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；醋酸銨(NH4Ac，色譜級(jí))：阿拉丁(中國)公司產(chǎn)品；乙酸(色譜級(jí))：麥克林(中國)公司產(chǎn)品；甲醇(色譜級(jí))：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；離心超濾套裝(分子質(zhì)量截留10 ku)：美國Merck Millipore公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1樣品制備 將蛋白粉末用150 mmol/L醋酸銨溶液溶解，使用10 ku截留的超濾管，以11 000 r/min離心過濾，將親和素等蛋白質(zhì)樣品的原緩沖液置換為150 mmol/L醋酸銨溶液，制得濃溶液。對(duì)于非變性條件的蛋白樣品，以150 mmol/L醋酸銨溶液將蛋白濃溶液稀釋至7 μmol/L(親和素)或10 μmol/L(其他校正蛋白)；對(duì)于變性條件的蛋白樣品(僅用于校正)，以甲醇-水-乙酸溶液(49∶49∶2，V/V/V)將校正蛋白濃溶液稀釋至10 μmol/L。向親和素溶液中加入過量生物素以制備親和素-生物素復(fù)合物。

1.3.2質(zhì)譜條件 使用靜態(tài)納升電噴霧離子源進(jìn)樣，離子源溫度120 ℃，補(bǔ)償30，源離子引導(dǎo)波速10 m/s，波形高1 V，四極桿分辨4.7。在高純氮?dú)?純度>99.99%)下進(jìn)行離子淌度測定，波速4.6 m/s，波形高43.3 V；傳輸波速17.1 m/s，波形高4 V。在親和素單體測定中，采用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)將親和素單體從四聚體形式解離出來。為獲得更寬的單體價(jià)態(tài)分布，且減弱四聚體母離子的特定價(jià)態(tài)對(duì)單體價(jià)態(tài)及去折疊程度的影響，四聚體的全部價(jià)態(tài)均用作生成單體的母離子。

1.4 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜及離子淌度數(shù)據(jù)使用MassLynx v4.2(Waters，英國)、DriftScope v2.9(Waters，英國)及Origin Pro(OriginLab，美國)軟件處理。離子淌度測定中的遷移時(shí)間校正及CCS校正依據(jù)文獻(xiàn)[31-32]進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 同種糖蛋白復(fù)合物不同蛋白型的分辨與分離

盡管來自雞蛋白的avidin 2及由玉米細(xì)胞表達(dá)的重組avidin 1蛋白的氨基酸序列完全一致，但由于糖基化等修飾程度不同而呈現(xiàn)明顯的分子質(zhì)量分布差異。非變性條件下，avidin以四聚體形式存在，肽鏈的理論分子質(zhì)量為57.2 ku。Avidin 1及avidin 2四聚體最高豐度蛋白型的實(shí)測分子質(zhì)量分別為62.3、63.7 ku，示于圖1a。與avidin 1相比，avidin 2四聚體的分子質(zhì)量分布更寬，且呈現(xiàn)可部分分辨的多重亞群分布。其中，將豐度次高及最高的亞群分布分別記為分布Ⅰ和分布Ⅱ，各自對(duì)應(yīng)的最高豐度蛋白型的實(shí)測分子質(zhì)量分別為62.3、63.7 ku。Avidin 1及avidin 2的各價(jià)態(tài)四聚體離子均呈現(xiàn)穩(wěn)定的遷移時(shí)間差異(示于圖1b，取覆蓋最高豐度蛋白型、半峰寬m/z150的分布亞群)，糖基化程度較高、分子質(zhì)量較大的avidin 2遷移時(shí)間稍長。分別提取avidin 2分布Ⅰ和Ⅱ中亞群離子的遷移時(shí)間譜(取覆蓋最高豐度蛋白型、半峰寬m/z50的分布亞群)，二者在各價(jià)態(tài)上均呈現(xiàn)穩(wěn)定的差異，糖基化程度較高、分子質(zhì)量較大的亞群離子遷移時(shí)間更長，示于圖1c。盡管avidin 2分布Ⅰ的分子質(zhì)量略高于avidin 1，但前者的遷移時(shí)間短于后者。針對(duì)上述糖蛋白復(fù)合物的CCS計(jì)算結(jié)果，avidin 1的CCS介于avidin 2的分布Ⅰ和Ⅱ之間，示于圖1d。結(jié)果表明，利用行波式離子淌度模塊可以在遷移時(shí)間維度上有效地分離糖基化程度不同的蛋白型亞群。由于上述復(fù)合物的分子質(zhì)量差異源自糖基化成分，而對(duì)于具有分支結(jié)構(gòu)的糖鏈，其空間伸展程度并不單純地與分子質(zhì)量相關(guān)(不對(duì)稱性較高的糖型結(jié)構(gòu)，如Man5GlcNAc2比分子質(zhì)量相近的對(duì)稱糖型空間伸展程度更高；具有多重分支結(jié)構(gòu)的糖型，如Man5GlcNAc5比分子質(zhì)量相近的具有雙分支主體結(jié)構(gòu)的其他常見糖型伸展程度更低；這些糖型均存在于avidin中[33])，這表明由玉米細(xì)胞表達(dá)的avidin 1糖鏈結(jié)構(gòu)整體伸展程度高于avidin 2。

隨后，本工作研究了基于離子淌度分離維度上針對(duì)糖基化程度不同的蛋白型亞群進(jìn)行分離的可行性。在0.2 ms遷移時(shí)間窗口、不同遷移時(shí)間內(nèi)，經(jīng)質(zhì)譜檢測的單一價(jià)態(tài)離子呈現(xiàn)顯著收窄的分子質(zhì)量分布，有效地分離了部分主要蛋白型，示于圖1e，這種分離模式與色譜-質(zhì)譜聯(lián)用相似。在完整蛋白層面，同種糖蛋白不同蛋白型之間多肽鏈主干及宏觀構(gòu)象相同，糖基化差異體現(xiàn)的化學(xué)或物理性質(zhì)差異難以體現(xiàn)蛋白整體的理化性質(zhì)差異，因此，難以利用常規(guī)的液相色譜等方式進(jìn)行分離。在質(zhì)譜測定中，較大尺寸的糖蛋白及其復(fù)合物隨著糖基化位點(diǎn)和糖型組合的增多，各蛋白型的分子質(zhì)量差異不足以超過蛋白型亞群分子質(zhì)量的分布寬度，因此質(zhì)譜信號(hào)高度重疊，難以實(shí)現(xiàn)有效地蛋白型分離。在行波式離子淌度與質(zhì)譜聯(lián)用條件下，多個(gè)蛋白型亞群的氣相分離得以實(shí)現(xiàn)，能夠可控地提取特定分布的蛋白型亞群，為大型糖蛋白及糖蛋白復(fù)合物的異質(zhì)性解析和精細(xì)結(jié)構(gòu)分析提供了有效的方案。

2.2 糖蛋白復(fù)合物解離所得亞基的結(jié)構(gòu)差異

Avidin四聚體經(jīng)CID作用可解離為亞基單體。由于單體所含糖基化位點(diǎn)減少、各糖型組合的可能性減少，各蛋白型信號(hào)在飛行時(shí)間質(zhì)譜中得以充分分辨，示于圖2a。與avidin 1相比，avidin 2單體的蛋白型分布更復(fù)雜，分子質(zhì)量分布更寬，且高豐度蛋白型分子質(zhì)量數(shù)值更大，與對(duì)avidin四聚體的分子質(zhì)量分布表征結(jié)果一致。值得注意的是，在avidin 2的單體信號(hào)中出現(xiàn)了顯著的不同價(jià)態(tài)信號(hào)交錯(cuò)現(xiàn)象，看似同一價(jià)態(tài)的信號(hào)簇內(nèi)實(shí)際上包含不同價(jià)態(tài)的蛋白型信號(hào)，因此需對(duì)單體信號(hào)進(jìn)行細(xì)致地價(jià)態(tài)和分子質(zhì)量分析，以免引起CCS值的錯(cuò)誤計(jì)算。分子質(zhì)量不同的各蛋白型在離子淌度測定中呈現(xiàn)程度不等的遷移時(shí)間差異，導(dǎo)致差異程度不等的CCS計(jì)算值。本工作在avidin 1中選取分子質(zhì)量分別為15.38、15.51、15.68 ku的3種主要蛋白型(記為A、B、C)作為示例，示于圖2b。3種蛋白型在+8～+10的3個(gè)主要價(jià)態(tài)下的CCS排序與分子質(zhì)量排序一致，均僅呈現(xiàn)微小的CCS差別(小于0.1 nm2)。而avidin 2中分子質(zhì)量分別為14.29、14.55、15.57 ku的3個(gè)蛋白型(記為D、E、F)之間則體現(xiàn)了較大的CCS差異，示于圖2c。蛋白型D與E的分子質(zhì)量相差0.3 ku，但二者之間的CCS差異可超過0.4 nm2，遠(yuǎn)超過同樣具有0.3 ku分子質(zhì)量差異的avidin 1蛋白型A與C之間的CCS差異。

注：紅色表示avidin 1，藍(lán)色表示avidin 2；箭頭所示為用于離子淌度分析的蛋白型A-B的+9價(jià)離子對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜信號(hào)圖2 由四聚體解離獲得的avidin 1和avidin 2單體蛋白的質(zhì)譜圖， avidin 1單體蛋白型A～C(b)和avidin 2單體蛋白型D～F(c)的CCS值Fig.2 Mass spectra of monomeric avidin 1 and avidin 2 released from the corresponding tetramers (a), cabculated CCS values of proteofroms A-C of avidin 1 (b) and proteofroms D-F of avidin 2 (c)

在avidin四聚體的離子淌度測定中，avidin 2的蛋白型整體CCS高于avidin 1，示于圖1d；但在對(duì)解離單體的離子淌度測定中，avidin 2單體的CCS普遍低于avidin 1，甚至分子質(zhì)量較高的avidin 2蛋白型F的CCS也并未高于分子質(zhì)量較低的avidin 1蛋白型C，示于圖2c。由于此處測定的avidin單體均由四聚體經(jīng)CID碎裂產(chǎn)生，單體的空間伸展程度既與自身結(jié)構(gòu)相關(guān)，也受碰撞過程中能量傳遞的影響。在對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物的非變性質(zhì)譜及基于CID的串聯(lián)質(zhì)譜測定中，蛋白亞基解離往往伴隨非對(duì)稱電荷分配現(xiàn)象，即被解離的亞基所攜帶的電荷占母離子整體電荷的比例遠(yuǎn)高于其質(zhì)量占比[34]，其自身也發(fā)生高度的去折疊[35]，二者之間可互為因果[5]。Avidin 1及avidin 2解離單體的CCS值均遠(yuǎn)大于四聚體實(shí)測CCS值的1/4(已接近60%)，體現(xiàn)了離去亞基的去折疊程度。離去亞基發(fā)生去折疊所需的能量來源于碰撞過程，去折疊程度與能量相關(guān)[5]。由于各樣品中不同蛋白型離子均在相同的碰撞條件下生成，可獲取的額外能量均等，但克服分子間相互作用脫離原復(fù)合物所需的能量可能因蛋白型的修飾程度不同而異。分子質(zhì)量相近的不同蛋白型，如因糖鏈組成和結(jié)構(gòu)差異引起的親和力差異[36]，可能導(dǎo)致在具有相同碰撞能量輸入的情況下，克服解離所需能壘后剩余的額外能量不同，從而使解離產(chǎn)物中呈現(xiàn)不同的去折疊程度，導(dǎo)致CCS值的差異。而avidin 2解離單體CCS值普遍低于avidin 1的現(xiàn)象表明，天然的avidin 2復(fù)合物內(nèi)亞基間親和力高于人工重組的avidin 1。

2.3 高階糖蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)

與過量biotin(分子質(zhì)量244.3 u)混合后，每1分子avidin四聚體與4分子biotin結(jié)合形成高階復(fù)合物，分子質(zhì)量增大977 u。由于biotin與avidin的親和力極高(Kd≈10-15mol/L)[37]、結(jié)合計(jì)量比高度確定，因此biotin的結(jié)合不改變avidin蛋白型的原有分布，示于圖3a。Biotin的結(jié)合使avidin四聚體的CCS值略有增大，但對(duì)于avidin 1和avidin 2四聚體，biotin結(jié)合前后引起的CCS變化均不大于分子質(zhì)量差異更小的avidin不同蛋白型分布之間的CCS差異，示于圖3b。在水溶液中，biotin取代若干處于與avidin結(jié)合態(tài)的溶劑分子而與avidin結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)處于復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)內(nèi)的空腔區(qū)域，并不引起水合半徑的顯著變化[38]。離子淌度測定結(jié)果表明，在非變性質(zhì)譜分析中，avidin-biotin復(fù)合物進(jìn)入氣相后，原處于空腔區(qū)域的biotin并未顯著暴露于外部，CCS值并未顯著增加，符合非變性質(zhì)譜條件不顯著改變蛋白復(fù)合物原有架構(gòu)的預(yù)期。結(jié)合biotin后，糖基化程度不同的avidin復(fù)合物蛋白型之間仍呈現(xiàn)原有程度的CCS差異。

注：紅色表示avidin 1與biotin的復(fù)合物；藍(lán)色表示avidin 2與biotin的復(fù)合物；灰色表示未與biotin結(jié)合的adivin圖3 Avidin 1、avidin 2四聚體與biotin復(fù)合物及未結(jié)合biotin四聚體的質(zhì)譜圖(a)， avidin四聚體與biotin結(jié)合前后的CCS值比較(b)Fig.3 Mass spectra of tetrameric avidin 1 and avidin 2 in complex with biotin and unbound tetramers (a), comparison of calculated CCS values of avidin tetramers before and after binding with biotin (b)

2.4 電荷調(diào)控條件下糖蛋白復(fù)合物及亞基構(gòu)象變化

使用TEAA對(duì)avidin進(jìn)行減電荷處理后，四聚體的主要價(jià)態(tài)由常規(guī)條件下的+15～+17減小到+11、+12，示于圖4a。相應(yīng)地，使用mNBA對(duì)avidin進(jìn)行增電荷處理后，四聚體主要價(jià)態(tài)顯著升高，其中avidin 1的升高程度顯著高于avidin 2。此外，在增電荷測定中，未施加任何源內(nèi)碎裂條件下，avidin 2仍保持穩(wěn)定的四聚體復(fù)合狀態(tài)，而avidin 1發(fā)生了顯著解離，在質(zhì)譜圖中呈現(xiàn)游離的二聚體及單體信號(hào)。這些解離產(chǎn)物的電荷密度較高，體現(xiàn)了不對(duì)稱電荷分配，因此可判定為氣相解離產(chǎn)物而非溶液相解離產(chǎn)物[5]。這表明，經(jīng)mNBA處理后的avidin 1四聚體穩(wěn)定性顯著減弱，在未施加源內(nèi)碎裂的常規(guī)溫和條件下易發(fā)生氣相解離。而同樣經(jīng)mNBA處理后的avidin 2四聚體仍保持完整，驗(yàn)證了2.2節(jié)中關(guān)于天然avidin 2復(fù)合物內(nèi)亞基間親和力高于人工重組avidin 1的推論。對(duì)比常規(guī)條件及電荷調(diào)控條件下avidin四聚體的CCS測定值，增、減電荷處理均使不同價(jià)態(tài)間四聚體離子的CCS差異增大，示于圖4b。在人工調(diào)控電荷的條件下，復(fù)合物整體價(jià)態(tài)升高意味著表面電荷密度增大，電荷間斥力可導(dǎo)致氣相蛋白離子能量升高、穩(wěn)定性降低、松散程度增大；反之亦然。離子淌度測定結(jié)果與此相符。經(jīng)mNBA增電荷獲得的avidin 1和avidin 2四聚體離子CCS較常規(guī)條件獲得的離子CCS增加幅度可分別達(dá)到19%和4%，后者與同樣使用mNBA增電荷處理的630 ku復(fù)合物CCS增加幅度相當(dāng)[26]，凸顯了avidin 1在增電荷試劑作用下的顯著失穩(wěn)效應(yīng)。經(jīng)TEAA減電荷獲得的avidin 1和avidin 2四聚體離子CCS較常規(guī)條件獲得的離子CCS分別減小8%和7%，幅度高于以咪唑作為減電荷試劑對(duì)分子質(zhì)量超過800 ku的大型復(fù)合物產(chǎn)生的CCS減小效果(約5%)[28]。此外，增電荷條件下，avidin 1四聚體CCS隨價(jià)態(tài)升高的上升幅度顯著大于avidin 2，進(jìn)一步佐證了avidin 2復(fù)合物的穩(wěn)定性強(qiáng)于avidin 1。離子淌度數(shù)據(jù)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)的一致性表明，在評(píng)價(jià)環(huán)境條件對(duì)蛋白復(fù)合物穩(wěn)定性影響時(shí)，CCS變化幅度可作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。在條件變化不足以破壞復(fù)合物完整性時(shí)，單純的質(zhì)譜數(shù)據(jù)難以提供評(píng)價(jià)依據(jù)，此時(shí)離子淌度測定可發(fā)揮重要作用。

圖4 Avidin 1、avidin 2在減電荷、常規(guī)及增電荷條件的質(zhì)譜圖(a)；avidin四聚體在常規(guī) 及電荷調(diào)控條件的CCS值對(duì)比(b)；avidin 1、avidin 2在增電荷、常規(guī)及減電荷條件下 通過CID所得單體的質(zhì)譜圖(c)；avidin單體在常規(guī)及電荷調(diào)控條件下的CCS值對(duì)比(d)Fig.4 Mass spectra of avidin 1 and avidin 2 acquired under charge-reduction, normal and supercharging conditions (a); comparison of calculated CCS values of avidin tetramers under normal and charge manipulation conditions (b); mass spectra of monomeric avidin 1 and avidin 2 released through CID under supercharging, normal and charge-reduction conditions (c); comparison of calculated CCS values of avidin monomers under normal and charge manipulation conditions (d)

在電荷調(diào)控條件下，由于復(fù)合物整體穩(wěn)定性和復(fù)合物可提供的電荷總量發(fā)生變化，由復(fù)合物解離所得的單體價(jià)態(tài)分布隨之發(fā)生相應(yīng)變化。Avidin四聚體增電荷處理后，經(jīng)CID解離所得單體的最高豐度價(jià)態(tài)提升1～2個(gè)單位，而減電荷處理后單體價(jià)態(tài)可降低3個(gè)單位，示于圖4c。本工作選取avidin 1的最高豐度蛋白型B和avidin 2的最高豐度蛋白型F進(jìn)行CCS分析，示于圖4d。在減電荷條件下，avidin 1和avidin 2的單體CCS值差異程度與常規(guī)條件相當(dāng)，表明減電荷操作未引起二者去折疊程度的顯著差異。在增電荷條件下，avidin 2經(jīng)CID所得單體CCS值并未顯著增加，表明增電荷條件并未顯著提升單體的去折疊程度，進(jìn)一步驗(yàn)證了avidin 2復(fù)合物的穩(wěn)定性未受顯著影響。增電荷avidin 1在一級(jí)質(zhì)譜條件下所得單體的CCS值(圖4d星狀數(shù)據(jù)點(diǎn))顯著低于上述高價(jià)態(tài)avidin單體的CCS值。這表明，盡管在弱碰撞條件下獲得的單體價(jià)態(tài)分布與CID條件所得的單體難以區(qū)分，但可在CCS值上呈現(xiàn)顯著差異。非變性質(zhì)譜條件下的價(jià)態(tài)分布常用作蛋白構(gòu)象的變化依據(jù)[39]，基于離子淌度分析獲得的CCS值可以更靈敏地反映構(gòu)象變化。

3 結(jié)論

本工作以由不同物種表達(dá)avidin作為模式糖蛋白復(fù)合物體系，針對(duì)常見的糖蛋白復(fù)合物表征需求，在蛋白型分辨與分離、糖蛋白復(fù)合物亞基解離、高階復(fù)合物結(jié)構(gòu)、電荷調(diào)控條件下的構(gòu)象變化等方面，考察了行波式離子淌度分析在非變性質(zhì)譜分析中可為糖蛋白復(fù)合物穩(wěn)定性和小規(guī)模結(jié)構(gòu)變化表征發(fā)揮的作用。離子淌度具備在完整糖蛋白或復(fù)合物水平上對(duì)部分蛋白型亞群分布進(jìn)行氣相分離的能力，能夠可控地提取特定分布的蛋白型亞群，有利于完整糖蛋白及復(fù)合物的異質(zhì)性解析；能夠反映非變性質(zhì)譜條件下高階復(fù)合物的架構(gòu)維系；能夠以較高的分辨能力靈敏地反映蛋白質(zhì)在氣相解離、電荷調(diào)控以及經(jīng)電荷調(diào)控的氣相解離條件下的構(gòu)象變化程度，從而應(yīng)用于蛋白復(fù)合物體系的穩(wěn)定性分析。不同物種表達(dá)的avidin復(fù)合物體現(xiàn)了顯著的穩(wěn)定性差異，以及自身結(jié)構(gòu)對(duì)電荷調(diào)控的響應(yīng)差異。這些結(jié)果證明了離子淌度在完整蛋白層面對(duì)糖蛋白及復(fù)合物穩(wěn)定性和小規(guī)模結(jié)構(gòu)變化及差異的分析能力，可與多種質(zhì)譜手段結(jié)合，為糖蛋白及復(fù)合物的多層次精細(xì)結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)解析提供靈活有效的研究方案。

致謝：感謝深圳灣實(shí)驗(yàn)室多組學(xué)質(zhì)譜平臺(tái)提供的儀器支持，以及殷海娣博士的技術(shù)協(xié)助。