基于離子阱質(zhì)譜的離子碰撞截面積測量方法研究進(jìn)展

向 玉，姜 婷，徐 偉

(北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100084)

分子的結(jié)構(gòu)分析(如蛋白質(zhì)的構(gòu)象)對于從分子水平上理解其功能至關(guān)重要[1-2]。離子碰撞截面積(CCS)是表征分子結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)，在區(qū)分同分異構(gòu)體及其構(gòu)象方面具有重要價值。離子遷移譜(IMS)是目前測量離子CCS的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。靜態(tài)漂移時間離子遷移譜(DTIMS)[4]、行波場離子遷移譜(TWIMS)[5]、差分離子遷移譜(FAIMS)[6]、捕獲離子遷移譜(TIMS)[7]、吸入離子遷移譜(AIMS)[8-9]、橫向調(diào)制離子遷移譜(TMIMS)[10]以及泛音遷移譜(OMS)[11]等離子淌度譜均利用離子遷移率的差異區(qū)分離子。當(dāng)實驗條件已知時，IMS可以直接通過離子漂移時間或使用具有已知CCS的離子校準(zhǔn)漂移時間測量離子碰撞截面積。離子淌度譜具有原理簡單、便攜性好、成本低廉等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于爆炸物檢測[12]、環(huán)境分析[13]、醫(yī)療臨床診斷[14]、生物學(xué)[15]等領(lǐng)域，尤其在痕量氣體的研究中作用突出[16]。隨著應(yīng)用范圍的持續(xù)擴(kuò)大，IMS不足以分析復(fù)雜樣品成分，從而發(fā)展了IMS與其他系統(tǒng)的聯(lián)用技術(shù)以提升分析能力，如離子淌度質(zhì)譜(IMS-MS)[17-18]、氣相色譜-離子淌度譜(GC-IMS)[19]等。

IMS-MS可同時測量待測物質(zhì)量和離子碰撞截面積，能夠提供互補的離子結(jié)構(gòu)信息[20-23]。但在IMS實驗中，離子與緩沖氣體發(fā)生多次碰撞，使離子加熱并導(dǎo)致離子構(gòu)象變化。同時，由于分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和動態(tài)性，尤其是生物分子，對離子結(jié)構(gòu)分析技術(shù)提出了更高的要求。因此，開發(fā)測量離子CCS的新方法成為研究熱點。在單一質(zhì)量分析器中實現(xiàn)CCS的測量，使質(zhì)譜儀可以同時測量分子質(zhì)量與CCS，能夠降低儀器的復(fù)雜度，是未來發(fā)展趨勢之一。

隨著高分辨傅里葉變換質(zhì)譜儀的發(fā)展，測量更大質(zhì)量或尺寸的離子(例如生物分子)CCS成為可能，同時開發(fā)了離子阱中離子CCS的測量方法。離子阱中對離子CCS的測量依賴于離子與緩沖氣體的碰撞產(chǎn)生的運動衰減，因此對離子與緩沖氣體分子碰撞的表征對于測量離子CCS尤為關(guān)鍵。

本文將首先介紹離子緩沖氣體分子碰撞理論，然后對離子阱質(zhì)譜儀測量離子CCS的研究進(jìn)展進(jìn)行討論，并介紹根據(jù)鏡像電流提取離子CCS的方法。

1 離子緩沖氣體分子碰撞理論

早期研究人員嘗試?yán)秒x子回旋共振(ICR)測量離子CCS時[24]，受真空系統(tǒng)和磁場的限制(氣壓約0.1 Pa，磁場小于1 T)，離子在ICR池中與緩沖氣體的碰撞多為低能碰撞。低能離子-中性分子碰撞可利用Langevin碰撞模型或硬球碰撞模型對ICR池中的碰撞進(jìn)行模擬。Langevin碰撞模型將離子作為無量綱的點電荷，將中性分子作為離子感應(yīng)的電偶極子[25]；硬球碰撞模型適用于更大物理半徑和更高速度的離子[26]。1996年，有報道提出了結(jié)合Langevin碰撞和硬球碰撞的混合碰撞模型[27]。測量離子碰撞截面積需要在高氣壓下實現(xiàn)，與傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)需要在低氣壓下實現(xiàn)高分辨相互矛盾。基于此，有研究人員[28]采用更強(qiáng)磁場和更大尺寸的ICR池以獲得更高的分辨率，這種情況下離子會獲得更高的能量，而低能離子-中性分子碰撞模型將不適用，需要開發(fā)更高能量的碰撞模型，以表征高磁場大尺寸的ICR池中離子碰撞引起的離子運動特性。

Xu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在FT-ICR池中(9.4 T，ID 96 mm，40%激發(fā)半徑)，m/z1 295.6離子激發(fā)后動能可達(dá)約10 400 eV?；诖?，該課題組提出了高能硬球碰撞模型研究其非線性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)離子相干包的回旋共振半徑不同于Langevin和硬球碰撞2種模型的因離子-中性碰撞而減小。此時假設(shè)離子的CCS是常數(shù)，其反映離子的物理尺寸，同時假設(shè)單個離子-中性分子碰撞使空間相干離子包的離子去相(或碎裂)，則激發(fā)期間離子包中的離子數(shù)(N)示于式(1)：

dN=-Nnνσdt

(1)

N(t)=N0e-nνσt

(2)

式中，N0為離子包初始離子數(shù)目。由式(2)可知，高能硬球碰撞模型中鏡像電流將以指數(shù)形式衰減。Langevin碰撞模型的鏡像電流衰減與高能硬球碰撞模型相同，具有不同CCS的離子，頻譜曲線皆為洛倫茲曲線。硬球碰撞模型具有與高能硬球碰撞模型相同的CCS，但鏡像電流衰減不同，二者根據(jù)離子閾值動能(離子從離子包中去相(或碎裂)所需的動能)區(qū)分。離子-中性分子碰撞模型比較情況列于表1，不同碰撞模型的適用范圍示于圖1。

溫度[17]、氣壓[29]、離子動能[28]、緩沖氣體分子[30]都會影響離子碰撞截面積的大小。目前，離子阱質(zhì)譜測量離子CCS主要通過離子-中性分子碰撞導(dǎo)致的離子運動衰減，但同時空間電荷效應(yīng)和非線性場效應(yīng)也會導(dǎo)致離子運動衰減[28, 31]，從而影響測量結(jié)果。離子運動衰減由離子-中性分子碰撞主導(dǎo)，是利用離子運動衰減率計算CCS的主要前提。如果不由碰撞主導(dǎo)離子運動衰減，利用離子運動衰減率計算CCS的結(jié)果是不準(zhǔn)確的。

表1 離子-中性分子碰撞模型[28]Table 1 Ion-neutral molecule collision model[28]

注：a.細(xì)胞色素C；b.泛素圖1 不同碰撞模型的適用范圍[28]Fig.1 Scopes of application of different collision models[28]

2 FT-ICR阱中離子碰撞截面積的測量

1963年，離子回旋共振線寬開始用于測量N2+、Ar+、O2+、H+等小離子的CCS[24,32]，此時傅里葉變換并未應(yīng)用于ICR池以獲得頻譜。在FT-ICR開發(fā)早期，Marshall等[33]發(fā)現(xiàn)離子-中性分子碰撞與信號瞬態(tài)衰減率有關(guān)，可以通過分析信號衰減率對離子-中性碰撞頻率進(jìn)行測量，但未被廣泛使用。自2012年以來，使用FT-ICR測量離子CCS得到快速發(fā)展，包括直接利用頻率峰寬計算(峰寬直接測量、峰寬校正、峰形擬合)、時域衰減曲線擬合以及利用希爾伯特變換或短時傅里葉變換進(jìn)行時頻分析。

2.1 頻率峰寬分析方法

2.1.1FT-ICR峰寬直接測量 2012年，Dearden等[30, 34]基于硬球碰撞模型提出了FT-ICR峰寬直接測量(CRAFTI)法，直接通過頻域質(zhì)譜線寬計算離子CCS。在高磁場水平(4.7 T)下測量FT-ICR電池中冠醚離子的CCS，計算公式如下：

(3)

(4)

式(4)表明，碰撞概率等于πfwhm，發(fā)生單次離子-中性分子碰撞的概率不直接取決于質(zhì)量，而是取決于離子速度、碰撞截面和中性碰撞氣體數(shù)密度。根據(jù)質(zhì)譜線寬計算離子CCS需要準(zhǔn)確的工作氣壓數(shù)值，但在FT-ICR實際工作中很難獲得，同時單次碰撞退相干限制了檢測離子質(zhì)荷比的上限。因此，Dearden團(tuán)隊在原有基礎(chǔ)上開發(fā)了一種“Multi-CRAFTI”技術(shù)[36]，可同時測量2個或多個離子的相對CCS，利用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)確定絕對CCS，并實現(xiàn)了四烷基胺和四辛基胺離子的CCS測量。

2.1.2峰寬校正 在FT-ICR儀器的典型操作緩沖氣體壓力(約10-8Pa)下，鏡像電流緩慢衰減，因此在采集和記錄鏡像電流信號時會產(chǎn)生窗口效應(yīng)，導(dǎo)致質(zhì)量峰變寬，示于圖2?；诖?，Xu等[37]提出了一種峰寬校正方法來消除這種窗口效應(yīng)，應(yīng)用高能硬球碰撞模型[28]，由吸收譜線形求解離子碰撞截面積：

(5)

注：a,b分別為無限長的時域信號及其頻譜；c,d分別為由6 s截斷窗口加權(quán)的相同時域信號及其頻譜圖2 窗口效應(yīng)[37]Fig.2 Windowing effect[37]

(6)

實驗表明，該CCS與IMS確定的CCS線性相關(guān)，且同IMS測量差異不大，說明本方法是分析離子結(jié)構(gòu)的補充，能夠準(zhǔn)確測量離子CCS。

2.1.3峰形擬合 峰寬計算對信噪比(S/N)和頻率分辨能力敏感，會影響離子CCS測量的準(zhǔn)確性和分辨能力。雖然提出了峰寬校正方法[37]，但對CCS測量的分辨率和準(zhǔn)確性仍需進(jìn)一步提高。因此，Xu等[38]提出了峰形擬合方法，利用質(zhì)譜峰的頻率信息重建頻譜峰，準(zhǔn)確計算離子CCS，同時提高對數(shù)據(jù)長度和背景噪聲的容忍度。

同峰寬校正方法[37]一樣，F(xiàn)T-ICR由于有限的電流信號采集時間被截斷產(chǎn)生窗口效應(yīng)。因此，峰形擬合方法中對時域鏡像電流信號進(jìn)行傅里葉變換，得到連續(xù)幅度譜(C(ω-ω0))：

(7)

式中，c為電流衰減因子，T為信號數(shù)據(jù)長度(時間)，ω0為離子回旋頻率。

實際操作中，首先對采樣的瞬態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行零填充，然后進(jìn)行快速傅里葉變換(FFT)獲得式(7)的幅度譜，流程示意圖示于圖3。計算特定峰的離子CCS時，確定中心峰(最大幅度值)，提取幅度大于該最大值20%的數(shù)據(jù)，利用式(7)計算理論峰形，然后通過最小二乘法擬合理論峰形與實驗峰形，計算得出電流衰減因子c?；诟吣苡睬蚺鲎材Ｐ涂傻贸瞿繕?biāo)離子CCS，通過對血管緊張素Ⅰ、緩激肽、泛素和細(xì)胞色素C的CCS測量，發(fā)現(xiàn)峰形擬合方法較峰寬校正方法的分辨率進(jìn)一步提高。

2.2 時域信號包絡(luò)提取

將電流信號轉(zhuǎn)換至頻域后，依據(jù)質(zhì)譜峰提取離子結(jié)構(gòu)信息的方法比較簡單，但是由于在頻域上的異構(gòu)體具有相同的質(zhì)譜峰，無法利用頻域上的質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)直接解析異構(gòu)體。因此，Xu等[39]考慮直接分析時域信號，理論上，在存在異構(gòu)體的情況下，電流信號是異構(gòu)體的離子運動衰減總和，據(jù)此可以解析異構(gòu)體各自的離子運動衰減曲線，從而提出了基于時域的數(shù)據(jù)處理方法，提取出具有特定運動頻率的離子運動衰減曲線。與在高能硬球碰撞模型中建立的直接擬合方法相比[28]，該方法能在短時間內(nèi)處理大量數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采集和處理的流程示意圖示于圖4a。

圖3 峰形擬合方法流程示意圖[38]Fig.3 Schematic diagram of peak shape fitting method[38]

注：a.衰減曲線擬合流程示意圖；b.泛素離子電流信號提取的衰減曲線與指數(shù)擬合； c.與IMS測得的泛素離子CCS的線性相關(guān)性圖4 基于時域的衰減曲線擬合方法測量離子CCS[39]Fig.4 Time-domain based decay curve fitting method of ion CCS measurement[39]

利用衰減因子c可以計算得出離子CCS：

(8)

式中，B為磁場強(qiáng)度，r為離子回旋軌道半徑。使用FT-ICR(9.4 T)測量泛素離子，獲得鏡像電流信號，數(shù)據(jù)處理后提取的衰減曲線與理論指數(shù)衰減模型吻合良好，示于圖4b。通過衰減曲線擬合方法測得的給定電荷狀態(tài)的泛素離子CCS與IMS測量得到的CCS呈良好的線性相關(guān)性，示于圖4c。

2.3 時頻分析

2.3.1希爾伯特變換 Xu等[39]提出的衰減曲線擬合方法在時域直接分析電流信號時有效避免了因使用快速傅里葉變換帶來的窗口效應(yīng)，以及窗口效應(yīng)帶來的離子運動頻率偏移[40-41]，但數(shù)據(jù)計算量巨大。為縮短時域分析數(shù)據(jù)長度，減少計算量，Xu等[41]開發(fā)了利用希爾伯特變換測量離子CCS的方法，直接在時域上對離子瞬態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行時頻分析，同時提取瞬時離子運動頻率、捕獲離子振幅衰減曲線，利用衰減曲線計算CCS，流程示意圖示于圖5。

根據(jù)衰減曲線Ai(t)最小二乘法擬合高能硬球碰撞模型可以得出衰減因子c，與衰減曲線擬合相似，利用式(8)計算得出離子CCS。

圖5 希爾伯特變換法流程示意圖[41]Fig.5 Schematic diagram of the Hilbert transform method[41]

2.3.2短時傅里葉變換(STFT) 通常來說，復(fù)雜化合物中多種離子的CCS不能直接進(jìn)行測量，同時也無法通過多次利用混合物質(zhì)譜圖中不同離子質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)進(jìn)行測量，因此，如何同時測量復(fù)雜化合物中多種離子CCS受到關(guān)注。Shi課題組[42]開發(fā)了快速測量混合物離子CCS的方法，利用短時傅里葉變換(STFT)處理時域信號，僅1次測量即可獲得多種離子CCS。時域信號經(jīng)短時傅里葉變換處理后，在傳統(tǒng)的傅里葉變換結(jié)果上增加了時間維度的信息，即獲得了“時間×頻率×強(qiáng)度”3維譜圖。根據(jù)不同質(zhì)荷比的離子具有不同的運動頻率，可以很容易地提取混合物中每個離子的衰減曲線。根據(jù)衰減曲線與離子-中性分子碰撞模型(此時應(yīng)用硬球碰撞模型，衰減曲線列于表1)擬合，可獲得每個離子的CCS，成功測量了石油瓦斯油基質(zhì)中脂肪酸和聚丙氨酸的CCS，示于式(9)：

(9)

其中，D為衰減因子，r0為離子初始運動半徑。

近十年來，F(xiàn)T-ICR測量離子CCS取得了較大進(jìn)展，但分辨率有待提高。除離子-中性分子碰撞外，引起離子運動衰減的其他因素(如空間電荷效應(yīng)等)有待進(jìn)一步解決。

3 Orbitrap軌道阱中離子碰撞截面積的測量

Orbitrap軌道阱具有與FT-ICR相媲美的分辨率和準(zhǔn)確度，在組學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用[43-44]。Thermo公司的Makarov等[45]研究發(fā)現(xiàn)，實驗中測量到電流信號衰減的原因主要是由于離子與緩沖氣體的大量碰撞，使離子碎裂從離子包退相干，從而提出利用Orbitrap軌道離子阱檢測的信號衰減計算離子相對碰撞截面積的可能。此后，該課題組[46]利用不同離子在軌道阱中的動能不同提取目標(biāo)峰的衰減因子，采用類似衰減曲線擬合的方法，利用衰減因子計算離子CCS。離子在Orbitrap中具有高動能，離子-中性分子碰撞與離子速度無關(guān)，由高能硬球碰撞模型[28]表征。隨后，德克薩斯大學(xué)的Brodbelt實驗室[47]進(jìn)一步完善了基于Orbitrap質(zhì)量分析器的時域瞬態(tài)信號衰減率確定蛋白質(zhì)離子CCS的方法，建立了Orbitrap分析器中的壓力與瞬態(tài)衰減率之間的線性關(guān)系，根據(jù)信號衰減率、離子速度、緩沖氣體密度計算離子CCS：

(10)

其中，L是平均離子運動半徑，fz是離子運動頻率。利用此方法測量泛素、細(xì)胞色素C、肌紅蛋白離子CCS，并與IMS測量的CCS值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)2種方法的結(jié)果差異不大。

4 四極離子阱中離子碰撞截面積的測量

除了FT-ICR和Orbitrap，離子碰撞截面積的測量也可以在四極離子阱內(nèi)實施。離子在四極離子阱中的動能遠(yuǎn)小于在FT-ICR或Orbitrap中，通常為幾十eV；四極離子阱中離子受偶極激發(fā)后在徑向以正弦曲線形式運動，不同于FT-ICR或Orbitrap中的圓周運動。Xu等[48]通過仿真模擬發(fā)現(xiàn)，四極離子阱中可能同時存在Langevin碰撞和硬球碰撞，因此混合碰撞模型更適于表征。在混合碰撞模型的基礎(chǔ)上，Xu等[49]在離子阱中引入高階場用于測量離子CCS。相同質(zhì)荷比、不同CCS的離子運動幅度衰減速度不同，物理尺寸更大的離子衰減速度更快。引入高階電場(如八階場)后，離子運動頻率隨運動幅度的降低發(fā)生頻移，利用短時傅里葉變換時頻分析離子軌跡，從而獲得離子運動頻率隨時間變化的曲線。在存在八階場的情況下，離子運動頻率f與離子有效半徑r0的關(guān)系示于式(11)：

f=

(11)

圖6 理論CCS與IMS測量結(jié)果[49]Fig.6 Results of theoretical CCS and IMS measurement

Xu等[49-50]提出的在離子阱測量離子CCS的方法僅在理論仿真中嘗試，并未用于實際實驗。最近，Nie課題組[51]利用自主搭建的四極離子阱(QIT)微粒質(zhì)譜儀開發(fā)了測量粒子CCS的方法，該方法基于流動氣體引起的粒子阻力和電場引起的俘獲力之間的平衡，實現(xiàn)了對SiO2/聚吡咯核殼粒子CCS的測量。隨后，Ouyang課題組[52]在自主搭建的雙線性離子阱(Daul-LIT)質(zhì)譜儀基礎(chǔ)上，使用離散大氣壓接口在Daul-LIT之間引入動態(tài)氣流，實現(xiàn)了LIT之間的離子轉(zhuǎn)移和具有不同CCS離子的分離及測量。

目前，關(guān)于四極離子阱測量離子CCS的研究報道不多，有待進(jìn)一步研究，如將引入高階場測量離子CCS的理論方法應(yīng)用于四極離子阱質(zhì)譜儀等。

5 靜電線性離子阱中離子碰撞截面積的測量

(12)

式中，f0為離子長期頻率。

Williams實驗室[54]將電荷檢測質(zhì)譜儀(CDMS)用于CCS測量，通過使用相似質(zhì)量和已知截面的離子校準(zhǔn)能量損失來確定離子的碰撞截面，利用離子運動頻率變化與離子能量損失的聯(lián)系測量離子與緩沖氣體碰撞造成的能量損失，成功測量了與牛血蛋白具有相似質(zhì)量的離子CCS。

以上研究證明了在ELIT中實現(xiàn)CCS測量的可能性，但離子CCS測量也會依賴于能量損失等其他條件。

6 不同離子阱質(zhì)譜測量離子碰撞截面積的比較

基于離子阱質(zhì)譜測量離子碰撞截面積的方法比較列于表2。多數(shù)離子阱質(zhì)譜儀中離子與緩沖氣體碰撞的概率較低，即使發(fā)生碰撞，受主要影響的為離子包，離子本身的構(gòu)象基本不變，因此可同時實現(xiàn)離子的MS/MS反應(yīng)和離子CCS測量。但目前發(fā)展的測量方法不足以滿足測量需求，離子阱質(zhì)譜無法同時實現(xiàn)多個離子CCS的測量，且無法測量同分異構(gòu)體的CCS，測量方法基本建立在相對測量的前提下，得到的結(jié)果需要校準(zhǔn)，而且受氣壓影響較大。

表2 基于離子阱質(zhì)譜測量離子碰撞截面積方法的比較Table 2 Comparison of CCS measurement methods based on ion trap mass spectrometry

7 總結(jié)與展望

近年來，通過質(zhì)譜實現(xiàn)離子CCS測量發(fā)展迅速，利用FT-ICR質(zhì)譜儀發(fā)展了CARFTI、峰寬校正、峰形擬合等頻域方法，以及時域的衰減曲線擬合方法、利用希爾伯特變換和短時傅里葉變換進(jìn)行時頻分析的方法，實現(xiàn)了更大質(zhì)量離子CCS的測量。同時，開發(fā)了在Orbitrap、ELIT、QIT中測量離子CCS的方法，滿足了日益增長的分子結(jié)構(gòu)解析需求，逐漸成為測量CCS的重要方法。但目前CCS的測量分辨率仍需提高；空間電荷效應(yīng)、非線性場效應(yīng)等因素對離子運動衰減的影響仍需改善；檢測器等硬件設(shè)備的工作性能仍需提高。