基于離子淌度-質(zhì)譜技術(shù)分析小分子代謝物的研究進(jìn)展

劉 娟，陸穎潔，黃益曼，蘇 越，郭寅龍

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院，上海 201203； 2.中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，金屬有機(jī)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032)

小分子代謝物(SMMs)一般指生物系統(tǒng)中分子質(zhì)量低于600 u[1-2]，具有特定生理活性或反映機(jī)體健康狀態(tài)的化合物。對(duì)SMMs的分析有助于更好地理解疾病的發(fā)展機(jī)制，發(fā)現(xiàn)疾病診斷的生物標(biāo)志物[3]。SMMs通常存在于生物樣品中，涵蓋氨基酸、糖類、脂肪酸、脂質(zhì)和維生素等不同化合物[4]。由于提取技術(shù)的不同和物化性質(zhì)的差異，使多種SMMs的同時(shí)分析受到限制，而且SMMs的鑒定受同分異構(gòu)體和同量異位素化合物等因素的干擾。樣品的定量分析通常需要高靈敏度的分析平臺(tái)，而生物樣品中代謝物的含量較低，不適宜用核磁共振法進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。色譜分析可獲得化合物的保留時(shí)間、質(zhì)荷比、特征碎片等信息，廣泛應(yīng)用于SMMs的分析中[6-7]，但不適合高通量測(cè)試，且許多異構(gòu)體代謝物的定性問題仍然沒有得到解決。質(zhì)譜技術(shù)能夠快速、高靈敏度和高選擇性地分析化合物，但根據(jù)分析物的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行區(qū)分超出了常規(guī)質(zhì)譜分析的范疇，需要第二維度來獲取分析物群體的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性[5]。

離子淌度(IMS)是一種毫秒級(jí)的氣相離子分離技術(shù)[8]，其核心原理是電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)離子在氣體阻尼環(huán)境中的遷移速率存在差異，通過離子的電荷狀態(tài)、大小、形狀、電荷位置或結(jié)構(gòu)剛度可實(shí)現(xiàn)分離[9]。離子遷移譜的研究最早可追溯到20世紀(jì)初[10-12]，然而，直至20世紀(jì)60年代，第一臺(tái)商品化的離子淌度儀才作為分析儀器問世[13]，主要用于毒品等揮發(fā)性有機(jī)物的痕量檢測(cè)[14]以及爆炸物[15]、化學(xué)戰(zhàn)劑[16]和空氣污染物[17]的分析。在過去幾十年，IMS經(jīng)歷了快速的發(fā)展，其不僅僅是化學(xué)戰(zhàn)劑和爆炸物的探測(cè)器，也成為生物分析的有力工具。為了完成日益復(fù)雜的，尤其是超高分辨率(>ca.200)的測(cè)量任務(wù)，對(duì)儀器分析性能的要求越來越高[18]。

20世紀(jì)60年代，為研究氣相離子化學(xué)開發(fā)了離子淌度-質(zhì)譜(IM-MS)儀[19]。目前，與IMS聯(lián)用的有四極桿質(zhì)譜、飛行時(shí)間質(zhì)譜、軌道離子阱質(zhì)譜和離子阱質(zhì)譜[20]。MS根據(jù)質(zhì)荷比的不同區(qū)分離子，給出分析物的特性和分子組成詳細(xì)信息。IMS根據(jù)離子通過緩沖氣體時(shí)遷移率的不同分離離子，從另一個(gè)維度使原本難以區(qū)分的離子快速分離。MS和IM間存在強(qiáng)大的協(xié)同效應(yīng)，能夠提供氣相離子的補(bǔ)充信息[22]。然而，測(cè)定離子遷移率時(shí)，電噴霧溶劑組成和流速、漂移區(qū)溫度、溶液濃度和色散電壓[21]等因素均會(huì)影響結(jié)果。因此，在建立分析方法前需要優(yōu)化儀器參數(shù)。

自2006年開發(fā)商業(yè)IM-MS儀器以來[23]，該技術(shù)在法醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、制藥、材料、醫(yī)學(xué)、化學(xué)戰(zhàn)劑和爆炸物檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[24-26]。IM-MS可在不增加分析時(shí)間的情況下提高M(jìn)S檢測(cè)的選擇性[27-28]，具有3個(gè)主要技術(shù)優(yōu)勢(shì)：1) IM為樣品分析增加了1個(gè)分離維度，可增加峰容量和信噪比[29]；2) 可提供離子碰撞截面積(CCS)作為分析物識(shí)別的額外度量；3) 作為描述化合物結(jié)構(gòu)模型的幾何參數(shù)，即將離子淌度的測(cè)量值(漂移時(shí)間或電場(chǎng)強(qiáng)度)轉(zhuǎn)換為CCS測(cè)量值以表征氣相分析物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象。近年來，IM-MS在天然產(chǎn)物[30-31]、微生物[32]、糖類[33-35]、脂質(zhì)組學(xué)[36-38]、蛋白質(zhì)組學(xué)[39-40]、食品[41]和環(huán)境樣品[42]檢測(cè)方面受到關(guān)注。

本綜述將主要介紹IM-MS在小分子代謝物研究中取得的進(jìn)展，展望其在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用前景。希望為研究人員建立小分子代謝物離子淌度-質(zhì)譜分析方法提供參考。

1 離子淌度-質(zhì)譜技術(shù)

1.1 儀器

商品化的IMS儀器包括漂移管離子淌度(DTIMS)[43]、行波離子淌度(TWIMS)[44]、高場(chǎng)不對(duì)稱波形離子淌度(FAIMS)[45]、捕集離子淌度(TIMS)[46]、環(huán)形離子淌度(cIMS)[47]、無損離子操縱淌度(SLIM)[48]。此外，未商品化但分辨率較高的儀器(如U形離子淌度(UMA)[49])也有所使用。TIMS、cIMS、SLIM和UMA的分辨率均大于200，是高分辨離子淌度儀，詳細(xì)情況列于表1。

表1 常用的離子淌度-質(zhì)譜儀信息Table 1 Information of commonly used ion mobility mass spectrometer

常見的商品化離子淌度儀類型示于圖1。根據(jù)分離模式，IMS可分為時(shí)間擴(kuò)散型、空間擴(kuò)散型、限制和選擇性釋放型[50]。時(shí)間擴(kuò)散型離子淌度中的所有離子沿類似的路徑漂移，產(chǎn)生到達(dá)時(shí)間譜，如DTIMS和TWIMS。空間擴(kuò)散型離子淌度中的離子根據(jù)遷移率的差異沿不同漂移路徑分離，但在時(shí)間上沒有顯著的色散，如DMA和FAIMS。離子限制和釋放型的離子淌度中，將離子捕獲在加壓區(qū)域內(nèi)，并根據(jù)遷移率的差異選擇性地噴射離子，如TIMS。

1.2 離子化技術(shù)

離子淌度以氣相離子的形式分離化合物，選擇適宜的離子化技術(shù)對(duì)待測(cè)物分析至關(guān)重要。為使IM-MS適用于檢測(cè)不同極性分析物，將不同離子化機(jī)理的離子源與IMS相結(jié)合，列于表2。對(duì)于小分子代謝物的分析，電噴霧電離(ESI)是使用最廣泛的電離源，主要電離生物基質(zhì)中不同的非揮發(fā)性化合物，如氨基酸、脂肪酸、多肽。雖然存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，但ESI仍適用于大多數(shù)小分子代謝物的電離?；贗M-MS的質(zhì)譜成像研究中，基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)使用最廣泛。此外，基于電噴霧原理的敞開式離子化技術(shù)，如解吸電噴霧電離(DESI)、激光燒蝕電噴霧電離(LAESI)也常用于電離固體樣品。

圖1 常見的商品化離子淌度儀類型Fig.1 Common commercial instruments of ion mobility spectrometry

表2 離子淌度-質(zhì)譜中使用的離子化技術(shù)Table 2 Ionization techniques used in ion mobility-mass spectrometry

1.3 離子碰撞截面積測(cè)量

簡(jiǎn)單來說，CCS是對(duì)氣相離子大小的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)量、表征，通常以?2表示。使用均勻電場(chǎng)IMS技術(shù)時(shí)，CCS值可以直接由漂移時(shí)間得出[56]。如在DTIMS中，離子在恒定電場(chǎng)下通過中性氣體時(shí)，由于離子與緩沖氣體發(fā)生碰撞，遷移速率降低，質(zhì)荷比相同但三維結(jié)構(gòu)不同的離子在緩沖氣體中的遷移速率不同，離子松散結(jié)構(gòu)將使其具有更多與氣體碰撞的機(jī)會(huì)。因此，相比于緊湊結(jié)構(gòu)，松散結(jié)構(gòu)的離子穿過漂移區(qū)的時(shí)間將更長(zhǎng)。此外，DTIMS測(cè)量的漂移時(shí)間包括離子通過漂移管、漂移管后離子光學(xué)和飛行管的時(shí)間。為測(cè)量離子遷移率K，將離子注入有恒定電場(chǎng)E、長(zhǎng)度L的漂移管中，按式(1)測(cè)量離子到達(dá)探測(cè)器所需的漂移時(shí)間td。

(1)

由于DTIM-MS中氣體壓力和電子元件的精確控制，使絕對(duì)碰撞截面的測(cè)量具有高通量和高精度(超過0.5%)，研究人員建立了許多基于氮?dú)夥諊呐鲎步孛鏀?shù)據(jù)庫(kù)[57-60]。根據(jù)Mason-Schamp方程[61]，通過記錄的離子漂移時(shí)間計(jì)算CCS值(Ω)，示于式(2)。

(2)

其中，K0為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)(溫度、壓力)下的遷移率，z為離子的價(jià)態(tài)，e為元電荷，N為漂移氣體的密度，μ為離子-中性漂移氣的折合質(zhì)量，T為氣體溫度，kB為玻爾茲曼常數(shù)。CCS值計(jì)算軟件有MOBCAL、IMoS和hpccs，其中前兩者使用較多[62]。計(jì)算的CCS值為理論值，通過比較CCS實(shí)測(cè)與CCS理論對(duì)化合物進(jìn)行定性分析。此外，當(dāng)使用非均勻電場(chǎng)技術(shù)(如TWIMS)時(shí)，由于離子的速度和運(yùn)動(dòng)路徑不是恒定的，漂移時(shí)間與遷移率的倒數(shù)不成正比。為了獲得非均勻場(chǎng)IMS技術(shù)的CCS，可以在相同的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)量已知CCS的校準(zhǔn)離子，以計(jì)算分析物的CCS[63]。在最新的TW-IMS-MS系統(tǒng)中，校準(zhǔn)步驟已實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化。常見的離子淌度CCS值的獲得情況列于表3。

表3 CCS值的獲得情況Table 3 Acquisition of CCS value

2 離子淌度-質(zhì)譜在小分子代謝物分析中的應(yīng)用

2.1 氨基酸

氨基酸(AAs)是蛋白質(zhì)的主要組成部分，也是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)器及幾種激素和神經(jīng)遞質(zhì)的前體[64]。許多蛋白質(zhì)氨基酸具有次級(jí)代謝作用，例如蛋氨酸可誘發(fā)膽固醇合成增強(qiáng)[65]，谷氨酰胺可在機(jī)體代謝中維持pH值穩(wěn)態(tài)[66]。生物樣品中微量游離氨基酸的分析在生物技術(shù)和新生兒篩查等領(lǐng)域具有重要意義[67]。IM-MS可完成快速地分離、分析，實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)試。

氨基酸結(jié)構(gòu)中含有—NH2和—COOH，在ESI電離模式下，分子結(jié)構(gòu)中存在2個(gè)質(zhì)子化位點(diǎn)，即被質(zhì)子化的—NH2(氨基質(zhì)子化離子)和被質(zhì)子化的—COOH(羧基質(zhì)子化離子)?；诖?，郭寅龍課題組[68]采用IM-MS/MS技術(shù)研究了電噴霧電離下亮氨酸和異亮氨酸的電離行為。在IM-MS二維譜圖中，由一級(jí)質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)二者[M+H]+的質(zhì)荷比相同，無法區(qū)分；由離子淌度圖發(fā)現(xiàn)二者的漂移時(shí)間不同，可通過計(jì)算2種質(zhì)子化離子的CCS值進(jìn)行區(qū)分，并評(píng)估氨基酸與其原單體之間的定量關(guān)系。結(jié)果表明，羧基質(zhì)子化離子的豐度與氨基酸濃度成正比，而氨基質(zhì)子化離子的豐度沒有相同的趨勢(shì)。因此，電離模式不僅會(huì)影響亮氨酸和異亮氨酸的原聚體形式，而且影響其定量關(guān)系。

由于原子的空間排列不同，氨基酸具有手性對(duì)映體，即右旋(D)或左旋(L)對(duì)映體。雖然對(duì)映體具有幾乎相同的結(jié)構(gòu)，但其生物功能不同[69]。此外，氨基酸手性識(shí)別在手性生物標(biāo)志物的診斷和預(yù)后中起著至關(guān)重要的作用[70]。根據(jù)Pirkle法則[71]，識(shí)別手性氨基酸時(shí)需將手性選擇分子與對(duì)映體絡(luò)合形成非對(duì)映體絡(luò)合物，以有利于手性氨基酸的分離[72]，示于圖2。

氨基酸是手性配體，對(duì)高價(jià)金屬離子中心具有較強(qiáng)的親和力。氨基酸的N和O原子與各種金屬離子的螯合能力有助于形成復(fù)雜結(jié)構(gòu)[73]。研究人員采用手性氨基酸與二價(jià)金屬絡(luò)合，形成金屬結(jié)合三聚體來分離手性氨基酸[74-75]，但該方法需形成相對(duì)較大的三聚體，且要優(yōu)化氨基酸、金屬離子和手性選擇器之間的濃度比[76]。此外，在漂移氣中摻入手性改性劑，其分子離子團(tuán)簇會(huì)產(chǎn)生不同的離子遷移率，以實(shí)現(xiàn)手性氨基酸的分離[77]，但這種方法需較高的氨基酸濃度。因此，新型的非金屬手性選擇器的研究成為熱點(diǎn)[78]。

注：a.金屬離子；b.手性改性劑；c.非金屬手性選擇器圖2 離子淌度-質(zhì)譜識(shí)別手性氨基酸Fig.2 Recognition of chiral amino acid by ion mobility-mass spectrometry

唐科奇課題組[79]利用寡糖作為手性選擇劑，采用TIMS-MS鑒別了21種手性氨基酸。此外，具有手性的環(huán)糊精[80]可與氨基酸形成主客體非共價(jià)復(fù)合物，通過SLIM分離，可實(shí)現(xiàn)氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的高靈敏度檢測(cè)。IM-MS與化學(xué)衍生化結(jié)合也是識(shí)別手性氨基酸常用的分析策略，Baker等[81]采用茴二氧基硫酰氯衍生手性氨基酸形成非對(duì)映異構(gòu)體，并通過TIMS分離完成D/L-氨基酸的手性鑒別，總分析時(shí)間15 min，衍生化處理使分析周期延長(zhǎng)。Karst等[82]設(shè)計(jì)了一種手性衍生氨基酸結(jié)合TIMS-MS自動(dòng)分析方法，將帶有自動(dòng)進(jìn)樣器的色譜系統(tǒng)與(S)-氯化萘普生在線衍生手性氨基酸，衍生物直接引入ESI-TIMS-MS系統(tǒng)，分析周期控制在3 min，可實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化分析。郭寅龍課題組[83]開發(fā)了d0/d5-雌二醇-3-苯甲酸-17β-氯甲酸酯(d0/d5-17β-EBC)手性選擇劑，對(duì)氨基酸具有高反應(yīng)性和良好的對(duì)映體分辨率。在IM-MS分析之前，使用單一手性選擇劑17β-EBC對(duì)氨基酸進(jìn)行快速、簡(jiǎn)單的化學(xué)衍生化處理，一次分析周期中，19個(gè)手性蛋白源氨基酸均獲得了良好的對(duì)映體分離(約2 s)。同時(shí)，利用d0/d5-17β-EBC建立了對(duì)映體過量的線性校準(zhǔn)曲線，在nmol范圍內(nèi)，測(cè)量低至0.5%的對(duì)映體比值。17β-EBC已成功用于研究肽類藥物中氨基酸的絕對(duì)構(gòu)型，并檢測(cè)復(fù)雜生物樣品中的微量D-AAs。d0/d5-17β-EBC可能有助于在肽類藥物質(zhì)量控制和發(fā)現(xiàn)手性疾病生物標(biāo)志物方面的研究。

2.2 多肽

多肽在生物體的信號(hào)傳導(dǎo)、醫(yī)療診斷和治療方面具有重要作用，識(shí)別和定位多肽異構(gòu)體有助于理解其功能。LC-MS能夠識(shí)別許多常見的翻譯后修飾多肽，但基于質(zhì)譜技術(shù)的多肽異構(gòu)體或多肽外消旋體的識(shí)別仍不清晰。IM-MS在確定肽結(jié)構(gòu)、研究神經(jīng)立體異構(gòu)和受體、分析肽復(fù)合物混合物方面得到廣泛應(yīng)用[84]。Dittmar等[85]采用TIMS-Q TOF MS進(jìn)行靶向肽定量方法研究，在30 min的液相色譜分離過程中檢測(cè)到約200個(gè)肽，檢測(cè)并量化了添加在HeLa細(xì)胞提取物中的合成肽。

β-淀粉樣蛋白(Aβ)積累是阿爾茨海默病的標(biāo)志之一[51]，翻譯后修飾的立體異構(gòu)化Aβ肽具有相同的元素組成和相似的物理化學(xué)性質(zhì)，準(zhǔn)確分析生成的立體異構(gòu)體具有挑戰(zhàn)性。Roberts等[86]采用LC-IM-MS表征散發(fā)性阿爾茨海默病大腦顳葉皮質(zhì)中最常見的異構(gòu)化淀粉樣b肽，并對(duì)淀粉樣蛋白b肽的N端進(jìn)行定量評(píng)估。結(jié)果表明，N端的天冬氨酸(Asp-1和Asp-7)超過80%發(fā)生異構(gòu)化。另外，IM-MS能夠區(qū)分單殘基的異構(gòu)體。Smith課題組[87]利用SLIM-MS結(jié)合蛇形超長(zhǎng)路徑的方法，快速解析異構(gòu)化和外消旋L-天冬氨酸殘基的β-淀粉樣胰蛋白酶肽的差向異構(gòu)體(約1 s)。為深入了解阿爾茨海默病藥物靶點(diǎn)，李靈軍等[88]研究了Aβ肽的手性效應(yīng)，為表位區(qū)域特異性、手性調(diào)節(jié)的Aβ片段自組裝及其對(duì)受體識(shí)別的潛在影響提供了進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和分子證據(jù)，該結(jié)果可能為Aβ表位區(qū)域?qū)ν獠看碳さ奶禺愋苑磻?yīng)提供補(bǔ)充見解。

此外，藥物-抗體比率是評(píng)估抗體-藥物復(fù)合物的療效、安全性和選擇性的關(guān)鍵指標(biāo)，但藥物結(jié)合的異質(zhì)性以及單克隆抗體中可能存在的大量翻譯后修飾難以表征。采用IM-MS可以快速確定抗體上結(jié)合藥物的平均數(shù)量，更好地了解其潛在毒性和效力[89]。

2.3 脂質(zhì)

脂質(zhì)作為細(xì)胞膜、能量?jī)?chǔ)存和信號(hào)分子的成分，在哺乳動(dòng)物的生物功能中發(fā)揮著多重作用。脂質(zhì)種類數(shù)量巨大且多樣，不飽和脂肪酰鏈位置(sn-1、sn-2或sn-3)、雙鍵的位置和方向(順式或反式)以及官能團(tuán)立體化學(xué)(R與S)與特定脂質(zhì)生物學(xué)基質(zhì)與疾病相關(guān)[90]。因此，闡明脂質(zhì)異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)對(duì)探索其功能至關(guān)重要?；谫|(zhì)譜法的脂質(zhì)分析將脂質(zhì)類型識(shí)別和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)信息結(jié)合起來以提高表征能力[91]，臭氧誘導(dǎo)解析[92-94]、紫外光解離[95]、低溫等離子體[96]、Paterno-Buchi反應(yīng)[97]等方法均被應(yīng)用于不飽和脂肪酸雙鍵位置分析中。相比于以上方法，IM-MS可直接、快速地分離氣相的脂質(zhì)離子，成為復(fù)雜生物樣品中脂質(zhì)異構(gòu)體高通量分析的有力工具。

在生物體內(nèi)，脂肪酸通常與甘油三酯和磷脂相結(jié)合，或以游離酸的形式存在[98]。郭寅龍課題組[99]采用ESI-IM-MS研究了18種脂肪酸的離子遷移率和碰撞截面積。結(jié)果表明，飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸以及順/反異構(gòu)體中脂肪族的尾鏈長(zhǎng)度對(duì)漂移分化影響較大，而雙鍵的數(shù)目對(duì)漂移分化影響較小。對(duì)于含有共軛雙鍵的不飽和脂肪酸，如亞油酸和油酸，瑕瑜課題組[100]采用Paternò-Bùchi反應(yīng)結(jié)合TIMS-MS分析了不飽和脂肪酸的順、反異構(gòu)體。

采用IM-MS直接進(jìn)樣時(shí)，不經(jīng)色譜直接快速完成分離，其潛在缺陷是離子抑制效應(yīng)增強(qiáng)。為解決這個(gè)困擾，郭寅龍課題組[101]采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SIL)羧基結(jié)合ESI-IMS-MS快速分析脂肪酸，示于圖3。結(jié)果表明，d0/d6-DMPP在信號(hào)增強(qiáng)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，其標(biāo)記的脂肪酸具有相似的漂移時(shí)間、6 u的質(zhì)量偏差、特定報(bào)告離子、相似的MS響應(yīng)，而且遵守漂移時(shí)間規(guī)則，即碳鏈長(zhǎng)度和不飽和度對(duì)相對(duì)漂移時(shí)間的影響。在無色譜分離的情況下，該方法可用于正常甲狀腺組織和癌組織間微量游離脂肪酸的快速檢測(cè)。

注：*代表標(biāo)記為脂肪酸的d6-DMPP圖3 等摩爾濃度下，d0-DMPP和d6-DMPP標(biāo)記的 混合標(biāo)準(zhǔn)品IM-MS和MS圖[101] Fig.3 IM-MS and MS spectra for a mixed test sample of d0-DMPP and d6-DMPP labeled standards in equal molar concentration[101]

雖然IM-MS在脂質(zhì)分析上顯示出巨大的應(yīng)用潛力，但常規(guī)的分析軟件一般無法直接處理儀器采集的數(shù)據(jù)，導(dǎo)致IM-MS的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值受到現(xiàn)有脂質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定方法的限制。近5年使用較多的代謝物CCS值數(shù)據(jù)庫(kù)列于表4。2016年，朱正江課題組[104]首次發(fā)展機(jī)器學(xué)習(xí)算法計(jì)算代謝物的CCS值，并開發(fā)出可廣泛用于代謝物預(yù)測(cè)的CCS值數(shù)據(jù)庫(kù)(MetCCS)。為了解異常的甾醇脂質(zhì)代謝及其在腦疾病中的作用，該課題組[105]將IM-MS與機(jī)器學(xué)習(xí)功能相結(jié)合，采用四維技術(shù)描繪小鼠大腦10個(gè)功能區(qū)域中甾醇脂質(zhì)的空間分布，揭示固醇脂質(zhì)數(shù)量改變、濃度變化和年齡依賴性協(xié)同調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的變化，并建立高覆蓋率庫(kù)(>2 000甾醇脂質(zhì))以準(zhǔn)確識(shí)別甾醇脂質(zhì)。此外，針對(duì)脂質(zhì)類代謝物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，該課題組[106-107]發(fā)展了脂質(zhì)的預(yù)測(cè)CCS值數(shù)據(jù)庫(kù)LipidCCS和鑒定CCS值的軟件Lipid-IM MS，以準(zhǔn)確識(shí)別非靶向的脂質(zhì)代謝物，涵蓋了26萬種脂質(zhì)及相應(yīng)的四維結(jié)構(gòu)信息(即質(zhì)荷比、保留時(shí)間、碰撞截面積和二級(jí)質(zhì)譜圖)，支持多維信息進(jìn)行脂質(zhì)鑒定，提高了鑒定的覆蓋率和可信度。在此基礎(chǔ)上，朱正江課題組[108]開發(fā)了第二代CCS值的計(jì)算方法AllCCS，其中包含5 000多個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)量CCS值和1 100多萬個(gè)預(yù)測(cè)CCS值，且預(yù)測(cè)精度在2%以內(nèi)，大幅提升了生物體內(nèi)已知和未知代謝物化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定的準(zhǔn)確性。

表4 近5年代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)簡(jiǎn)介Table 4 Introduction of metabolite database in recent 5 years

2.4 類固醇

類固醇激素參與生殖、應(yīng)激和免疫反應(yīng)等生命過程，是機(jī)體健康狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)[115]。類固醇激素分為皮質(zhì)類固醇(糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素)、雄激素、孕激素和雌激素等4大類，它們來自一種常見的前體膽固醇[116]。類固醇代謝的2個(gè)初步階段分別是官能化反應(yīng)和共軛反應(yīng)，產(chǎn)生的代謝物可能與原始分子具有不同的活性和毒性。采用色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析時(shí)，需要相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品定性。因CCS可作為分析物識(shí)別的額外度量，IM-MS技術(shù)在類固醇分析中得到廣泛應(yīng)用。為便于篩查不同樣本中的類固醇，建立了類固醇的CCS值數(shù)據(jù)庫(kù)[58,117-118]。

郭寅龍課題組[119]將吡啶和亞硫酰氯作為衍生試劑，通過一步衍生化反應(yīng)，脂肪醇、脂肪醛和甾醇的檢測(cè)靈敏度得到顯著提高，并結(jié)合ESI-IM-MS快速分析甲狀腺癌組織和癌旁正常組織中的15種脂肪醇、脂肪醛和甾醇，示于圖4。結(jié)果表明，2種組織中某些分析物的含量存在顯著差異(p<0.05)，甲狀腺癌組織中大多數(shù)分析物之間的相關(guān)性優(yōu)于癌旁正常組織中的相關(guān)性。

圖4 基于衍生化的電噴霧-離子淌度-質(zhì)譜法同時(shí)分析甲狀腺組織中的脂肪醇、脂肪醛和甾醇[119]Fig.4 Simultaneous analysis of fatty alcohols, fatty aldehydes, and sterols in thyroid tissues by electrospray ionization-ion mobility-mass spectrometry based on charge derivatization[119]

蛋白同化類固醇代謝物的檢測(cè)和鑒定在臨床、法醫(yī)學(xué)和興奮劑分析中至關(guān)重要。Chouinard等[120-121]以睪酮和表睪酮為例，分別使用臭氧誘導(dǎo)環(huán)內(nèi)碳碳雙鍵裂解和Paternò-Bùchi反應(yīng)衍生化內(nèi)源性類固醇。結(jié)果表明，經(jīng)臭氧的裂解，睪酮和表睪酮產(chǎn)生獨(dú)特、穩(wěn)定的氣相構(gòu)象及碰撞截面；在低壓汞燈下，睪酮和表睪酮經(jīng)Paternò-Bùchi反應(yīng)形成甾體氧烷，可產(chǎn)生獨(dú)特的離子遷移譜，使每種異構(gòu)體具備獨(dú)特的指紋，這2種方法均可提高違禁物識(shí)別的準(zhǔn)確性。Colin等[122]建立了LC-FAIMS-MS法分析尿中7種合成代謝雄激素類固醇的葡萄糖醛酸和硫酸鹽代謝產(chǎn)物，根據(jù)不同模式下每種代謝物所特有的醋酸鈉簇鑒定類固醇代謝物，正離子模式下，對(duì)陽(yáng)離子加合物(H+、NH4+、Na+、K+和Cs+)進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)減少基質(zhì)干擾，無標(biāo)記尿液中二鈉固醇代謝物加合物的信噪比會(huì)增加(>250%)。McLean等[123]開發(fā)了LC-IM-HRMS方法進(jìn)行完整Ⅱ期類固醇代謝物的多維分離以增加峰值容量，利用IM的碰撞截面積值作為另一維度的分子表征方法以提高選擇性，并改進(jìn)了低濃度下完整類固醇分析的識(shí)別。

2.5 聚糖

聚糖影響糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)的靶向運(yùn)輸，參與糖蛋白新生肽鏈的折疊或聚合和分子間的識(shí)別。然而，聚糖包含了多種結(jié)構(gòu)上細(xì)微差異的連接異構(gòu)體、位置異構(gòu)體和組成異構(gòu)體，常見的有N-連接聚糖[124-127]和O-連接聚糖[128-129]。由于缺乏能夠表征糖苷鍵和單糖的分析工具，導(dǎo)致分析聚糖的結(jié)構(gòu)和功能受阻，相比多肽、寡核苷酸，表征聚糖的難度更大[130-131]。聚糖是親水性分子，需衍生化后再進(jìn)行反相色譜分離。質(zhì)譜法僅需少量樣品，且易與色譜耦合，可使用不同的裂解策略產(chǎn)生結(jié)構(gòu)信息，是分析聚糖的首選方法。然而，由于單糖異構(gòu)體和糖苷鍵的多樣性，僅通過碎片信息不足以完整描述聚糖結(jié)構(gòu)。因此，需要分離聚糖，并結(jié)合裂解數(shù)據(jù)和生物合成途徑預(yù)測(cè)聚糖結(jié)構(gòu)。最初，IM在聚糖分析中的應(yīng)用集中在小分子聚糖異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)品，隨著儀器水平提升和商業(yè)化程度增加，IM-MS聯(lián)用技術(shù)被用于分離多種樣本來源的聚糖異構(gòu)體[132]。

目前，聚糖檢測(cè)主要分為完整聚糖的直接分析和利用質(zhì)譜碎裂功能進(jìn)行碎片分析2種策略[133]，示于圖5。由于聚糖能形成離子淌度強(qiáng)度、遷移率差異大的正離子或負(fù)離子[134]，分析完整聚糖時(shí)可進(jìn)行直接分析或在樣品中添加金屬陽(yáng)離子形成復(fù)合物。IM-MS也可實(shí)現(xiàn)對(duì)聚糖分子的直接分析，但對(duì)儀器分辨率要求較高。有報(bào)道[135]利用SLIM的蛇形超長(zhǎng)路徑結(jié)構(gòu)SLIM SUPER IM-MS實(shí)現(xiàn)了完整聚糖高分辨分析，該平臺(tái)為糖化學(xué)提供了極具潛力的思路。在樣品中添加金屬陽(yáng)離子可促進(jìn)非共價(jià)復(fù)合物的形成，通常二價(jià)金屬加合物的分離效果最好。Baker等[136]比較了二價(jià)金屬M(fèi)n2+、Cu2+和Zn2+強(qiáng)化聚糖異構(gòu)體在正、負(fù)離子模式下的IMS-MS分離效果，采用IMS-Q TOF MS表征糖苷鍵(α或β)的不同構(gòu)型、不同線性或分支連接性引起的細(xì)微結(jié)構(gòu)差異的聚糖標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果表明，正、負(fù)離子模式切換時(shí)，聚糖的IMS圖改變，添加金屬離子可導(dǎo)致聚糖構(gòu)象發(fā)生顯著變化，并通過金屬絡(luò)合實(shí)現(xiàn)異構(gòu)體基線分離。隨著分子尺寸的增大，檢測(cè)分子中細(xì)微結(jié)構(gòu)差異越來越困難，可采用“鳥槍式”IM-MS測(cè)序分析裂解的碎片離子，以確定聚糖生物活性序列的確切信息。Pagel等[137]在離子淌度-質(zhì)譜儀中解離完整的硫酸乙酰肝素，并測(cè)量碎片的碰撞截面值，將完整離子和碎片離子的數(shù)據(jù)與36個(gè)已知結(jié)構(gòu)的硫酸乙酰肝素糖結(jié)構(gòu)(從二糖到十糖)進(jìn)行匹配，以確定驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)和未知天然糖的序列。

2.6 其他代謝產(chǎn)物

除常見的小分子代謝物外，植物的次生代謝產(chǎn)物研究也受到關(guān)注。郭寅龍課題組[138]采用高分辨U形離子淌度分析器分析了廣陳皮中多甲氧基黃酮，結(jié)果表明，ESI-UMA-MS可使橘皮素和甜橙黃酮達(dá)到完全分離。而在相同條件下，采用DTIMS-MS僅表現(xiàn)出分離的趨勢(shì)[139]。這表明ESI-UMA-MS在天然產(chǎn)物分析中有著廣闊的應(yīng)用前景[140]。

生物液體中的胍基化合物(GCs)和脲基化合物(UCs)濃度較低，但在生物活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[141]，同時(shí)檢測(cè)這2類化合物具有重要的臨床價(jià)值。郭寅龍課題組[142]采用芐基重排穩(wěn)定同位素標(biāo)記(BRSIL)結(jié)合LC-DTIMS-MS高通量地篩選和定量人甲狀腺組織中的GCs和UCs。結(jié)果表明，短的反相色譜柱可實(shí)現(xiàn)在線脫鹽和5 min的分析周期，根據(jù)三維離子特征(保留時(shí)間、漂移時(shí)間、質(zhì)荷比)[JP3]得出的離子豐度可用于定量甲狀腺組織中的GCs和UCs。BRSIL與LC-DTIMS-Q TOF MS聯(lián)用可作為研究人類甲狀腺組織中GCs和UCs的有力工具。

注：a.直接分析聚糖分子；b.非共價(jià)復(fù)合物；c.質(zhì)譜碎裂分析圖5 IM-MS分析聚糖的2種策略Fig.5 Two strategies for analyzing glycans by IM-MS

3 總結(jié)與展望

小分子代謝物存在于生物體的各種代謝過程，涵蓋大量的化合物類別。由于樣本量較少、目標(biāo)化合物豐度低、普遍存在同分異構(gòu)體，單獨(dú)采用質(zhì)譜法不足以對(duì)代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確分析。IM-MS技術(shù)可以大幅提升對(duì)小分子代謝物分析的靈敏度和準(zhǔn)確性，極大降低各種復(fù)雜體系中同分異構(gòu)體的分離和分析難度。隨著儀器技術(shù)的快速發(fā)展，高分辨離子淌度-質(zhì)譜不僅可簡(jiǎn)化同分異構(gòu)體的分離工作，而且可通過CCS值提高化合物鑒定的可信度。未來潛在的發(fā)展趨勢(shì)主要有以下2方面：1) 識(shí)別機(jī)體產(chǎn)生的代謝物有助于理解生理和病理的變化、發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志物。小分子代謝物包含大量已知和未知的代謝物，準(zhǔn)確鑒定小分子代謝物存在缺乏高覆蓋率的標(biāo)準(zhǔn)譜圖、缺少用于結(jié)構(gòu)解析的特征碎片及易受實(shí)驗(yàn)條件影響等難點(diǎn)。幸運(yùn)的是，IM-MS技術(shù)可提供多維信息表征代謝物，通過建立相關(guān)CCS數(shù)據(jù)庫(kù)能夠?qū)Υx物進(jìn)行可靠的注解，從而全面了解、揭示代謝物在生物過程中的作用。2) 基于IM-MS技術(shù)的先進(jìn)分析方法為天然產(chǎn)物的藥物發(fā)現(xiàn)提供了工具，其強(qiáng)大的分離能力可以提升天然產(chǎn)物的分析、表征準(zhǔn)確性。未來，IM-MS技術(shù)在藥物發(fā)現(xiàn)和天然產(chǎn)物分析等領(lǐng)域的應(yīng)用將會(huì)迅速增長(zhǎng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。