一株生防菌的篩選及其抗菌活性研究

顧會戰(zhàn) 史洪濤 何佶弦 母明新 尹振華 孫會忠 王小東*

（1四川省煙草公司廣元市公司，四川廣元 628100；2河南科技大學農學院，河南洛陽 471003）

對于植物而言，根際環(huán)境生活的大量微生物群落通過代謝活動對植物汲取養(yǎng)分、生長發(fā)育、病蟲害防御等起到很好的促進作用[1-4]。從根際環(huán)境中分離出的特定功能菌在與附生植物長期協(xié)同進化的過程中形成穩(wěn)定的共生關系，往往能夠產生特定的生物活性物質，從而表現(xiàn)出特定的功能活性，這是從特定環(huán)境篩選微生物資源（包括生防菌）的理論依據之一[5]。

煙草根際環(huán)境中存在豐富的微生物種群，包括細菌、真菌、放線菌、微藻、單細胞的原生動物等[6-7]，從煙草根際環(huán)境中篩選出生防細菌理論上是可行的，且從煙草根際環(huán)境篩選出來的生防菌對煙草具有更好的親和性，有利于對煙草真菌病害的防治。在此背景下，本研究對煙草根際土壤細菌進行了分離培養(yǎng)，篩選鑒定了具有顯著抑菌活性的微生物，并通過盆栽試驗驗證篩選菌株的生防效果，最后對目標菌株進行了分類鑒定?，F(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土樣。采集煙草根際土壤，稱量1 g土樣加入錐形瓶內，加入10 mL無菌水，搖床振蕩10 min充分混勻后即制得10-1土壤懸浮液。另取添加9 mL無菌水的試管，取10-1土壤懸浮液1 mL加入試管并振蕩搖勻，用同樣方法依次往復，制成10-4、10-5、10-6等3個濃度梯度的土壤懸浮液，各吸取1 mL涂板，37℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。①NA固體培養(yǎng)基，供內生細菌的分離、培養(yǎng)及拮抗試驗用。②PDA培養(yǎng)基，供病原真菌的培養(yǎng)及拮抗試驗用。③LB液體培養(yǎng)基，供生防菌菌懸液制備用。

1.2 抑菌活性測定

1.2.1 菌懸液的制備。將純化細菌接入100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，然后在32℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。取適量菌液于滅菌離心管中，12 000 r/min離心15 min，收集菌體，用無菌水懸浮并調整濃度至1.0×108CFU/mL，獲得菌株菌懸液。

1.2.2 平板對峙試驗。采用牛津杯平板對峙法，分別考察分離內生細菌對指示病原真菌黑曲霉的拮抗作用。在PDA平板中央接入黑曲霉菌餅，距菌餅一定距離對稱放置2個牛津杯，且每個牛津杯加注20 μL制備好的內生細菌菌懸液，以牛津杯注入無菌水作為對照，3次重復，置于28℃的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5～7 d，定期觀察生長情況。對照組長滿整個培養(yǎng)皿的3/4時，計算抑菌率，計算公式如下：

抑菌率（%）=（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100

1.3 目標菌抑菌作用應用實測試驗

測試植株的制備：用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草白粉病病原，并制備孢子懸浮液（血球計數(shù)板檢測孢子數(shù)目，調整孢子濃度至1.0×105CFU/L）。侵染方法：取1 mL孢子懸浮液接種到植株根部，同時進行葉面噴霧，確保植株發(fā)病；以無菌水處理作對照。

將抑菌效果最好的菌株用LB液體培養(yǎng)基32℃搖床培養(yǎng)至OD=4，然后12 000 r/min離心15 min收集菌體，再用等量無菌水懸浮菌體制得測試母液。施用方法為噴霧法（葉片完全濕潤）和灌根法，施用時間為病原侵染2 d后。每個處理3次重復，以無菌水處理作對照，7 d后進行葉片病情指數(shù)及發(fā)病率調查。

煙草白粉病調查分級標準：0級，葉部無病斑出現(xiàn)；1級，病斑面積占葉片總面積的15%以下；2級，病斑面積占葉片總面積的15%～25%；3級，病斑面積占葉片總面積的25%～50%；4級，病斑面積占葉片總面積的50%以上。

病情指數(shù)=Σ（各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值）/（調查總葉片數(shù)×最高級數(shù)值）×100；

防治效果（%）=（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.4 菌株的多相分類鑒定

1.4.1 形態(tài)學觀察及生理生化特征測定。將測定菌株接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，制樣進行光鏡和掃描電鏡下的形態(tài)觀察[8]。生理生化指標的測定方法參考文獻[9-10]。

1.4.2 菌株16S rDNA分析。將測定菌株接種于LB固體培養(yǎng)基，搖床過夜培養(yǎng)，采用試劑盒提取基因組DNA；選用通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR體系及操作方法參考文獻進行。測序結果提交NCBI進行比對，并采用MEGA7的N-J法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2 結果與分析

2.1 根際土壤細菌分離結果

土壤懸浮液涂布NA平板中，37℃培養(yǎng)2～3 d以后，平板上形成特征菌落。挑取菌落進行3次劃線純化，獲得19株細菌活體純培養(yǎng)物，編號為GHZ1～GHZ19。采用15%甘油于-20℃條件下保種備用。

2.2 生防活性菌株評估結果

以黑曲霉為指示菌株，分別對獲得的19株根際土壤細菌的拮抗活性進行測定，對峙試驗結果表明，GHZ05、GHZ09和GHZ12等3株菌對黑曲霉具有顯著的抑制作用，抑菌圈直徑依次為13、11、28 mm，抑菌率依次為 31.36%、40.55%、60.39%（圖1）。

2.3 菌株GHZ12的生防應用效果

盆栽試驗驗證了菌株GHZ12對煙草白粉病的生物防治效果。煙草白粉病病原侵染接種6 d后植株開始發(fā)病，初期表現(xiàn)為葉片正面出現(xiàn)黃褐色褪綠小斑，隨即在斑塊的正反兩面出現(xiàn)毯狀小點，漸次擴大，白粉可覆蓋葉片的大部或全部，嚴重時葉片干枯，后期偶爾可見黑色的顆粒體。由表1可知，GHZ12菌懸液的灌根、葉面噴霧和灌根+葉面噴霧3種不同處理表現(xiàn)出不同的生防效果，灌根+葉面噴霧混合處理在整個發(fā)病期均表現(xiàn)出比葉面噴霧和灌根單一處理要好的生防效果。15 d時，灌根+葉面噴霧混合處理的防治效果達到了56.50%，葉面噴霧防治效果為59.96%，2個處理的防治效果均為單一灌根處理的2倍以上。3種施用方法防治效果相互之間差異達顯著水平。驗證結果證實，GHZ12菌株對煙草白粉病的防治是有效的，在施用方法上，單一葉面噴霧和灌根+葉面噴霧均取得了較好的生防效果；灌根效果較差，不宜單獨使用。

表1 菌株GHZ12對煙草白粉病的防治效果

2.4 菌株GHZ12的分類鑒定結果

菌株GHZ12的形態(tài)特征（圖2）：菌落呈土黃色，不透明，邊緣具有齒狀突出，菌落整體隆起明顯，表面半濕潤。革蘭氏染色陰性，菌體桿形，多單生，兩端鈍圓，具有端鞭毛，長 1.3～2.2 μm，直徑 0.5～0.9 μm。

菌株GHZ12的生理生化指標測定結果呈陽性反應的項目包括明膠水解試驗、V-P試驗、檸檬酸鹽利用試驗、接觸酶試驗、脲酶水解試驗和吲哚試驗；陰性反應項目包括淀粉水解、甲基紅試驗、糖類（葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖）發(fā)酵試驗。

菌株GHZ12的16S rDNA基因擴增產物測序結果為1 496 bp，序列在GenBank比對獲得同源性較高的序列，并構建進化樹（圖3）。結果表明，菌株GHZ12與Pseudomonas sp.S35（KT890311.1）聚在同一分支。結合菌株LZ-7的形態(tài)、生理生化和分子鑒定結果，將其鑒定為假單胞菌屬菌株，暫命名為Pseudomonas sp.GHZ12。

3 討論

煙草是我國重要的經濟作物，在栽培過程中病害嚴重，通過尋找生防菌能夠實現(xiàn)煙草病害的綠色防控，這也是煙草行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的技術需求[12]。本研究從煙草根際土壤中共分離出3株拮抗菌株，試驗以黑曲霉為指示菌株，3株具有拮抗活性的菌株GHZ05、GHZ09和GHZ12可初步定性為對真菌病原具有抑制作用的生防菌，具有后期深度開發(fā)的價值。

盆栽試驗證實，GHZ12對煙草白粉病具有較好的生防效果，從第5天發(fā)病開始到第15天的發(fā)病周期中，GHZ12的生防效果在各處理中均持續(xù)提高，這說明GHZ12發(fā)揮出了對煙草白粉病病原持續(xù)性的抑制作用，符合生防菌發(fā)揮作用的規(guī)律和生物學特點，可作為開發(fā)煙草白粉病生物防治的資源菌株。