微滴式數(shù)字PCR 定量檢測歐洲甜櫻桃中摻假蘋果成分的研究

陳 佳，秦 麗 ，劉 浩，楊 帛，張凱江，趙冬梅，郭金穎，張媛媛,

（1.石家莊學院化工學院，河北石家莊 050035；2.河北省知識產(chǎn)權(quán)保護中心，河北石家莊 050000；3.秦皇島市食品藥品檢驗中心，河北秦皇島 066001）

櫻桃為薔薇科李屬櫻桃亞屬（L.）植物，起源于里海和黑海，又名鶯桃、荊桃、楔桃、英桃、牛桃、櫻珠，是世界溫帶地區(qū)的一種重要水果。歐洲甜櫻桃汁具有獨特的酸味、富含花青素和花色苷等黃酮類物質(zhì)，具有清除自由基的作用。美國路易斯安娜州立大學農(nóng)業(yè)中心的研究表明，歐洲甜櫻桃果汁在改善睡眠時間和睡眠質(zhì)量方面有顯著效果。據(jù)不完全統(tǒng)計，國際上基于不同程度的摻假現(xiàn)象占50%～80%左右，為牟取利益，商家往往在高附加值水果果汁中進行摻假，且水果制品中摻假現(xiàn)象也屢見不鮮。利用顏色、味道等因素在歐洲甜櫻桃果汁中添加低價果汁，有的甚至會添加廉價糖和有機酸等。易敏體質(zhì)人群可能會因食用未標識植物源性添加物后引起過敏反應(yīng)，嚴重的還會發(fā)生中毒反應(yīng)。如用葡萄柚汁代替橙汁可能會導(dǎo)致嚴重的藥理相互作用。以上種種摻假現(xiàn)象嚴重破壞了市場的運行機制。

針對市場中常見的以低價替代品摻入高價值食品中的現(xiàn)象，國內(nèi)外學者對此進行了大量的研究，確定多種鑒別手段，如感官鑒定法、理化法以及分子生物學方法等。馬澤亮等設(shè)計了一套基于電子鼻和電子舌的新型智能感官檢測系統(tǒng)，并將其應(yīng)用于果汁純度鑒定中，實現(xiàn)了對橙汁純度的定量檢測。ZHANG等根據(jù)不同果汁中黃酮類、花色苷類等特征性物質(zhì)的差別利用代謝組學方法可實現(xiàn)對藍莓汁、蔓越莓汁及摻加蘋果汁、葡萄汁的偽品鑒別。WANG等通過使用氣相色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)集，在主成分分析評分圖中成功地將100%檸檬汁樣品與含有30%檸檬汁的摻假樣品區(qū)分開來。CHEN 等利用ddPCR定量檢測出添加在牛肉制品中的鴨肉成分，檢出限為10%。苗麗等利用ddPCR 技術(shù)建立了羊肉質(zhì)量和拷貝數(shù)的關(guān)系，檢出限為10%。楊碩等應(yīng)用多重數(shù)字PCR 技術(shù)定量鑒定出了核桃露中的核桃、大豆成分?，F(xiàn)代分子生物學以其高特異性等優(yōu)勢在摻假鑒別中應(yīng)用廣泛，主要技術(shù)有聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、實時熒光PCR（real-time PCR，RT-PCR）技術(shù)、數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)等。微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)是一種新型的可以絕對定量核酸的新型技術(shù)手段，數(shù)字PCR 是將含有核酸模板的PCR 反應(yīng)體系分配到很多反應(yīng)單元中進行核酸擴增，反應(yīng)結(jié)束后收集每個反應(yīng)單元的熒光信號，分析后得出樣品中核酸濃度的一種技術(shù)。此技術(shù)直接檢測樣品中核酸的原始濃度，不依賴標準曲線和標準品，與傳統(tǒng)熒光定量PCR 相比，數(shù)字PCR 的靈敏度和精確度更高。

本文采用微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)針對歐洲甜櫻桃源性成分設(shè)計特異性引物，建立了歐洲甜櫻桃制品的數(shù)字PCR 定量檢測方法進行摻假檢測，克服了馬澤亮等依賴于一定的人為主觀因素，不能實現(xiàn)樣本的絕對定量及ZHANG 等、WANG 等、CHEN 等、苗麗等摻假檢測檢出限較高的弊端。實現(xiàn)了絕對定量和5%的檢出限。并根據(jù)市場上歐洲甜櫻桃果汁及其制品的分類、添加物進行綜合分析選取添加蘋果汁建立摻假模型并驗證方法的準確性，為歐洲甜櫻桃果汁以及高附加值漿果的摻假鑒定和質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

歐洲甜櫻桃、蘋果原料及歐洲甜櫻桃果汁及制品 購自石家莊市大型超市、農(nóng)貿(mào)市場和網(wǎng)絡(luò)平臺；深加工食品DNA 提取試劑盒（非離心柱型）、天根商品化試劑盒、三氯甲烷 北京酷來博科技有限公司；ddPCR 實驗耗材 美國Bio-Rad 公司。

AdVantage Pro 真空冷凍干燥機 美國VirTis公司；A11BS25 分析研磨機 德國IKA 公司；Sigma 3K15 冷凍離心機 德國Sigma 公司；NanoDrop 2000微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo 公司；C1000 Touch Thermal Cycler PCR 擴增儀、DG8 cartridge 微滴生成卡、Holder 微滴發(fā)生器 美國Bio-Rad 公司；BCD 235STCY 冰箱 青島海爾股份有限公司；SHAB 水浴恒溫振蕩器 常州潤華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 購自超市、農(nóng)貿(mào)市場的實驗所用鮮果均用果實部分，鮮果先進行去皮去核處理，后進行真空冷凍干燥處理，將干燥后的漿果實驗樣品在分析研磨機中進行組織研磨處理，漿果實驗樣本分開處理，避免交叉污染，確保實驗樣本的準確性，市售樣本的處理方式按相同方法進行處理。

1.2.2 基因組DNA 的提取 基因組DNA 的提取采用深加工食品DNA 提取試劑盒的改良版。a.歐洲甜櫻桃與蘋果各稱取5、10、20、30、40、50 mg，向其中加入500 μL GMO緩沖液（Buffer GMO）與40 μL（20 mg/mL）蛋白酶K（Proteinase K），渦旋混勻1 min。60 ℃孵育2 h。孵育過程中始終保持振蕩（1500 r/min）。b.加入GMO緩沖液（Buffer GMO）200 μL，三氯甲烷400 μL，混勻后靜置10 min。c.12000 r/min離心5 min（4 ℃），轉(zhuǎn)移上清。d.加入0.7 倍上清液體積的異丙醇，混勻，12000 r/min 離心5 min（4 ℃），留沉淀。e.加入700 μL 70%乙醇，渦旋振蕩5 s，在離心機上以12000 r/min 離心2 min，去除上清液。重復(fù)此步驟一次。f.開蓋，徹底晾干殘留乙醇。g.加入50 μL TE 緩沖液，混勻，測定DNA 含量和純度。

1.2.3 引物設(shè)計 本實驗所用引物均通過NCB 數(shù)據(jù)庫（National Center of Biotechnology Information，美國國立生物技術(shù)信息中心）尋找到其各個物種的特異性基因序列，根據(jù)歐洲甜櫻桃、蘋果漿果源性的多個靶基因序列設(shè)計了多對引物，具體引物及篩選結(jié)果見表1。引物設(shè)計由軟件DNAman 和Primer5.0 得到，所設(shè)計的探針5′端和3′端分別采用FAM 熒光基團和TAMRA 淬滅基團進行修飾。

表1 漿果實驗所需引物和探針Table 1 Primers and probes required for berry experiments

1.2.4 微滴式數(shù)字PCR 反應(yīng) 反應(yīng)條件：數(shù)字PCR反應(yīng)條件包括2×ddPCR Super Mix 為10 μL、上游引物的用量為1.2 μL（10 μmol/L）、下游引物的用量為1.2 μL（10 μmol/L）、探針的用量為0.4 μL（10 μmol/L）、DNA 模板為4.0 μL、ddHO 3.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性，10 min；94 ℃變性，1 min；56 ℃退火，45 s；進行40 個循環(huán)，98 ℃，10 min；4 ℃保存。

操作步驟：a.先將所需實驗?zāi)０灏匆欢ㄌ荻冗M行稀釋，制成實驗樣品轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生卡中，同時加入微滴發(fā)生油70 μL，放入微滴發(fā)生器中，進行微滴化處理。b.將制備好的微滴轉(zhuǎn)移到96 孔板中，應(yīng)用封膜儀進行封膜處理。c.將封好膜的96 孔板，放到PCR 擴增儀中擴增。d.擴增結(jié)束后將96 孔板放到QX200 Droplet Reader 中，根據(jù)實際實驗排版進行信息錄入，讀取實驗結(jié)果，根據(jù)微滴發(fā)出的熒光信號的強度判定陽性和陰性結(jié)果，并記錄下每個樣品的陽性和陰性的微滴數(shù)。信號采集完畢后，軟件Quantasoft將計算出最終結(jié)果并以圖像形式給出。

1.2.5 特異性檢測 實驗所需物種均設(shè)計多對引物，經(jīng)篩選得到最優(yōu)引物。在特異性檢測實驗中，歐洲甜櫻桃和蘋果分別作為目標物種，杏、蘋果、桃、梨、歐洲甜櫻桃、葡萄、樹莓、小櫻桃、蔓越莓、黑加侖作為非目標物種，無菌雙蒸水作為空白對照。

1.2.6 質(zhì)量與拷貝數(shù)關(guān)系曲線的建立

1.2.6.1 歐洲甜櫻桃及蘋果兩種漿果質(zhì)量與提取DNA濃度的關(guān)系 歐洲甜櫻桃和蘋果實驗樣本各稱5、10、20、30、40、50 mg，進行基因組DNA 的提取，每個質(zhì)量重復(fù)3 次，減少實驗誤差，經(jīng)Nanodrop 2000測定DNA 的含量，從而建立質(zhì)量和其DNA 濃度之間的關(guān)系。

1.2.6.2 歐洲甜櫻桃和蘋果DNA 濃度與數(shù)字PCR的拷貝數(shù)關(guān)系的建立 將提取得到的歐洲甜櫻桃基因組DNA 進行系列稀釋，稀釋梯度為5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，蘋果基因組DNA 進行系列稀釋，稀釋梯度為5、10、20、40、60 ng/μL，每個梯度設(shè)置3 個重復(fù)，為得到準確的拷貝數(shù)，需對其稀釋的精確性有較高要求，以無菌雙蒸水作為對照，得到不同稀釋梯度下的拷貝數(shù)，從而建立DNA 濃度和其拷貝數(shù)之間的關(guān)系。

1.2.7 摻假模型的建立 在歐洲甜櫻桃摻假模型的建立中，歐洲甜櫻桃為主要被摻假對象，蘋果為摻假對象，摻假模型以50 mg 為最大摻假質(zhì)量進行設(shè)計，歐洲甜櫻桃與蘋果摻假比例為1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1。之后將摻假的試驗樣本進行DNA 提取，并將提取好的基因組DNA 進行10 倍稀釋，取4 μL 進行微滴式數(shù)字PCR 檢測，所得結(jié)果通過公式推算出實際值和測量值的差異，進而衡量所建立公式的準確性。

1.2.8 市售樣本分析 本文選自市場上常見歐洲甜櫻桃果汁及制品進行摻假實驗驗證，實驗前處理、基因組提取、稀釋等方法均與上文樣本保持一致。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，利用Excel 進行圖表編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測

基于ddPCR 技術(shù)，選擇常見不同漿果物種作為DNA 模板對本研究選用的引物進行特異性檢測分析。結(jié)果顯示本文選用的歐洲甜櫻桃、蘋果的引物和探針與杏、桃、梨、葡萄、樹莓、小櫻桃、蔓越莓、黑加侖不存在交叉反應(yīng)，特異性良好（如圖1～圖2），可用于實驗的測定。

圖1 歐洲甜櫻桃引物特異性篩選Fig.1 Screening of cherry specific primers

圖2 蘋果引物特異性篩選Fig.2 Screening of apple specific primers

2.2 質(zhì)量和DNA 提取含量的關(guān)系曲線

分別稱取歐洲甜櫻桃和蘋果的6 個質(zhì)量梯度（5、10、20、30、40、50 mg），每個質(zhì)量梯度設(shè)置三個重復(fù)，應(yīng)用Nanodrop2000 對其提取的基因組DNA進行測定，得到質(zhì)量和DNA 含量的線性擬合曲線。結(jié)果顯示歐洲甜櫻桃和蘋果在其質(zhì)量范圍內(nèi)與提取的基因組DNA 含量線性關(guān)系良好。如圖3～圖4 所示，歐洲甜櫻桃和蘋果的決定系數(shù)分別為0.9972、0.9977，由以上歐洲甜櫻桃和蘋果的相關(guān)性系數(shù)可知均在0.99 以上，說明數(shù)據(jù)具有一定的準確性，質(zhì)量和DNA 濃度擬合曲線線性良好。

圖3 歐洲甜櫻桃質(zhì)量和DNA 濃度的關(guān)系Fig.3 Relationship between mass and DNA concentration of cherry

圖4 蘋果質(zhì)量和DNA 濃度的關(guān)系Fig.4 Relationship between mass and DNA concentration of apple

2.3 DNA 含量和拷貝數(shù)的關(guān)系曲線

將提取的歐洲甜櫻桃基因組DNA 分別梯度稀釋為5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，蘋果的DNA梯度稀釋為5、10、20、40、60 ng/μL，取4 μL 進行數(shù)字PCR 檢測，進行三次重復(fù)，ddPCR 檢測結(jié)果見圖5。取其DNA 拷貝數(shù)均值進行線性擬合分析，歐洲甜櫻桃和蘋果DNA 拷貝數(shù)均隨DNA 含量的增加而增加，兩者呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系（如圖6～圖7），歐洲甜櫻桃和蘋果的線性決定系數(shù)分別為0.9991、0.9946。

圖5 梯度DNA 含量條件下歐洲甜櫻桃（a）、蘋果（b）的拷貝數(shù)圖譜Fig.5 Copies number map of cherry (a) and apple (b) under gradient DNA content conditions

圖6 歐洲甜櫻桃DNA 濃度和DNA 拷貝數(shù)之間的關(guān)系Fig.6 Linear relationship between DNA copy number and nucleic acid concentration of cherry

圖7 蘋果DNA 濃度和DNA 拷貝數(shù)之間的關(guān)系Fig.7 Linear relationship between DNA copy number and nucleic acid concentration of apple

2.4 質(zhì)量與拷貝數(shù)公式的建立

根據(jù)歐洲甜櫻桃模板樣品質(zhì)量和DNA 含量得到一條線性曲線為y=14.455x+27.584，2=0.9972，其中，x 為歐洲甜櫻桃的質(zhì)量M（mg），y 為歐洲甜櫻桃DNA 濃度（ng/μL）。由DNA 含量與拷貝數(shù)得到另一條線性曲線即y=8.3063x+23.218，2=0.9991，其中，x 為歐洲甜櫻桃DNA 濃度（ng/μL），y 為歐洲甜櫻桃DNA 拷貝數(shù)（copies/μL），其中再以DNA 含量為中間值進行換算時，DNA 濃度先經(jīng)過了10 倍稀釋，再取4 μL 進行計算，由此得到質(zhì)量及DNA 拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，以DNA 含量為中間值換算得到歐洲甜櫻桃質(zhì)量與DNA 拷貝數(shù)之間的計算公式，歐洲甜櫻桃：M=0.0833C-3.8420。同理，蘋果：M=0.4084C-1.5747，其中，M 代表植物源性成分的質(zhì)量（mg），C 代表每微升的拷貝數(shù)（copies/μL）。

2.5 摻假模型的數(shù)字PCR 檢測

在歐洲甜櫻桃的摻假模型中，共設(shè)置9 個摻假比例，分別為1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1。稱取已知混合比例的摻假模型并提取基因組DNA。為驗證本方法的適用性和準確性盡可能模擬市售樣品中存在的摻假情況。取4 μL 稀釋10 倍的基因組DNA 進行檢測，進行三次重復(fù)，并將測得的拷貝數(shù)均值代入公式中得到目標物種的質(zhì)量。結(jié)果如表2～表3 顯示，歐洲甜櫻桃與蘋果的摻假模型中相對誤差最大為-19.17%，所得結(jié)果均在統(tǒng)計學25%許可范圍內(nèi)。通過分析實驗數(shù)據(jù)可知，本研究所建立的歐洲甜櫻桃、蘋果ddPCR 定量方法可有效應(yīng)用于市售制品的檢測。

表2 已知比例歐洲甜櫻桃與蘋果摻假模型櫻桃分析結(jié)果Table 2 Analysis results of cherries with known proportion of cherries and apple adulteration model

表3 已知比例歐洲甜櫻桃與蘋果摻假模型蘋果分析結(jié)果Table 3 Analysis results of apple with known proportion of cherries and apple adulteration model

2.6 市售樣本分析

通過對市場上市售漿果樣本檢測結(jié)果（見表4）分析可知：歐洲甜櫻桃市售樣本存在摻假情況，其中，樣品Y-1 中測得歐洲甜櫻桃含量為0，蘋果源性15.37%，樣品Y-2 中測得歐洲甜櫻桃含量為0，蘋果源性0，樣品Y-3 中測得歐洲甜櫻桃含量為0，蘋果源性3.17%，樣品Y-4 中測得歐洲甜櫻桃含量為0，蘋果源性4.15%。通過對市售樣本的檢驗，說明標稱含有歐洲甜櫻桃成分的果汁中存在摻假現(xiàn)象，應(yīng)進一步開展相關(guān)檢測工作以保障食品安全，同時，也驗證了本實驗所建立的定量檢測摻假方法具有一定的實用性和適用性。

表4 市售樣品分析結(jié)果Table 4 Commercial sample analysis results

3 結(jié)論

本文采用微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)對漿果中歐洲甜櫻桃品種進行摻假定量檢測，通過歐洲甜櫻桃和蘋果兩種漿果的質(zhì)量及其DNA 含量，DNA 含量及其擴增DNA 拷貝數(shù)之間的線性擬合關(guān)系，得到歐洲甜櫻桃和蘋果兩種漿果的質(zhì)量和擴增DNA 拷貝數(shù)的計算公式：M=0.0833C-3.8420、M=0.4084C-1.5747，從而可以快速鑒別歐洲甜櫻桃的摻假情況。

為進一步驗證方法的準確性，構(gòu)建歐洲甜櫻桃摻假模型，計算歐洲甜櫻桃的實際摻入量，經(jīng)擴增得到的實驗值和實際加入的摻假質(zhì)量相差不大，最大相對誤差為-19.17%，都在誤差范圍內(nèi)，上文所述歐洲甜櫻桃數(shù)據(jù)變異系數(shù)小，說明數(shù)據(jù)具有一定的可靠性。

綜上所述，微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)能夠準確地進行歐洲甜櫻桃的定量檢測，這為市場上果汁中歐洲甜櫻桃摻假的定量問題提供了一種技術(shù)手段，同時本研究也為除歐洲甜櫻桃、蘋果這兩種漿果之外的其它漿果的定量檢測提供了一種檢測方向，健全了定量檢測體系。