表皮生長(zhǎng)因子受體靶向藥物在肝細(xì)胞癌中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

賈谷和，邵佳康，趙 曉，鄭宏燁，秦博宇，李 珂，孫小惠，周宇欣，張 正，焦順昌

1 南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；3 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853

在全球范圍內(nèi)，原發(fā)性肝癌(primary hepatic cancer，PHC)的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中居第6位，死亡率居第2位。在死亡率排名前5的癌癥中，PHC是唯一一種發(fā)病率和死亡率都呈上升趨勢(shì)的癌種，其全球年發(fā)病率約9.3/100 000，相應(yīng)的死亡率約8.5/100 000[1]。在中國(guó)，約90%的PHC為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，其發(fā)病率在所有腫瘤中居第5，死亡率居第2，患者5年生存率僅12.1%[2]。不僅如此，50%的HCC患者在初次診斷時(shí)即為晚期，而全身系統(tǒng)治療是此類(lèi)患者的唯一選擇[3]。目前，對(duì)于早期HCC患者，手術(shù)切除、射頻消融和肝移植是HCC有效的治療方法，但即使進(jìn)行根治性切除，60% ~ 70%的患者在5年內(nèi)仍有較高復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[4]。近年來(lái)，美國(guó)食品和藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)多激酶抑制劑索拉非尼和侖伐替尼為晚期HCC的一線療法[5]，該類(lèi)靶向藥物除縮瘤率較低外，還具有較強(qiáng)的不良反應(yīng)，包括疲勞、體質(zhì)量減輕、腹瀉和皮疹等，這限制了其在部分患者中的應(yīng)用[6]。然而，HCC的主要突變靶點(diǎn)如TP53、CTNNB1 和 TERT啟動(dòng)子等缺乏成藥性，無(wú)法作為有效的藥物治療靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，40% ~ 70%的HCC患者表現(xiàn)出表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)過(guò)表達(dá)和EGFR基因拷貝數(shù)擴(kuò)增現(xiàn)象[7]，且市面上已經(jīng)有成熟的EGFR靶向藥物，并在其他高表達(dá)EGFR的癌種中有較好的療效[8]。EGFR靶向藥物主要有以西妥昔單抗(cetuximab)為代表的單克隆抗體和以阿法替尼(afatinib)為代表的酪氨酸激酶抑制劑，這些藥物在臨床上可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，對(duì)部分晚期HCC患者產(chǎn)生積極效果。因此，探究EGFR靶向藥物在HCC中的作用機(jī)制，也許可為HCC的臨床治療提供理論支撐。

1 EGFR的分子結(jié)構(gòu)

ERBB受體酪氨酸激酶家族(receptor tyrosine kinase，RTK)由EGFR(也稱(chēng)為ERBB1、HER1)、HER2(ERBB2、HER2)、HER3(ERBB3)和HER4(ERBB4)組成，EGFR由1 186個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量約為170 kU，主要位于細(xì)胞膜表面，在該家族中最具代表性[9]。EGFR胞外配體結(jié)構(gòu)域由高度糖基化的622個(gè)氨基酸組成，包含兩個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域，負(fù)責(zé)與配體結(jié)合向下傳遞信號(hào)；跨膜結(jié)構(gòu)域是包括23個(gè)殘基的α-螺旋結(jié)構(gòu)；胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含一由250個(gè)氨基酸組成的保守蛋白酪氨酸激酶核心，以及一個(gè)由229個(gè)氨基酸構(gòu)成的帶有調(diào)節(jié)性酪氨酸殘基的C-末端調(diào)節(jié)域[10]。當(dāng)配體如表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)或腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)等與受體結(jié)合后，EGFR激酶結(jié)構(gòu)域改變并形成同源或異二聚體。SHC(shell script compiler)被EGFR二聚體磷酸化后，能夠與Sos(son of sevenless)和生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2，Grb2)結(jié)合，形成大型信號(hào)復(fù)合物，與下游Ras、PI3K、PLC、JAK等信號(hào)蛋白相互作用。隨后激活各種信號(hào)通路，并最終刺激HCC細(xì)胞增殖[11]。

2 EGFR在HCC細(xì)胞中的下游通路

EGFR在HCC細(xì)胞主要有以下通路：1) EGFR激活Ras/MEK/ERK通路；2) EGFR激活JAK/STAT通路；3) EGFR激活PI3K/AKT/mTOR通路；4)其他通路。EGFR通過(guò)以上通路影響HCC細(xì)胞的增殖。如圖1。

圖1 EGFR在HCC細(xì)胞中的作用機(jī)制Fig.1 The Mechanism of EGFR in HCC

2.1EGFR激 活Ras/MEK/ERK通 路 以 及 阿 法 替尼和吉非替尼在該通路的機(jī)制 活化的EGFR磷酸化激活Ras，介導(dǎo)Raf激活。Raf磷酸化并激活MEK，從而激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)?；?化 的ERK使RSK磷酸化，RSK在細(xì)胞核中刺激轉(zhuǎn)錄因子Elk-1等表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[12]。

Yang和Liu[13]發(fā)現(xiàn)在HCC細(xì)胞組織中，ERK的表達(dá)水平在腫瘤組織中明顯高于正常肝組織，與腫瘤大小呈正相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中磷酸化的ERK(即p-ERK)異常升高，53%的HCC組織中p-ERK的表達(dá)高于癌旁組織。Chen等[14]通過(guò)對(duì)HCC細(xì)胞Huh-7的研究，發(fā)現(xiàn)阿法替尼(Afatinib)可以通過(guò)抑制EGFR的磷酸化，降低ERK信號(hào)通路磷酸化的水平，同時(shí)可以抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)這 一 過(guò)程，降低MMPS的表達(dá)水平。而研究表明MMPS能夠切割位于細(xì)胞膜上的EGFR配體，如EGF等，刺激配體脫落到細(xì)胞外空間，重新與細(xì)胞膜上其他EGFR分子結(jié)合，刺激受體的二聚化和激活，從而導(dǎo)致信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活[15]。Jin等[16]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)吉非替尼聯(lián)合侖伐替尼對(duì)表達(dá)EGFR的HCC細(xì)胞株有強(qiáng)大的抗增殖作用。侖伐替尼在發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用時(shí)，反饋激活EGFR導(dǎo)致其下游信號(hào)通路PAK/MEK1/2/ERK1/2激活，促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖，限制了藥物反應(yīng)，但聯(lián)合用藥可以使該通路因EGFR被抑制而阻斷，提高該藥物對(duì)腫瘤的治療效果。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，腫瘤細(xì)胞中可以觀察到NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞進(jìn)一步浸潤(rùn)，這種免疫重塑為進(jìn)一步提高聯(lián)合治療的效果提供了可能性。

從上述研究不難看出，抑制EGFR可以降低Ras/MEK/ERK通路下游因子的磷酸化水平，抑制細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，抑制HCC細(xì)胞的增殖。同時(shí)通過(guò)降低MMPS表達(dá)水平和抑制EMT轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步抑制EGFR的作用和HCC細(xì)胞的侵襲遷移能力，從而抑制HCC細(xì)胞的增殖。不僅如此，EGFR抑制劑與其他藥物的聯(lián)用也可以進(jìn)一步阻止其因激活旁路產(chǎn)生的耐藥問(wèn)題，進(jìn)一步提高藥物對(duì)HCC細(xì)胞的治療效果。

2.2EGFR激活JAK/STAT通路及西妥昔單抗和厄洛替尼在該通路的機(jī)制 活化的EGFR通過(guò)磷酸化JAK最大程度激活信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1/3(signal transducers and activators of transcription 1/3，STAT1/3)，或者結(jié)合并磷酸化STAT直接激活STAT1后再激活STAT3，磷酸化STAT1/3形成p-STAT1/3，隨后STATs發(fā)生二聚化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在核內(nèi)激活CCND1和BIRC5等基因的轉(zhuǎn)錄，改變細(xì)胞周期進(jìn)程，參與HCC細(xì)胞的增殖、分化和存活[17]。

Xue等[18]研究發(fā)現(xiàn)西妥昔單抗降低HCC細(xì)胞中EGFR的表達(dá)和STAT3的磷酸化水平，但對(duì)抑制HCC細(xì)胞增殖的作用有限。然而STAT抑制劑僅增加了上皮表型HCC細(xì)胞(Huh7、Hep3B和HepG2)對(duì)藥物的敏感度，對(duì)具有間充質(zhì)表型的HCC細(xì)胞(SNU449和SNU387)沒(méi)有影響，因此西妥昔單抗聯(lián)合STAT抑制劑時(shí)，可以增強(qiáng)對(duì)上皮型HCC細(xì)胞的殺傷作用。Zhang等[19]在高表達(dá)EGFR的HCC細(xì)胞HepG2的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用厄洛替尼聯(lián)合EGFR激動(dòng)劑時(shí)，較單用厄洛替尼，EGFR被進(jìn)一步激活，p-STAT增多，通過(guò)JAK-STAT通路被進(jìn)一步激活。當(dāng)時(shí)聯(lián)用EGFR抑制劑時(shí)，p-STAT減少，同時(shí)使HCC細(xì)胞增殖受到抑制。

在關(guān)于西妥昔單抗的研究中不難發(fā)現(xiàn)，其單獨(dú)使用在臨床試驗(yàn)中只有輕微的效果，耐藥性可能是一個(gè)重要原因。西妥昔單抗可以與STAT抑制劑聯(lián)用，增強(qiáng)對(duì)上皮型HCC細(xì)胞的殺傷作用，但對(duì)間充質(zhì)表型細(xì)胞作用有限。因此，厄洛替尼聯(lián)合其他藥物可以增強(qiáng)對(duì)HCC細(xì)胞的抑制作用，聯(lián)合其他藥物提高西妥昔單抗在HCC治療中的敏感度可能獲得理想的療效。

2.3EGFR激 活PI3K/AKT/mTOR通 路 及 尼 妥 珠單抗和厄洛替尼在該通路的機(jī)制 活化的EGFR可以通過(guò)直接活化Ras間接激活PI3K，PI3K通過(guò)磷酸化PIP2催化PIP3的產(chǎn)生。PIP3可以通過(guò)磷酸化PDK1后激活蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)，最后激活mTOR，增加蛋白質(zhì)翻譯，從而保護(hù)細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡[20]。

Wang等[21]比較了敏感組(PLC/PRF/5和Hep 3B2.1-7)和耐藥組(LI-7、SK-Hep-1、SNU-182和SNU-387)細(xì)胞系之間的RNA-seq差異發(fā)現(xiàn)，針對(duì)尼妥珠單抗耐藥和敏感兩組腫瘤細(xì)胞的基因在EGFR通路中表達(dá)無(wú)明顯差異，似乎與Hoshida亞類(lèi)(S1、S2和S3)有關(guān)。3個(gè)ECM基因(COL1A1、COL1A2、COL3A1)和MMP9是與耐藥性相關(guān)的聚集區(qū)。敏感組細(xì)胞株均高表達(dá)S2和S3基因，其與HCC細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和AKT活化相關(guān)。耐藥株S1基因高表達(dá)，S1反映WNT信號(hào)通路的異常激活，該通路與EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)。Park等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)，ECM基因可以在外界刺激下觸發(fā)EMT過(guò)程，因此ECM基因是啟動(dòng)EMT的關(guān)鍵基因。Xu等[23]發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制HepG2細(xì)胞中EGFR的活化，抑制了AKT的磷酸化，可以下調(diào)MMPS的表達(dá)，抑制EMT，降低其遷移和侵襲能力。Wang等[24]研究了彈力素和EGFR抑制劑在HCC進(jìn)展中的作用，發(fā)現(xiàn)彈力素通過(guò)磷酸化AKT獨(dú)立地促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移。因此可以將抗彈力素和厄洛替尼組成的聯(lián)合療法應(yīng)用于HCC的治療。Li等[25]研究發(fā)現(xiàn)藥物誘導(dǎo)自噬可能在腫瘤細(xì)胞的自我保護(hù)反應(yīng)中發(fā)揮作用，厄洛替尼的作用可能會(huì)增強(qiáng)這一反應(yīng)，使得其對(duì)HCC細(xì)胞的殺傷力減低。P57作為一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(cyclindependent protein kinases，CDK)抑制劑，在上皮表型HCC細(xì)胞(MHCC97L、Hep3B和HepG2)中可通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，使其磷酸化水平增高，抑制厄洛替尼誘導(dǎo)的自噬，從而提高治療效率。

我們可以發(fā)現(xiàn)，EGFR抑制劑單藥對(duì)于抑制HCC細(xì)胞的作用不強(qiáng)。在針對(duì)其敏感株和耐藥株的對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，HCC細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑的耐藥性可能與AKT激活、MMP的表達(dá)及EMT轉(zhuǎn)化有關(guān)，而且與其他藥物聯(lián)用可以增加EGFR抑制劑的作用，如抑制HCC細(xì)胞的自噬，均可通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，提高藥物的治療效果。

2.4其他通路及吉非替尼在該通路的作用機(jī)制活化EGFR激活PLC-γ1催化PtdIns-4,5-P2，產(chǎn)生IP3和DAG，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、分化、受體內(nèi)吞、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和癌細(xì)胞侵襲[15]。在EGFR抑制劑作用于HCC細(xì)胞的機(jī)制研究中，對(duì)這一通路的研究較少，可能是藥物對(duì)這一通路的影響較小。

EGFR與其配體結(jié)合后可以入核，與PARP相互作用并且誘導(dǎo)PARP磷酸化，同7細(xì)胞增殖等有關(guān)[15]。Dong等[26]在上皮表型且高表達(dá)EGFR和HGF的(Ton/HCC、SK-Hep1和Hep3B)HCC細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，HGF保持定位于細(xì)胞核中，EGFR受到刺激信號(hào)后易位至細(xì)胞核中，與HGF可以形成異二聚體，與PARP相互作用并且誘導(dǎo)PARP磷酸化，影響HCC細(xì)胞的增殖。因此，吉非替尼聯(lián)合抑制HGF及PARP可能對(duì)HCC細(xì)胞有更強(qiáng)的殺傷作用。對(duì)于腫瘤同時(shí)表達(dá)EGFR和HGF的HCC患者，可能需要 3 種藥物的組合，以實(shí)現(xiàn)對(duì)高表達(dá)EGFR和HGF患者較好的治療效果。

3 EGFR在HCC細(xì)胞中的耐藥機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，HCC對(duì)于EGFR靶向藥物的主要耐藥機(jī)制有以下三點(diǎn)。1)EGFR的突變：多見(jiàn)于19外顯子的缺失、20外顯子插入突變和21外顯子L858R突變，這些突變可以通過(guò)更換有效的EGFR-TKI藥物取得較好的療效，但對(duì)于HCC，這方面的研究還有所欠缺。2)多旁路通道激活：Ribback等[27]在小鼠的模型研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼使HCC細(xì)胞癌前病變的數(shù)量和增殖活性都減少，抑制EGFR可減少癌前病變向HCC的進(jìn)展，但對(duì)HCC的增長(zhǎng)抑制作用有限。這表明EGFR信號(hào)通路在HCC發(fā)生的后期階段只有部分相關(guān)性，已知有多條致癌途徑被激活，應(yīng)考慮與傳統(tǒng)的細(xì)胞抑制藥物或其他靶向藥物聯(lián)合治療。3)表型轉(zhuǎn)化：在其他癌腫中，EMT轉(zhuǎn)化是一種重要耐藥機(jī)制[28]，在HCC中結(jié)合上述研究，EGFR、ERK、MMPS三者之間可能存在環(huán)形通路，該通路可能與HGF的轉(zhuǎn)化相關(guān)。EGFR抑制劑可能影響HGF轉(zhuǎn)化，使HCC細(xì)胞由上皮表型轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型，改變細(xì)胞黏附性，刺激細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲，產(chǎn)生耐藥機(jī)制。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

本文對(duì)EGFR靶向藥物治療晚期HCC的作用機(jī)制和耐藥機(jī)制進(jìn)行了全面總結(jié)。總而言之，目前治療HCC的一線靶向藥物有多激酶抑制劑索拉非尼和侖伐替尼，其中索拉非尼的總生存期(overall survival，OS)為12.3個(gè)月，無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)為8.9個(gè)月，侖伐替尼的OS為13.6個(gè)月，PFS為3.7個(gè)月，仍有復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差、不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)[29]。EGFR抑制劑在HCC的臨床應(yīng)用中極具研究潛力。阿法替尼可通過(guò)降低p-ERK抑制EGFR磷酸化的水平，同時(shí)抑制EMT并降低MMP9的表達(dá)水平。西妥昔單抗可以與STAT抑制劑聯(lián)用，但僅對(duì)上皮型HCC細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺傷作用。尼妥珠單抗對(duì)HCC細(xì)胞的抑制作用并非依賴(lài)于EGFR的高表達(dá)，可能與3個(gè)ECM基因(COL1A1、COL1A2、COL3A1)和MMP9相關(guān)，ECM基因可啟動(dòng)EMT，MMPs可以進(jìn)一步激活EGFR通路，同時(shí)HCC細(xì)胞的侵襲性與p-ERK水平呈正相關(guān)，因此尼妥珠單抗的耐藥性和敏感度可能與細(xì)胞的EMT和侵襲遷移能力有關(guān)，該聯(lián)系可能為我們進(jìn)一步的治療提供新的研究方向。厄洛替尼與其他藥物聯(lián)用也可以提高對(duì)HCC的治療效率。吉非替尼與抗血管藥物聯(lián)用或與PARP抑制劑和HGF抑制劑的聯(lián)用都可以對(duì)HCC患者有較好的效果。而在厄洛替尼和索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用的Ⅲ期試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)對(duì)索拉非尼耐藥的患者不會(huì)從厄洛替尼的治療中得到任何臨床獲益[30]，通過(guò)對(duì)其機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)Elafin可以通過(guò)磷酸化AKT獨(dú)立促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移，未進(jìn)行優(yōu)勢(shì)人群的篩選、兩藥聯(lián)合藥物毒性不良反應(yīng)疊加、因毒性不良反應(yīng)導(dǎo)致實(shí)際完成治療周期不足等原因使該III期試驗(yàn)未取得理想效果。盡管未能取得理想療效，但其作為一種潛在的治療選擇不應(yīng)該被放棄，值得進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估和研究。

目前EGFR抑制劑在HCC中作用機(jī)制的研究相對(duì)較少，在臨床應(yīng)用中的療效不甚理想，且目前開(kāi)展的相關(guān)研究?jī)H針對(duì)不可手術(shù)的晚期HCC患者，而缺少對(duì)手術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的用藥研究，因此需要大量全面的臨床試驗(yàn)來(lái)證實(shí)其臨床的指導(dǎo)意義和實(shí)用價(jià)值。繼續(xù)研究EGFR靶向藥物在HCC細(xì)胞中的作用機(jī)制和耐藥機(jī)制，進(jìn)一步探索其在HCC細(xì)胞中是否存在新的通路，或許能夠解釋其在臨床實(shí)驗(yàn)中未能取得較好療效的原因，并且通過(guò)對(duì)作用機(jī)制的深入了解，可以選擇合適的藥物聯(lián)合方案，制定更加安全有效的治療方法指導(dǎo)臨床治療。同時(shí)可以對(duì)人群采用更高特異性和敏感度的預(yù)測(cè)指標(biāo)進(jìn)行檢查和篩選，選擇對(duì)EGFR靶向藥物敏感的優(yōu)勢(shì)人群，提高EGFR抑制劑對(duì)HCC患者的療效，延長(zhǎng)HCC患者的壽命，提高患者的生存質(zhì)量。