尿苷胞苷激酶2調(diào)控肺腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究

許 楊，劉 黎，王李杰，楊旭輝，霍 苗

1 解放軍戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心 呼吸內(nèi)科，北京 100101；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 腫瘤內(nèi)科，北京 100853

肺癌是世界上病死率最高的癌癥之一，肺癌患者診斷時大多處于癌癥晚期，長期生存率非常低，預(yù)后極差[1-3]。肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)是肺癌中占比最大的分型。雖然近年來LUAD診斷和預(yù)后相關(guān)技術(shù)不斷被報道，但其5年生存率仍只有15%左右[4-5]，所以探索新的LUAD早期診斷和預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物十分重要。 尿苷-胞苷激酶(uridine-cytidine kinase，UCK)是嘧啶核苷酸生物合成中的一種重要的限速酶，其中UCK2發(fā)揮的催化活性最強(qiáng)[6]。研究在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了UCK2過度表達(dá)，包括胰腺腫瘤、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌等[7-10]。雖然UCK2在肺癌中的作用已有初步研究，但UCK2在LUAD發(fā)生發(fā)展中的作用及其調(diào)控機(jī)制研究未見報道。本研究旨在探索UCK2在LUAD發(fā)生發(fā)展中的作用及可能調(diào)控機(jī)制，為LUAD的診斷和治療提供新的思路。

材料與方法

1實 驗 材 料 和 分 組 人LUAD細(xì) 胞A549和Calu3、Flag-UCK2質(zhì)粒由解放軍總醫(yī)院腫瘤醫(yī)學(xué)部研究所保存。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自賽默飛世爾公司；Flag-HRP、β-actin、UCK2、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR抗體購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。葡萄糖攝取比色檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒、ATP比色檢測試劑盒購自博愛新開源生物科技有限公司。生長和遷移實驗設(shè)置兩組：對照組(轉(zhuǎn)染Flag)；實驗組(轉(zhuǎn)染Flag-UCK2)。mTOR通路的相關(guān)Western blot驗證及糖攝取、ATP和乳酸測定設(shè)置四組：1)EV + DMSO組；2)UCK2 + DMSO組；3)EV + 雷帕霉素組；4)UCK2 + 雷帕霉素組。

2TCGA數(shù)據(jù)下載及分析 從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中獲取LUAD的相關(guān)數(shù)據(jù)，包括轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。利用Sangerbox中的DECenter插件對LUAD和癌旁組織進(jìn)行差異分析，得到差異基因制作熱圖和火山圖。用RStudio軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Survival包進(jìn)行獨立預(yù)后分析，P＜0.05認(rèn)為基因與LUAD預(yù)后有相關(guān)性。利用Survival ROC包進(jìn)行基因預(yù)測準(zhǔn)確性分析，AUC＞0.7認(rèn)為基因?qū)UAD預(yù)后預(yù)測的準(zhǔn)確性更好。利用http://kmplot.com在線分析UCK2基因在LUAD中的總生存時間(overall survival，OS)和無病生存期(disease-free survival，DFS)，P＜0.05認(rèn)為有意義。UCK2在LUAD的癌和癌旁表達(dá)及各分期表達(dá)利用GraphPad Prism 8分析，P＜0.05認(rèn)為有意義。

3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western blot印跡實驗 A549和Calu3細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。參照Vigofect轉(zhuǎn)染試劑說明書配置轉(zhuǎn)染液。6 h后更換培養(yǎng)基。24 h后每組收取部分細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解后，加SDS，煮樣后行凝膠電泳。分別孵育Flag抗體和β-actin抗體。發(fā)光液壓片顯影。

4CCK-8實驗 分別將待檢測的A549和Calu3細(xì)胞系的對照組和實驗組細(xì)胞分別充分吹勻后，以3000/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，每個實驗分組鋪設(shè)15個孔。參照CCK-8使用說明分別在第0、1、2、3、4天檢測細(xì)胞增殖活力。待測細(xì)胞加入CCK-8混合液1 h充分作用后，上機(jī)測定OD值(波長450 nm)。

5劃痕試驗 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞取出吹勻后鋪于6孔板中，以200 μL槍頭垂直在鋪滿細(xì)胞的培養(yǎng)皿上劃痕，加入PBS緩沖液，去除劃下的細(xì)胞，棄PBS緩沖液，加入無血清培養(yǎng)基。分別于0 h和24 h在顯微鏡下拍照、標(biāo)記和記錄。

6基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA) TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)按照UCK2表達(dá)數(shù)據(jù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，用GSEA分 析 軟 件 對C6:oncogenic signatures基因集進(jìn)行分析，分析的基因集合排列數(shù)為1000個，表型標(biāo)簽為UCK2的表達(dá)水平。P＜0.05和FDR-q＜0.05的基因集被認(rèn)為是顯著富集。

7糖攝取、ATP和乳酸測定 按照葡萄糖攝取比色分析試劑盒說明書，將待測細(xì)胞棄培養(yǎng)基后，加入100 μL的KRPH buffer孵育40 min，添加10 mmol/L的2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)孵育20 min，置于85℃ 40 min，冰上5 min，加入中和液12 μL，離心后取上清，酶標(biāo)儀412 nm檢測OD值。按照ATP比色分析試劑盒說明書，待測細(xì)胞加入100 μL ATP assay buffer，冰 上 裂解10 min，離心。按說明書操作，最后獲得待測終液。酶標(biāo)儀設(shè)定為570 mm檢測OD值并記錄。按照乳酸分析試劑盒說明書，待測細(xì)胞加入50 μL Lactate assay buffer，冰上裂解10 min，按說明書操作，最后獲得待測終液。酶標(biāo)儀設(shè)定為450 nm檢測并記錄。

8統(tǒng) 計 學(xué) 方 法 統(tǒng) 計 分 析 使 用SPSS24.0軟 件。正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用秩和檢驗。UCK2對細(xì)胞增殖和遷移能力的影響分析采用重復(fù)測量方差分析。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，癌旁基因預(yù)測LUAD的能力評估采用ROC曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1UCK2在LUAD組 織 中 的 表 達(dá) 為 了 篩 選 與LUAD生長相關(guān)的基因，將TCGA數(shù)據(jù)庫LUAD樣本的正常組織與腫瘤組織表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析。對19 497個編碼蛋白的基因進(jìn)行分析，其中1 830個上調(diào)基因，2 725個下調(diào)基因(圖1A)。對這些差異基因進(jìn)行單因素獨立預(yù)后分析，篩選了49個與預(yù)后相關(guān)的基因。結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，對這49個基因進(jìn)行多因素分析，其中與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因共10個(表1)。利用受試者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線進(jìn)一步進(jìn)行篩選對LUAD預(yù)后有較好預(yù)測水平的基因，其中AUC值大于0.7的只有UCK2(表2)。

圖1 UCK2促進(jìn)LUAD的發(fā)展，與較差的預(yù)后呈正相關(guān)(bP＜0.01)A：火山圖顯示正常組織與腫瘤組織之間RNA-seq分析的差異調(diào)節(jié)基因表達(dá)。上調(diào)和下調(diào)的基因分別以紅色和綠色顯示。餅圖顯示共有19 497個基因表達(dá)，其中1 830個基因上調(diào)，2 725個基因下調(diào)；B ~ C：乘積極限法(Kaplan-Meier)分析TCGA中LUAD患者的DFS和OS；D：UCK2在正常組織與腫瘤組織之間的表達(dá)差異；E：小提琴圖顯示了UCK2在LUAD 1 ~ 4期表達(dá)水平，并使用單因素方差分析進(jìn)行比較Fig.1 UCK2 was screened out as a promoter in LUAD and positively correlated with poorer prognosis (bP＜0.01)A: The volcano plot illustrating differentially regulated gene expression from RNA-seq analysis between the normal and tumor tissues.Genes upregulated and downregulated are shown in red and green, respectively. Values are presented as the log10 of tag counts. The pie chart revealed a total of 19 497 genes expressed, of which 1 830 genes were upregulated and 2 725 genes were downregulated; B, C:Kaplan–Meier estimates of disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) of LUAD patients from TCGA; D, E: UCK2 expression scores between normal and tumor tissues, stage 1-4 were displayed in violin plot and compared using one-way Anova

表1 LUAD癌與癌旁的差異基因與臨床性狀的關(guān)系(P)Tab. 1 Relationship between DEGs and clinical traits in LUAD (P)

表2 LUAD癌與癌旁差異基因的AUC值Tab. 2 AUC values of DEGs in LUAD

TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD的相關(guān)數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，UCK2的高表達(dá)與不良的DFS(P=0.022)和OS(P＜0.01)相關(guān)(圖1B ~ 圖1C)。UCK2的表達(dá)量在LUAD組織中高于癌旁組織(P＜0.01；圖1D)，且隨著分期的上升，UCK2表達(dá)水平也上調(diào)(P＜0.01；圖1E)。綜上，UCK2可能作為一個正調(diào)控基因參與LUAD的發(fā)生發(fā)展。

2UCK2促進(jìn)A549和Calu3細(xì)胞的生長 Western blot實驗結(jié)果顯示，在A549和Calu3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag和Flag-UCK2，內(nèi)參β-actin表達(dá)水平一致，轉(zhuǎn)染Flag-UCK2的細(xì)胞樣品在29 kU檢測到特異性條帶。CCK-8實驗結(jié)果顯示，與Flag組相比，A549細(xì)胞中Flag-UCK2組從第2天起增殖能力顯著增加(t=3.733、5.856、7.421，P=0.02、0.004、0.002，n=3；圖2A)，Calu3細(xì)胞系中，F(xiàn)lag-UCK2組從第3天起增殖能力顯著增加(t=4.788、9.941，P=0.009、0.001，n=3；圖2B)。

圖2 UCK2促進(jìn)A549(A)和Calu3(B)細(xì)胞的生長能力[aP＜0.05, bP＜0.01, vs Flag (1)組]Fig.2 UCK2 promotes the growth of A549 (A) and Calu3 (B) cells (aP＜0.05, bP＜0.01, vs Flag [1] group)

3UCK2促進(jìn)A549和Calu3細(xì)胞的遷移能力和Flag組比，F(xiàn)lag-UCK2組的A549細(xì)胞24 h遷移能力明顯增加(t=8.947，P=0.001，n=3；圖3A)。同樣，Calu3細(xì)胞系中，F(xiàn)lag-UCK2組24 h遷移能力亦明顯增加(t=20.102，P＜0.001，n=3；圖3B)。以上結(jié)果表明，UCK2對A549和Calu3細(xì)胞的遷移能力正向調(diào)控。

圖3 UCK2促進(jìn)A549(A)和Calu3(B)細(xì)胞的遷移能力[bP＜0.01, cP＜0.001, vs Flag (1)組]Fig.3 UCK2 promotes the migration of A549 (A) and Calu3 (B) cells (bP＜0.01, cP＜0.001, vs Flag [1] group)

4UCK2在LUAD中正向調(diào)控mTOR通路 為進(jìn)一步深入研究UCK2的分子調(diào)控機(jī)制，利用GSEA分析發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)的UCK2與LUAD良好預(yù)后相關(guān)(P＜0.001；圖4A)，高表達(dá)的UCK2與mTOR上調(diào)基因集呈正相關(guān)(P=0.002；圖4B)，低表達(dá)的UCK2與mTOR下調(diào)基因集呈正相關(guān)(P=0.004；圖4C)。這些結(jié)果提示在LUAD中UCK2與mTOR通路關(guān)系密切。

圖4 UCK2在LUAD中正向調(diào)控mTOR通路A：GSEA分析顯示UCK2的低表達(dá)與LUAD患者的良好預(yù)后相關(guān)；B、C：UCK2表達(dá)與LUAD數(shù)據(jù)集中的mTOR通路呈正相關(guān)Fig.4 UCK2 positively regulates mTOR pathway in human lung adenocarcinoma A: GSEA plot showed that low expression of UCK2 was associated with good prognosis in LUAD patients; B, C: UCK2 expression was positively correlated with mTOR signaling in the LUAD dataset

5UCK2促進(jìn)A549細(xì)胞中mTOR通路的激活為了研究UCK2與mTOR通路的關(guān)系，我們使用了mTOR通路特異性抑制劑—雷帕霉素來進(jìn)一步驗 證。Western blot實 驗 證 明，UCK2過 表 達(dá) 組(2)與EV + DMSO組(1)比較，mTOR通路中的關(guān)鍵蛋白p-PI3K(P＜0.001)、p-AKT(P＜0.001)、pmTOR(P＜0.001)上調(diào)。雷帕霉素組(3)降低了這些蛋白的表達(dá)(P＜0.001)，而UCK2 + 雷帕霉素組(4)顯示，UCK2對mTOR通路中關(guān)鍵蛋白的上調(diào)作用被逆轉(zhuǎn)(P＜0.001)。以上結(jié)果證明UCK2正調(diào)控LUAD中mTOR通路(圖5)。

圖5 UCK2促進(jìn)A549細(xì)胞中mTOR通路的激活[cP＜0.001, vs EV + DMSO (1)組]Fig.5 UCK2 activates the mTOR pathway in A549 cells (cP＜0.001, vs EV + DMSO [1] group)

6UCK2促進(jìn)A549細(xì)胞中糖攝取、乳酸和ATP Warburg效應(yīng)是腫瘤細(xì)胞的生長重要的現(xiàn)象，我們通過測定LUAD細(xì)胞的糖攝取、乳酸和ATP，以驗證UCK2對LUAD細(xì)胞的生長調(diào)控作用。結(jié)果顯示與EV + DMSO組(1)比較，過表達(dá)UCK2組(2)的糖攝取(P＜0.001)、乳酸(P＜0.001)和ATP(P=0.004)均上調(diào)，這與前期UCK2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的結(jié)果一致。雷帕霉素組(3)降低了糖攝取(P＜0.001)、乳酸(P＜0.001)和ATP(P= 0.003)水平，UCK2 + 雷帕霉素組(4)結(jié)果顯示，雷帕霉素逆轉(zhuǎn)了UCK2對糖攝取(P＜0.001)、乳酸(P＜0.001)和ATP(P＜0.001)的上調(diào)作用(圖6A ~ 圖6C)。

圖6 UCK2促進(jìn)A549細(xì)胞中糖攝取、乳酸和ATP [bP＜0.01, cP＜0.001, vs EV + DMSO (1)組]Fig.6 UCK2 activates the mTOR pathway in A549 cells (bP＜0.01, cP＜0.001, vs EV + DMSO [1] group)

討 論

LUAD在非小細(xì)胞肺癌中是最常見的組織學(xué)亞型，盡管外科手術(shù)、放化療、靶向治療及免疫治療近年來取得了一定進(jìn)展，但患者的存活率仍不高。新治療靶點的尋找和機(jī)制研究仍是LUAD的研究重點。

UCK在核苷類似物的磷酸化中發(fā)揮著重要作用。UCK2 催化尿苷和胞苷核苷酸的磷酸化。同時還催化某些細(xì)胞毒性核糖核苷類似物的磷酸化[11]。以往的研究表明UCK2在多種腫瘤中過度表達(dá)，其表達(dá)水平對于腫瘤發(fā)生發(fā)展具有一定的預(yù)測價值。然而，UCK2在LUAD中的作用尚不清楚。本研究中，我們通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，UCK2是LUAD癌和癌旁的差異基因，并且對LUAD患者的DFS和OS具有良好的預(yù)測特性。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)分期較晚患者的樣本中UCK2表達(dá)水平更高。我們在A549和Calu3兩種LUAD細(xì)胞中進(jìn)行了細(xì)胞增殖和劃痕實驗，結(jié)果證實過表達(dá)UCK2明顯增加LUAD細(xì)胞的增殖和遷移能力。這些結(jié)果提示UCK2在調(diào)節(jié)LUAD的生長和進(jìn)展中可能發(fā)揮著促癌作用。UCK2可能是LUAD的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點。

mTOR信號通路在腫瘤發(fā)展過程中起著重要作用[12-14]。該通路的激活與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。mTOR通路抑制劑不斷地被開發(fā)應(yīng)用于腫瘤的治療中[15-18]。而且，mTOR通路抑制劑對于改善免疫治療相關(guān)不良事件也發(fā)揮了重要作用[19-20]。在本研究中，我們首先利用TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA富集分析，發(fā)現(xiàn)UCK2與mTOR通路密切相關(guān)。在細(xì)胞水平，與空白組比較，過表達(dá)UCK2組p-PI3K、p-AKT、p-mTOR均顯著上調(diào)。表明過表達(dá)UCK2可能通過上調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號通路促進(jìn)A549細(xì)胞增殖和遷移。為了驗證這一結(jié)果，我們設(shè)置了mTOR通路的抑制劑—雷帕霉素進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果表明，雷帕霉素組降低了p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表達(dá)，而UCK2和雷帕霉素共同干預(yù)組結(jié)果表明，UCK2對mTOR通路中關(guān)鍵蛋白的上調(diào)作用被雷帕霉素逆轉(zhuǎn)。糖攝取、乳酸和ATP測定也得到了同樣的結(jié)果。再次證明過表達(dá)UCK2可能通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進(jìn)LUAD的生長和侵襲。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明過表達(dá)UCK2在LUAD生長和遷移中發(fā)揮重要作用，這可能是通過激活mTOR通路來實現(xiàn)的。UCK2在LUAD中的具體作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。