間充質(zhì)干細胞來源外泌體在皮膚損傷修復(fù)中的研究進展

劉紫微，時 權(quán)，王思拓，徐 娟

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 100853

皮膚是人體最大的器官，可作為第一道防線幫助我們抵御外界的刺激，同時具有一定的自我修復(fù)能力。皮膚受損面積過大時，難以正常愈合，特別是在患有糖尿病(慢性傷口或潰瘍)等疾病的情況下。加速皮膚組織再生、恢復(fù)受損皮膚的功能，是皮膚組織再生修復(fù)的關(guān)鍵。間充質(zhì)干細(mesenchymal stem cells，MSCs)代表了一個具有自我更新、免疫調(diào)節(jié)和多向分化能力的干細胞群體，分為多能干細胞和成體干細胞兩大類。包括人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord MSCs，hUCMSCs)、骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow MSCs，BMMSCs)、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞(endometrial MSCs，EnMSCs)、脂肪間充質(zhì)干細 胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)、牙 科間 充 質(zhì) 干 細 胞(dental-derived MSCs，DMSCs)、多能誘導(dǎo)干細胞衍生間的充質(zhì)干細胞(induced pluripotent stem cell-derived MSC，iMSCs)等。過去的20年中，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，干細胞療法被用于治療多種自身免疫性和炎癥性疾病，促進受損組織的新生[1]。然而，干細胞治療也有一些局限性，如有一定的倫理限制、存在突變致瘤和免疫排斥的可能性等。外泌體(exosomes，EXOs)是細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的一種亞型，直徑30 ~ 150 nm，可經(jīng)超速離心從干細胞中獲取，主要成分是磷脂雙分子層及其相關(guān)成分，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA等。干細胞來源的外泌體是細胞旁分泌作用的關(guān)鍵介質(zhì)，被供體細胞分泌出來后，可以被受體細胞所攝取，并將其內(nèi)容物傳遞至受體細胞中，從而發(fā)揮生物學(xué)作用。間充質(zhì)干細胞來源的外泌體(MSC-EXOs)治療皮膚創(chuàng)面避免了干細胞治療的免疫排斥、致瘤、栓塞等缺點，且具有穩(wěn)定性高、無需增殖、儲存方便、便于定量使用等優(yōu)勢，具有較高的安全性和較大的組織再生潛能[2]。迄今為止，越來越多的實驗室和臨床研究證明了人間充質(zhì)干細胞及其分泌的產(chǎn)物在治療各種皮膚疾病中有很大潛力，本文將對MSC-EXOs修復(fù)皮膚損傷的研究進展做一綜述。

1 外泌體修復(fù)皮膚損傷的機制

皮膚創(chuàng)面的愈合由一系列復(fù)雜而動態(tài)的組織恢復(fù)階段組成，常需要免疫細胞、造血細胞和皮膚常駐細胞的共同參與。皮膚創(chuàng)面愈合包括4個階段：止血階段、炎癥階段、增殖階段和重塑階段。這些階段的生物過程緊密協(xié)調(diào)，以確保皮膚能夠正常行使屏障功能，而外泌體在皮膚再生過程各個階段中均發(fā)揮了重要作用。

1.1止血階段 止血階段恢復(fù)皮膚屏障功能的主要生理機制是通過血塊中的血管收縮和血小板聚集減少失血。有報道顯示，hUCMSC-EXOs可在體外誘導(dǎo)血液凝固[3]。這一結(jié)果表明，MSC-EXOs可能在傷口愈合的止血階段具有潛在的功能，但仍需要進一步的研究來分析證明其具體作用。

1.2炎癥階段 炎癥階段是傷口愈合和組織再生的開始，這個過程可觸發(fā)免疫細胞的增殖以及炎癥細胞因子和趨化因子的分泌[4]，傷口部位的中性粒細胞和單核/巨噬細胞開始浸潤，從而完成殺死細菌和清除碎片等任務(wù)。適度的炎癥反應(yīng)有利于傷口的愈合，而過度、失調(diào)的炎癥反應(yīng)則會導(dǎo)致瘢痕形成，抑制創(chuàng)面再上皮化，降低傷口愈合的質(zhì)量。近年研究表明，MSC-EXOs可以通過多種途徑調(diào)節(jié)巨噬細胞，誘導(dǎo)其從促炎的M1型向抗炎的M2型轉(zhuǎn)變[5]，進而控制炎癥反應(yīng)，加速傷口愈合過程。He等[6]研究發(fā)現(xiàn)，BMMSC-EXOs產(chǎn)生的miR-223可以通過PBX/Knotted 1 homeobox 1靶向調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化。Liu等[7]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)褪黑素刺激的MSC-EXOs可以通過靶向激活PTEN/AKT通路，增加M2型與M1型巨噬細胞的比率，從而抑制炎癥，促進糖尿病創(chuàng)面愈合。Dalirfardouei等[8]證明人月經(jīng)血間充質(zhì)干細胞來源的外泌體也可通過誘導(dǎo)M1 ~ M2巨噬細胞極化減輕炎癥，從而促進傷口愈合。此外，皮膚傷口組織中存在的B淋巴細胞和T淋巴細胞在炎癥的發(fā)展過程中也具有一定的作用。實驗證明，MSCs-EXOs可以激活 B 淋巴細胞，促進其增殖和分化，也可以抑制T 淋巴細胞的增殖，且促使活化的 T 淋巴細胞向調(diào)節(jié)性 T 細胞轉(zhuǎn)換，從而發(fā)揮免疫抑制作用[9]，減輕免疫反應(yīng)對皮膚的損傷，促進傷口的愈合。

1.3增殖階段 在炎癥晚期，隨著M2型巨噬細胞和其他介質(zhì)的釋放，傷口愈合從炎癥階段過渡到增殖階段，這是正常傷口愈合過程中的關(guān)鍵步驟[10]。在這個階段中，白細胞釋放的細胞因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞和成纖維細胞向傷口中心遷移，形成新的血管和肉芽組織，而局部血液循環(huán)可以提供組織再生所需營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，是影響創(chuàng)面愈合的重要因素。有報道稱，MSC-EXOs可激活內(nèi)皮細胞的血管生成活性，如EnMSC-EXOs可增加血管生成標志物的表達，并促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的增殖、遷移和血管生成[11]。ADSC-EXOs可以分泌調(diào)節(jié)傷口愈合的關(guān)鍵生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子A和血小板衍生生長因子BB，進而促進血管的生成[12]；也可以通過傳遞miR-125a來抑制阻礙血管生成的DLL4的表達，誘導(dǎo)HUVECs的小血管形成[13]。Yang等[14]也同樣發(fā)現(xiàn)，hUCMSCEXOs可以增加CD31和Ki-67的表達，促進肉芽組織的再生，并上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達，促進糖尿病患者傷口的愈合。

另有研究表明，不同組織來源的MSC-EXOs能促進人真皮成纖維細胞(human dermal fibroblasts，HDFs)的遷移和增殖，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生促進皮膚愈合的相關(guān)蛋白。Hu等[15]發(fā)現(xiàn)，ADSC-EXOs可以被HDFs攝取并內(nèi)化，通過增加N-鈣黏蛋白、細胞周期蛋白1、增殖細胞核抗原、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的基因表達，從而影響HDFs的遷移、增殖和膠原合成。人胎兒真皮間充質(zhì)細胞來源的外泌體通過傳遞Jagged1蛋白激活Notch通路，并誘導(dǎo)Ⅰ型和Ⅲ型膠原、彈性蛋白和纖維連接蛋白的mRNA表達[16]。Zhang等[17]通過體外和體內(nèi)實驗證明，ADSCs-Exos可以促進HDFs的增殖和遷移，促進膠原或其他細胞生長因子的合成和分泌，且PI3K/AKT信號通路在其中起著至關(guān)重要的作用。

此外，還有報道顯示MSC-EXOs對角質(zhì)形成細胞有積極作用。如iMSC-EXOs可促進角質(zhì)形成細胞的增殖并增加其膠原分泌，從而加速皮膚傷口的愈合[18]；ADSC-EXOs可以激活A(yù)KT/HIF-1α軸，加速角質(zhì)形成細胞的遷移和增殖，促進傷口愈合[19]；hUCMSC-EXOs通過抑制凋亡誘導(dǎo)因子的核易位以及促進聚ADP核糖和聚ADP核糖聚合酶1的表達來抑制使用過氧化氫誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細胞凋亡[20]。

1.4重 塑 階 段 重 塑 階 段 是 皮 膚 損 傷 修 復(fù) 的 最后一個階段，其特征是細胞和血管逐漸減少，肉芽組織逐漸纖維化。一些細胞因子和蛋白質(zhì)是這一階段的核心元素，如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、TGF-β[21]。MMP及 其抑制劑之間的平衡一旦被打亂，就可能觸發(fā)增生性瘢痕或慢性傷口的形成。其次，真皮成纖維細胞的原位分化是肌成纖維細胞的主要來源，通常由TGF-β信號通路啟動。肌成纖維細胞的募集和持續(xù)分化，會導(dǎo)致結(jié)締組織過度沉積，肉芽組織逐漸纖維化，傷口開始收縮，最終也會導(dǎo)致皮膚瘢痕組織的形成[22]。瘢痕的形成不但影響外形美觀，還會造成功能障礙。

有研究表明，在傷口愈合早期，ADSCs-EXOs增加了Ⅰ型和Ⅲ型膠原的生成[15]，在傷口愈合的后期，EXOs又通過增加Ⅲ型膠原與Ⅰ型膠原的比率以及TGF-β3與TGF-β1的比率，阻止成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，并抑制肉芽組織形成，減少瘢痕形成[23]。Jiang等[24]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TSG-6修飾的BMMSC-EXOs通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和抑制膠原沉積的作用，減少傷口愈合過程中的瘢痕形成。并且證明TSG-6的敲除消除了BMMSC-EXOs對瘢痕形成的治療作用。Yang等[25]還發(fā)現(xiàn)，通過增強MMP-9表達和抑制TIMP2表達(PI3K/AKT途徑中的作用點)，ADSC-EXOs中miRNA-21的表達水平增高，從而促進了傷口愈合。此外，高miRNA-21表達水平可下調(diào)TGF-β1蛋白水平，減少傷口瘢痕的形成。除成纖維細胞外，角質(zhì)形成細胞也在傷口愈合、瘢痕形成和組織重塑中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Ma等[26]通過過氧化氫處理角質(zhì)形成細胞，建立了皮膚損傷模型，并提出ADSCs-EXOs通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進受損角質(zhì)形成細胞的遷移，以調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的重塑。hBMMSC-EXOs能有效促進HDFs和角質(zhì)形成細胞增殖，并可以降低TGF-β1的表達，增加TGF-β3的表達，通過抑制TGF-β/Smad信號通路發(fā)揮促進皮膚創(chuàng)傷愈合的作用，這可能是促進皮膚無疤痕傷口愈合的關(guān)鍵原因之一[27]。

2 外泌體的應(yīng)用方法

目前應(yīng)用外泌體促進皮膚損傷修復(fù)的方法主要是局部注射和靜脈注射。局部注射一般是將外泌體注射至創(chuàng)面的周圍，并不能讓外泌體直接、均勻地分布在創(chuàng)面上。靜脈注射則不能保證所有外泌體都參與皮膚修復(fù)，且外泌體在體內(nèi)很快會被清除，難以維持較高濃度狀態(tài)，需多次給藥，造成外泌體的浪費。除此之外，注射的方法還會對皮膚造成二次傷害，給治療帶來一定的困難[28]。近年來，為解決糖尿病等一些慢性傷口的修復(fù)和再生需要較長時間的問題，制備能夠負載外泌體的新型材料，以維持其在糖尿病傷口區(qū)域的生物活性，獲得廣大研究學(xué)者的關(guān)注。

常見的用于促進皮膚損傷修復(fù)藥物遞送的生物支架材料分為天然支架和合成支架。天然支架的材料成分包括透明質(zhì)酸、殼聚糖、膠原蛋白、海藻酸鹽等，合成支架材料成分包括聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸等[29]。而對于皮膚損傷應(yīng)用最多的支架形式為水凝膠支架，它可以使外泌體在皮膚局部應(yīng)用后濃度更加穩(wěn)定，以延遲外泌體的釋放并增強其傷口愈合能力[30]。水凝膠是一種穩(wěn)定的親水性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過物理、化學(xué)和生物酶法交聯(lián)而成，具有良好的生物相容性、可降解性和保水性等，已被證實是最友好、經(jīng)濟并容易獲得的材料，在臨床醫(yī)學(xué)中顯現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力[31]。水凝膠負載MSC-EXOs既可解決靜脈注射法造成的外泌體在體內(nèi)被快速清除的問題，又可以將含有外泌體的水凝膠直接放置于目標部位或其附近，能夠保證外泌體的作用劑量更加集中，同時發(fā)揮外泌體和水凝膠促進傷口修復(fù)的作用[32]。Nooshabadi 等[33]利用殼聚糖和甘油為主要原料，制備了甘油殼聚糖水凝膠，并負載了EnMSCEXOs，用于小鼠創(chuàng)傷模型的治療，發(fā)現(xiàn)水凝膠組對傷口愈合具有一定的促進作用，而水凝膠外泌體組的治療效果最好，呈現(xiàn)出最大程度的纖維化、上皮厚度和血管化。Shi等[34]利用殼聚糖/絲素蛋白水凝膠負載牙齦間充質(zhì)干細胞來源的外泌體，研究其對糖尿病大鼠皮膚缺損的影響。發(fā)現(xiàn)該外泌體水凝膠可通過促進細胞外基質(zhì)的再上皮化、沉積和重塑，促進血管生成和神經(jīng)元的生長等多種途徑，有效促進糖尿病大鼠皮膚傷口愈合。在另一項研究中，Hu等[35]使用基于擠壓的低溫3D打印技術(shù)，將脫細胞小腸黏膜下層(SIS)與介孔生物活性玻璃(MBG)和MSC-EXOs結(jié)合，形成3D支架敷料(SIS/MBG@EXOs)，延長了具有生物活性的外泌體在體內(nèi)的釋放時間。SIS/MBG@EXOs水凝膠支架在體外可增強HUVECs的增殖、遷移和血管生成，在體內(nèi)也能通過增強創(chuàng)面血流和誘導(dǎo)糖尿病創(chuàng)面血管生成來促進糖尿病創(chuàng)面愈合。所構(gòu)建的支架還能誘導(dǎo)肉芽組織的建立和膠原纖維的沉積，最終形成有功能的新血管。

3 結(jié)語

在過去的20年中，由于MSCs獨特的免疫調(diào)節(jié)屬性，其潛在的分泌促血管生成因子和促進內(nèi)皮細胞招募到創(chuàng)傷組織的能力，以及加速基質(zhì)重塑的作用，使基于MSCs治療皮膚損傷的方法得到了關(guān)注。然而，由于干細胞治療在再生醫(yī)學(xué)中的一些局限性，MSC-EXOs為再生醫(yī)學(xué)提供了新的思路。外泌體在病理和生理過程中可以發(fā)揮重要作用，并且克服了干細胞治療可能帶來的倫理問題，降低免疫排斥和致瘤風險，使治療更加安全有效。然而，MSC-EXOs在臨床中的應(yīng)用也受到一定限制，在細胞培養(yǎng)條件和程序、外泌體分離和儲存、最佳治療劑量和給藥計劃、可靠的藥效等方面缺乏普遍被接受的操作標準，并且對于外泌體最佳給藥途徑的研究也在繼續(xù)進行，新的方案不斷提出。目前對于外泌體修復(fù)皮膚缺損的研究大多還是在動物實驗?zāi)Ｐ蜕祥_展，因此如何將其正確應(yīng)用于臨床還需要更多、更全面的研究和評估。