黃秋葵中螺螨酯殘留檢測及膳食攝入評估

吳緒金，許海康，宋 鍵，馬婧瑋，安 莉，李 萌，汪 紅

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所 鄭州 450002； 2.商丘市實驗中學(xué) 河南商丘 476000）

黃秋葵（L）在我國河北、山東、江蘇、浙江、湖南、湖北、云南和廣東等省份廣泛種植。螺螨酯英文通用名為spirodiclofen，分子式是CHClO，化學(xué)名稱為3-（2，4-二氯苯基）-2-氧-1-氧螺[4.5]癸-3-烯-4-基-2，2-二甲基丁酸酯。螺螨酯是一種高效低毒的新型季酮酸殺螨劑，其作用機制是通過抑制螨蟲體內(nèi)脂肪合成，阻止能量代謝活動殺死螨蟲。螺螨酯主要用來防治的作物有草莓、柑橘、核果、梨果、葡萄、堅果等，主要防治對象是螨蟲，包括銹螨屬、葉螨屬、全爪螨屬、刺繡螨屬、短須螨屬等螨蟲。

國內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于螺螨酯的研究主要包括農(nóng)藥殘留風(fēng)險監(jiān)測、加工過程中農(nóng)藥殘留的變化、降解菌株的篩選、殘留消解試驗及檢測方法等。目前已相繼報道了螺螨酯在柚子和柚子茶中的風(fēng)險監(jiān)測，李子加工成話梅過程中農(nóng)藥殘留的變化。賈海飛等發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬菌株QD26-6 48 h 和120 h 對螺螨酯降解率分別為45.82%和71.72%。螺螨酯在柑橘中的半衰期為4.70 d、5.18～8.49 d、8.0～11.8 d，在蘋果中的半衰期為11～19 d，在土壤中半衰期為5.19～7.85 d 和1.4～4.1 d。目前，關(guān)于螺螨酯殘留檢測方法報道較少，已報道的檢測方法主要有煙草和土壤中螺螨酯殘留量的高效液相色譜二極管陣列檢測器檢測法。前處理分別為加速溶劑萃取，硅膠凈化；乙腈和水（∶=4∶1）混合振蕩提取，0.45 um 有機濾膜過濾。柑橘中螺螨酯經(jīng)乙腈提取，N-丙基乙二胺固相吸附劑（PSA）凈化，0.22 μm 有機濾膜過濾，超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測。柑橘、蘋果和土壤中螺螨酯前處理分別為混合提取劑（∶=4∶1）提取，F(xiàn)lorisil 小柱凈化；乙腈提取，氮吹濃縮定容；乙腈提取，弗羅里硅土凈化，氣相色譜電子捕獲檢測器檢測。9 種果品中螺螨酯殘留量的氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測法，前處理為乙腈渦旋提取，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和ODS-C凈化。綜上所述，國內(nèi)外關(guān)于螺螨酯的報道主要有消解半衰期和殘留檢測方法，但未見關(guān)于螺螨酯在黃秋葵中的殘留檢測、最終殘留試驗和膳食攝入評估的報道。本研究建立了螺螨酯在黃秋葵中的超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測法，對河南、湖南、山東、北京、吉林和廣東6 地的黃秋葵樣品進(jìn)行了檢測，并對黃秋葵中螺螨酯的膳食攝入量進(jìn)行評估，為螺螨酯在黃秋葵上的安全合理使用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品為天津市漢邦植物保護(hù)劑有限責(zé)任公司提供的24%螺螨酯懸浮劑；供試作物為黃秋葵，河南試驗品種為五福，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所提供；湖南試驗品種為南洋，由湖南文譜檢測技術(shù)研究有限公司提供；山東試驗品種為綠鹽，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供；北京試驗品種為清福，由北京天然至誠農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；吉林試驗品種為綠箭，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；廣東試驗品種為五福，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

試劑：乙腈和甲醇（色譜純，默克股份兩合公司），N-丙基乙二胺固相吸附劑（PSA）和石墨化碳黑吸附劑（GCB）（天津博納艾杰爾科技有限公司），甲酸（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司），氯化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），螺螨酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度為99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer）。

儀器：LC-30AD 高效液相色譜儀（日本島津儀器公司），LCMS-8050 質(zhì)譜儀（日本島津儀器公司），Shim-pack GISS 液相色譜柱（日本島津儀器公司，（2.1 mm×50 mm，1.9μm），SQP 系列電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，BS 2202 S 電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，Milli-Q Synthesis 超純水系統(tǒng)（Millipore 公司），KQ-5200 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），TARGINVX-Ⅲ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司），L-550 臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），R10 V.V.食品切碎攪拌機（法國Robot Coupe 公司）。

1.2 試驗設(shè)計

于2018 年7 月12 日至9 月5 日進(jìn)行田間試驗，設(shè)置河南省新鄉(xiāng)市平原新區(qū)王村、廣東省湛江市麻章區(qū)麻章鎮(zhèn)、湖南省長沙市古港鎮(zhèn)沔江村、山東省淄博市開發(fā)區(qū)閆高村、北京市順義區(qū)木林鎮(zhèn)榮各莊村、吉林省四平市雙遼市那木鄉(xiāng)建設(shè)村6 個試驗地點。施藥次數(shù)分別為2 次和3 次，施藥間隔為7 d，施藥劑量以有效成分計算分別為90 g a.i.·hm和135 g a.i.·hm，每個處理3 次重復(fù)。最后1 次施藥后1、3、5、7 d 完全隨機采樣，每次在處理小區(qū)和對照小區(qū)內(nèi)的黃秋葵植株分別隨機采集樣品2 kg以上。將采集的田間樣品去除果柄后加干冰粉碎，-20 ℃貯藏待測。樣品檢測在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所實驗室進(jìn)行，檢測時間為2018 年11－12 月。

1.3 檢測方法

1.3.1 提取及凈化 準(zhǔn)確稱取10.00 g 粉碎后的黃秋葵樣品于100 mL 離心管中，然后加入20 mL 乙腈和2.5 g 氯化鈉。將離心管放置于多管渦旋振蕩器中渦旋10 min 后，放入離心機中4 000 r·min離心5 min。分別稱取0.05 g PSA 和0.02 g GCB 于2 mL 離心管中，從離心后的100 mL 離心管中移取2 mL 上清液至該離心管，渦旋1 min 后放入離心機4 000 r·min離心5 min，0.22 μm 針孔濾膜過濾，LC/MS/MS 檢測。

1.3.2 儀器條件 柱溫40 ℃；流速0.3 mL·min；流動相為體積比2∶8 的0.1%甲酸水溶液-乙腈；電離方式為ESI；CID氣為270kPa；霧化氣流量為3.0L·min；加熱氣流量為10 L·min；接口溫度為300 ℃；DL溫度為250 ℃；加熱塊溫度為400 ℃；檢測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM），定性離子對為411.1/71.2/和411.1/313.05/，定量離子對為411.1/71.2/，碰撞電壓為16 eV 和11 eV。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及添加回收率的獲得 將純度為99.0%螺螨酯標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈稀釋制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì) 量濃度分別為0.005、0.010、0.020、0.050、0.100 mg·L，儀器檢測條件見1.3.2。將黃秋葵空白對照樣品中加入不同濃度的螺螨酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻，放置2 h，樣品提取凈化見1.3.1。

1.4 膳食攝入評估

1.4.1 長期膳食攝入風(fēng)險評估 依據(jù)衛(wèi)生部2002

年發(fā)布的《中國不同人群消費膳食分組食譜》中的膳食結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和已制定的螺螨酯最大殘留限量（maximum residue limit，MRL），結(jié)合本試驗螺螨酯殘留化學(xué)評估推薦的規(guī)范殘留試驗中值，計算螺螨酯國家估算每日攝入量（national estimated daily intake，NEDI），計算公式如下。

式中：NEDI 指國家估算每日攝入量，單位mg·kgbw；STMR為第類初級食用農(nóng)產(chǎn)品的規(guī)范試驗殘留中值，單位mg·kg；STMR-P為第類加工食用農(nóng)產(chǎn)品的規(guī)范試驗殘留中值，單位mg·kg；F為第類食用農(nóng)產(chǎn)品的消費量，單位kg·d；bw 為人群平均體質(zhì)量，單位kg；ADI 為每日允許攝入量，單位mg·kgbw；ADI%為國家估算每日攝入量占每日允許攝入量的百分率。

1.4.2 急性膳食攝入風(fēng)險評估 黃秋葵單個質(zhì)量低于25 g，國家估算短期攝入量（national estimated short term intake，NESTI）計算采用公式3。

式中：NESTI 指國家估算短期攝入量單位mg·kgbw；LP 為可涵蓋97.5%的食用者的每天消耗食品的量，單位kg·d；HR 為可食部分的混合樣本中的最高殘留量，單位mg·kg；HR-P 為加工農(nóng)產(chǎn)品的最高殘留量，單位mg·kg；bw 同公式1；ARfD 為急性參考劑量，單位mg·kgbw；ARfD%為占急性參考劑量的百分比。

1.5 數(shù)據(jù)計算

數(shù)據(jù)計算采用Microsoft Excel 2010，采用IBM SPSS Statistics 23 進(jìn)行鄧肯氏單因素方差分析。

式中：為待測樣品中農(nóng)藥殘留量，單位μg·kg；為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位μg·mL；為待測樣品峰面積；為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積；為標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣體積，單位μL；為待測樣品定容的體積，單位mL；為待測樣品的進(jìn)樣體積，單位μL；為待測樣品的質(zhì)量，單位g。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線=29 716 569.85+9 035.92，=1.00，濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)。當(dāng)樣品濃度（，后同）>0.2 mg·kg時，對樣品進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，以滿足標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍。

2.1.2 添加回收率 黃秋葵中螺螨酯的最低檢測濃度為0.01 mg·kg。當(dāng)螺螨酯在黃秋葵中添加水平為0.01、0.10、2.00 mg·kg時，平均回收率為78.93%～82.41%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.97%～10.94%，結(jié)果見表1。

表1 黃秋葵中螺螨酯的添加回收率試驗結(jié)果 %

2.2 螺螨酯最終殘留量

2018 年6 地不同施藥劑量、施藥間隔和采收間隔期，黃秋葵中螺螨酯的最終殘留量檢測結(jié)果見表2。采收間隔期1 d 和3 d 時，殘留量最高的試驗地點均為廣東，殘留量分別為0.58 mg · kg和0.45 mg·kg；采收間隔期為5 d 和7 d 時，殘留量最高的試驗地點均為吉林，殘留量分別為0.11 mg·kg和0.06 mg·kg。

表2 黃秋葵中螺螨酯最終殘留量測定結(jié)果 mg·kg-1

從表3 可以看出，兩個施藥劑量，施藥2 次和3次時，相同采收間隔期殘留量之間沒有顯著差異。當(dāng)施藥劑量為90 g a.i.·hm、施藥2 次時，不同采收間隔期之間殘留量沒有顯著差異；施藥3 次時，采收間隔期1 d 的殘留量高于7 d，存在極顯著差異。當(dāng)施藥劑量為135 g a.i.·hm、施藥2 次時，采收間隔期1 d 的殘留量高于7 d，存在顯著差異；施藥3次時，采收間隔期1 d 的殘留量高于5 d 和7 d，存在極顯著差異。

表3 黃秋葵中螺螨酯的殘留量差異分析

2.3 膳食攝入評估

長期膳食攝入風(fēng)險評估結(jié)果見表4，螺螨酯普通人群的國家估算每日攝入量是0.003 1 mg，占日允許攝入量的0.5%。黃秋葵可涵蓋97.5%食用者每天消耗食品量（LP）為0.082 3 kg·d，可食部分的混合樣本中的最高殘留量（highest residue，HR）為0.95 mg·kg，按照急性膳食攝入風(fēng)險評估公式進(jìn)行計算，螺螨酯的國家估算短期攝入量（IESTI）為0.001 241 mg·kgbw，查詢到急性參考劑量（ARfD）為不需要，不必計算占急性參考劑量的百分比（ARfD%）。

表4 螺螨酯風(fēng)險評估

3 討論與結(jié)論

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》規(guī)定，當(dāng)添加水平為0.01 mg·kg時，回收率范圍為60%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤30%；添加水平為0.10 mg·kg時，回收率范圍為70%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤20%；添加水平>1.00 mg·kg時，回收率范圍為70%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤10%。筆者試驗結(jié)果表明，黃秋葵中螺螨酯3 個添加水平分別為0.01、0.10、2.00 mg·kg，添加回收率為78.93%～82.41%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.97%～10.94%，定量限為0.01 mg·kg，檢測結(jié)果的精密度、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度均符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》的規(guī)定。

由最終殘留量試驗結(jié)果可以看出，當(dāng)施藥劑量和施藥次數(shù)相同，螺螨酯殘留量與采收間隔期負(fù)相關(guān)，原因是隨著采收時間的延長，部分螺螨酯已消解，同時黃秋葵的生長對螺螨酯消解有一定的稀釋作用，與王思威等報道的采收間隔期越短殘留量越大一致。當(dāng)采收間隔期和施藥次數(shù)相同時，90 g a.i.·hm和135 g a.i.·hm的2 個處理之間螺螨酯殘留量不存在1.5 倍關(guān)系，施藥劑量加倍最終殘留量沒有增加相應(yīng)倍數(shù)，說明施藥劑量和最終殘留量不存在倍數(shù)關(guān)系。當(dāng)施藥劑量和采收間隔期相同時，螺螨酯殘留量在2 次施藥和3 次施藥2 個處理之間沒有差異，說明第一次施藥對最終殘留量的貢獻(xiàn)不大，原因是第一次施藥時間較早，距采收時間較長，當(dāng)樣品采收時第一次施用的螺螨酯大部分已經(jīng)消解，這與付巖等報道的水稻中三唑磷原始沉積量與施藥次數(shù)呈正相關(guān)的結(jié)果不一致，原因可能是農(nóng)藥性質(zhì)不同或作物種類不同。當(dāng)施藥劑量與次數(shù)及采收間隔期相同時，河南、湖南、山東、北京、吉林和廣東之間的螺螨酯殘留量存在一定差異，說明氣候條件是影響螺螨酯消解的原因之一。采收間隔期1 d 和3 d 時，廣東殘留量顯著高于其他5 地，主要原因是廣東施藥時黃秋葵植株較小、葉子少、黃秋葵著藥較多，說明施藥時的植株生長階段會影響螺螨酯的最終殘留量。與秦曙等報道的相同施藥劑量下殘留量在不同品種蘋果上存在顯著性差異，殘留量高低與重復(fù)間小直徑樣品所占比例呈正相關(guān)的報道相似。筆者僅開展了在黃秋葵中螺螨酯殘留量差異的研究，其他農(nóng)藥是否也存在類似差異需進(jìn)一步研究。

我國和國際食品法典委員會（codex alimentarius commission，CAC）均未規(guī)定螺螨酯在黃秋葵中的MRL 值，無法通過MRL 值判定黃秋葵樣品是否合格，需對黃秋葵樣品中的螺螨酯進(jìn)行長期膳食攝入風(fēng)險評估和急性膳食攝入風(fēng)險評估。ADI%≤100%時，表示急性風(fēng)險可以接受，ADI%越小，風(fēng)險越小；當(dāng)ADI%>100%時，表示有不可接受的急性風(fēng)險，ADI%越大，風(fēng)險越大。參考原衛(wèi)生部2002 年發(fā)布的中國不同人群消費膳食分組食譜，我國居民的干豆類及其制品、淺色蔬菜、水果和植物油的每日食物攝入量分別為0.016 0、0.183 7、0.045 7、0.032 7 kg。我國已制定螺螨酯在棉籽（植物油）中MRL 值為0.02 mg·kg，在綠豆（干豆類及其制品）和火龍果（水果）上殘留中值均為0.01 mg·kg。我國居民的平均體質(zhì)量為63 kg，螺螨酯在黃秋葵中 的 殘 留 中 值 是 0.01 mg·kg，ADI 值 為0.01 mg·kgbw。普通人群的國家估算每日螺螨酯攝入量是0.003 1 mg，占日允許攝入量的0.5%左右，ADI%≤100%，認(rèn)為螺螨酯在黃秋葵中的殘留對一般人群健康的影響是在一個可接受的風(fēng)險水平，與吳緒金等報道的螺螨酯在火龍果中的膳食攝入風(fēng)險評估結(jié)果一致。黃秋葵急性參考劑量（ARfD）為不需要，不必計算占急性參考劑量的百分比（ARfD%），說明螺螨酯在黃秋葵上使用后不存在急性膳食風(fēng)險。

黃秋葵中螺螨酯最終殘留量與采收間隔期、氣候條件和植株生長階段相關(guān)。以黃秋葵中螺螨酯最終殘留量，及其長期膳食攝入風(fēng)險評估和急性膳食攝入風(fēng)險評估結(jié)果為依據(jù)，推薦螺螨酯在防治黃秋葵蟲害時，用藥量90 g a.i.·hm和135 g a.i.·hm，施藥次數(shù)為2 次和3 次，安全間隔期為7 d。