益氣祛痰解毒方通過調(diào)控FRMD6 抑制非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展的作用機(jī)制研究

姚 成 陳 冬 陳濱海 高文倉

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占85%且中晚期患者生存率極低[1]。中藥具有豐富的生物活性，通過多途徑和多靶點(diǎn)在腫瘤治療中發(fā)揮作用[2]。益氣祛痰解毒方以澤漆湯為主，具有益氣祛痰、解毒散結(jié)的功效，臨床上用于肺癌治療且具有抗表皮生長因子受體（EGFR）-酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）耐藥性[3]，但是其在NSCLC 中的作用機(jī)制尚不清楚。本文旨在研究益氣祛痰解毒方與FERM 結(jié)構(gòu)域蛋白6（FRMD6）在NSCLC 中的分子調(diào)控機(jī)制，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株和試劑 PC9 細(xì)胞株購自美國ATCC（批號CRL-5908）；中藥材由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院中藥房提供；RPMI1640 培養(yǎng)基（批號A4192301）、胎牛血清（批號12664025）、青霉素和鏈霉素（批號15070063）等購于美國Gibco 公司；空白對照載體（shNC）和FRMD6 干擾載體（shFRMD6）及慢病毒包裝質(zhì)粒購自上海吉瑪基因公司；CCK-8 試劑盒（批號C0037）、Trizol 試劑盒（批號R0016）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號D7168S）、Annexin V-FITC/PI 檢測試劑盒（批號C1062M）和BCA 試劑盒（批號P0012S）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FRMD6（批號PA5-51553）和肝細(xì)胞生長因子受體基因（c-Met）（批號37-0100）購自美國ThermoFisher 公司；磷酸化PI3K（p-PI3K）（批號17366）、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）（批號4249）、磷酸化Akt（p-Akt）（批號13038）、蛋白激酶B（Akt）（批號9272）、β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）（批號4970）和IgG/HRP（批號7074）購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 主要儀器 酶標(biāo)儀（型號：680）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（型號：9600）和電泳儀（型號：1658001）購自美國Bio-Rad 公司；流式細(xì)胞儀（型號：FACSCalibur）購自美國BD 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 益氣祛痰解毒方制備 益氣祛痰解毒方：澤漆、石見穿各30 g，前胡10 g，人參、桂枝、黃芩、半夏各9 g，紅豆杉8 g，蜂房15 g，生姜5 g。制備益氣祛痰解毒方提取物干粉并配置成1 mg/mL 的藥液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、慢病毒轉(zhuǎn)染及分組 PC9 細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取指數(shù)生長期的PC9 細(xì)胞，空白對照載體和shFRMD6 的RNA 干擾慢病毒液感染PC9 細(xì)胞，構(gòu)建空白對照載體組PC9 細(xì)胞株（shNC）和FRMD6 敲低PC9 細(xì)胞株（shFRMD6）。分組：對照組、益氣祛痰解毒方組、shNC 組、shFRMD6 組、益氣祛痰解毒方+shNC 組、益氣祛痰解毒方+shFRMD6 組。

2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 參考CCK-8 試劑盒說明書檢測細(xì)胞增殖，細(xì)胞（1×103個(gè)/孔）接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)，24 h 后加入CCK-8 溶液，再培養(yǎng)4 h 后利用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處各組OD 值。細(xì)胞活性（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD 值）×100%。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測 根據(jù)Trizol 試劑盒說明提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR 儀檢測，反應(yīng)條件為93 ℃10 min、95 ℃30 s、60 ℃1 min、72 ℃1 min，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算FRMD6 相對表達(dá)水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：FRMD6 正向：5'-CTTCCCAACGATGAATCTCTGAA-3'，反向：5'-GGCAGTCCTTTAGCCTGAGC-3'；GAPDH 正向：5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'，反向：5'-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGT-3'。

2.5 Western blot 檢測 PC9 細(xì)胞于6 孔板培養(yǎng)24 h，經(jīng)沖洗、RIPA 裂解后提取總蛋白質(zhì)，利用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取20 μg 于緩沖液中，經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移至PDVF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h 后，按1∶1000 加入一抗（FRMD6、c-Met、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和β-actin）4 ℃孵育過夜。后加入二抗（IgG/HRP，1∶2000）室溫反應(yīng)2 h 并獲取顯影蛋白條帶。

2.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 制備濃度為2×105/mL 的細(xì)胞懸液，Transwell 小室的上層膜表面均勻鋪上基質(zhì)膠，取200 μL/孔的PC9 細(xì)胞懸液加入上層，向下層中加入600 μL/孔的完全培養(yǎng)基（含20%血清），于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用0.1%結(jié)晶紫染液對下層細(xì)胞進(jìn)行染色，置于顯微鏡下觀察拍照收集圖像。

2.7 細(xì)胞凋亡檢測 根據(jù)Annexin V-FITC/PI 檢測試劑盒說明檢測各組細(xì)胞凋亡，將PC9 細(xì)胞加入5 μL Annexin V-/FITC 后避光反應(yīng)20 min，然后加入5 μL PI 避光反應(yīng)20 min，利用流式細(xì)胞儀檢測PC9 細(xì)胞凋亡情況。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 8.0 軟件處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間均數(shù)比較，采用t 檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較，采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 益氣祛痰解毒方上調(diào)FRMD6 表達(dá)水平 研究表明，F(xiàn)RMD6 有抑制腫瘤的作用[4]。CCK-8 檢測發(fā)現(xiàn)，益氣祛痰解毒方顯著抑制PC9 細(xì)胞增殖（P＜0.05）（見表1），進(jìn)一步qRT-PCR 檢測顯示，與對照組比較，益氣祛痰解毒方組的FRMD6 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）（見表2）。同時(shí)，Western blot 檢測結(jié)果與qRT-PCR 結(jié)果一致，見圖1。

表1 PC9 細(xì)胞增殖率（%，）

表1 PC9 細(xì)胞增殖率（%，）

注：對照組為正常培養(yǎng)的PC9 細(xì)胞；益氣祛痰解毒方組為用益氣祛痰解毒方（1 mg/mL）處理的PC9 細(xì)胞；與對照組比較，aP＜0.05

表2 PC9 細(xì)胞FRMD6 表達(dá)水平（）

表2 PC9 細(xì)胞FRMD6 表達(dá)水平（）

注：對照組為正常培養(yǎng)的PC9 細(xì)胞；益氣祛痰解毒方組為用益氣祛痰解毒方（1 mg/mL）處理的PC9 細(xì)胞；FRMD6 為FERM 結(jié)構(gòu)域蛋白6；與對照組比較，aP＜0.01

圖1 Western blot 檢測PC9 細(xì)胞FRMD6 蛋白表達(dá)

3.2 益氣祛痰解毒方通過上調(diào)FRMD6 抑制PC9 細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡 FRMD6 參與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控[5]。本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒感染構(gòu)建FRMD6敲低PC9 細(xì)胞株，qRT-PCR 顯示，與對照組比較，shFRMD6 組FRMD6 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（見表3）。同時(shí)，Western blot 檢測結(jié)果一致，見圖2A。

表3 PC9 細(xì)胞FRMD6 表達(dá)水平（）

表3 PC9 細(xì)胞FRMD6 表達(dá)水平（）

注：對照組為正常培養(yǎng)的PC9 細(xì)胞；shNC 組為轉(zhuǎn)染空白對照載體的PC9 細(xì)胞；shFRMD6 組為轉(zhuǎn)染FRMD6 敲低質(zhì)粒的PC9 細(xì)胞株；FRMD6 為FERM 結(jié)構(gòu)域蛋白6；與對照組比較，aP＜0.05

CCK-8 檢測發(fā)現(xiàn)，與shNC 組比較，益氣祛痰解毒方+shNC 組PC9 細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05），而shFRMD6 組PC9 細(xì)胞增殖率升高（P＜0.01）。此外，與益氣祛痰解毒方+shNC 組比較，益氣祛痰解毒方+shFRMD6 組PC9 細(xì)胞增殖率顯著上升（P＜0.01）（見表4）。Annexin V-FITC/PI 顯示，與shNC 組比較，益氣祛痰解毒方顯著抑制PC9 細(xì)胞凋亡，并且敲低FRMD6 會(huì)顯著減弱益氣祛痰解毒方對PC9 細(xì)胞凋亡的作用，見圖2B。

表4 各組PC9 細(xì)胞增殖率比較（%，）

表4 各組PC9 細(xì)胞增殖率比較（%，）

注：shNC 組為轉(zhuǎn)染空白對照載體的PC9 細(xì)胞；shFRMD6 組為轉(zhuǎn)染FRMD6 敲低的PC9 細(xì)胞株；益氣祛痰解毒方+shNC 組為用益氣祛痰解毒方（1 mg/mL）處理的轉(zhuǎn)染空白對照載體的PC9 細(xì)胞；益氣祛痰解毒方+shFRMD6 組為用益氣祛痰解毒方（1 mg/mL）處理的轉(zhuǎn)染FRMD6 敲低質(zhì)粒的PC9 細(xì)胞株；FRMD6 為FERM 結(jié)構(gòu)域蛋白6；與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與益氣祛痰解毒方+shNC 組比較，cP＜0.01

3.3 益氣祛痰解毒方抑制PC9 細(xì)胞侵襲 Transwell顯示，與shNC 組相比，益氣祛痰解毒方+shNC 組顯著抑制PC9 細(xì)胞侵襲，而shFRMD6 組則促進(jìn)PC9細(xì)胞侵襲。此外，與益氣祛痰解毒方+shNC 組比較，益氣祛痰解毒方+shFRMD6 組PC9 細(xì)胞侵襲增強(qiáng)，見圖2C。

圖2 Western blot 檢測PC9 細(xì)胞FRMD6 蛋白表達(dá)（A）；各組PC9 細(xì)胞凋亡（B）和侵襲（C）比較

3.4 益氣祛痰解毒方通過調(diào)控FRMD6 表達(dá)來抑制c-Met/PI3K/Akt 通路 c-Met/PI3K/Akt 通路與NSCLC細(xì)胞功能調(diào)控密切相關(guān)[6]。Western blot 檢測顯示，與shNC 組比較，益氣祛痰解毒方+shNC 組c-Met、p-PI3K 和p-Akt 表達(dá)顯著下調(diào)；而shFRMD6 組上調(diào)c-Met、p-PI3K 和p-Akt 表達(dá)，這表明下調(diào)FRMD6表達(dá)能夠激活c-Met/PI3K/Akt 通路。與益氣祛痰解毒方+shNC 組比較，益氣祛痰解毒方+shFRMD6 組c-Met、p-PI3K 和p-Akt 表達(dá)顯著上調(diào)，表明敲低FRMD6 會(huì)影響益氣祛痰解毒方對c-Met/PI3K/Akt通路的抑制作用，見圖3。

圖3 c-Met/PI3K/Akt 通路的蛋白表達(dá)

4 討論

NSCLC 是臨床上常見的惡性腫瘤[7]。中藥已廣泛用于腫瘤的治療且在預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥中表現(xiàn)出積極作用[8]。研究表明，長期服用吉非替尼會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性，不利于NSCLC 患者的治療[9]。NSCLC 患者存在c-Met 過度激活進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性發(fā)展的情況，同時(shí)c-Met 通路的異常激活是NSCLC 耐藥的機(jī)制之一[10]。已有研究表明，益氣祛痰解毒方可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR 通路來抑制NSCLC 發(fā)展[11]。

研究表明，中藥與癌癥的信號通路和分子靶點(diǎn)具有密切關(guān)系[8]。FRMD6 為一種新型腫瘤抑制因子，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的上游通路調(diào)控蛋白，調(diào)控FRMD6 可抑制肝細(xì)胞癌和前列腺癌等癌癥的發(fā)展[4]。本文研究發(fā)現(xiàn)，益氣祛痰解毒方能夠上調(diào)FRMD6 的表達(dá)，而敲低FRMD6 會(huì)影響益氣祛痰解毒方對PC9細(xì)胞的抑制效果。此外，研究發(fā)現(xiàn)推動(dòng)NSCLC 發(fā)展的部分原因與c-Met 擴(kuò)增有關(guān)，c-Met 通過激活下游信號通路促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[12]。FRMD6 可通過下調(diào)c-Met 蛋白表達(dá)來癌細(xì)胞發(fā)展[5]。本研究結(jié)果表明，益氣祛痰解毒方通過調(diào)控FRMD6 表達(dá)從而抑制c-Met/PI3K/Akt 通路。

綜上所述，益氣祛痰解毒方在抑制NSCLC 發(fā)展方面作用顯著。同時(shí)，益氣祛痰解毒方能夠抑制NSCLC 的PC9 細(xì)胞增殖、侵襲和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其分子機(jī)制是調(diào)控FRMD6 表達(dá)進(jìn)而抑制c-Met/PI3K/Akt 通路。